Summary
3D 조직 문화의 시간 저속 영상은 대뇌 피질에서 fractionated 단백질 추출에 대한 반응으로 ganglionic 예하에서 발생하는 각각의 세포의 철새 행동을 공부하고 있습니다.
Abstract
세포의 마이 그 레이션은 척추 중추 신경계의 발달과 성숙 (헤튼, 99)에 연결 일반적인 과정이다. 흥분성의 억제와 : 대뇌 피질은 두 가지 기본 유형의 연결로 구성되어 있습니다. 이러한 세포는 뚜렷한 지역에서 발생하고 다른 노선 (Pearlman 외., 98)을 따라 피질로 마이 그 레이션. 억제 interneurons 대부분은 ganglionic eminences (.; 쑤 외, '04. Gelman 외, '09)의 여러 지역에서 tangentially subcortical 소스로부터 마이 그 레이션. (; 헤튼, '90 년, Rakic, '90 년 카비 & Rakic, 78) 그들의 운동은 대뇌 피질에 적절한 cytoarchitecture 및 연결의 설립 수 있도록, 환경 신호에 의해 부과된 정확한 spatiotemporal 컨트롤이 필요합니다. 체외에서 신생아 기가 실려에 ganglionic eminences (GE)의 proliferative 영역에서 생성된 세포의 철새 동작을 연구하기 위해 우리는 BD Matrigel 매트릭스의 3 차원 문화 배치를 사용했습니다. 문화 설치 두 GE의 explants 및 대뇌 피질에서 추출하고 explants (.; 리들 외, 97. 외를 Hasling, '03) 사이에 위치 형광 라텍스 Retrobeads IX에 adsorbed 테스트 단백질의 소스로 구성되어. 문화로부터 2-3 일 후에, 세포는 요골 방향으로 조직을 떠날 성향을 보여주는 explant의 가장자리에 나타나는 시작합니다. 라이브 영상은 세포를 라벨링 또는 마킹의 필요성없이 철새 패턴의 관찰을 허용했다. isochronic 페렛 피질에서 얻은 추출물 단백질의 분수에 노출되면, GE 세포는 각 세포의 이동 정량 분석 운동에 의해 판단으로 다른 동작을 표시합니다.
Protocol
1. 시약 준비
- 해동은 실험 (활성 온난화에 의해 처리 속도를하지 않음)하기 전에 충분한 시간을두고, 젖은 얼음에 Matrigel을 냉동. Matrigel가 밀접하게 세포의 마이 그 레이션에 도움이되는 세포외 기질과 유사한 3D 환경을 구축하는 데 사용됩니다. 이것은 기판과 기계 모두 표시할 수와 세포를 제공합니다. Matrigel은 -20 ° C.에 냉동 저장됩니다 사용하기 전에, 그것이 점차적으로 0-4의 온도까지 가지고 있어야 ° C, 즉이 젖었 얼음이나 냉장고에 해동. Matrigel은 irreversibly 인큐베이션의 온도 (37 ° C)에서 젤 형태로 설정합니다. 따라서 그것은 따뜻한 물에 컨테이너를 immersing하여 해동 속도를하지 않는 것이 좋습니다.
- 단백질 분수는 출생 후의 일 0 (P0) 페렛의 대뇌 피질에서 총 단백질 추출물의 isoelectric 초점 (IEF)에 의해 준비가되어 있습니다. 분리 후, 분수가 조직에 독성 수도 초점 버퍼 성분에서 추출한 청소 20mM 트리스 - HCL pH7.2에 대한 하룻밤 dialyzed 있습니다.
- 대뇌 피질에서 추출된 단백질 전달 시스템입니다. 단백질은 다음 천천히 형광 기능 microspheres의 영상 처리에 도움의 사이트에서도 최소한 spillovers 쉽게 검출을 허용 것을 발견 environment.We에 단백질을 출시 형광 라텍스 구슬에 adsorbed 아르 형광 현미경으로 관찰 구슬 예금.
- 단백질 용액 100 - 200μl에 형광 구슬의 10μl를 추가
- 흔드는에서 RT에 어둠 속에서 30 분 대한 부화
- 최대 속도로 1 시간을위한 벤치의 원심 분리기에서 비즈를 스핀 다운
- 뜨는 제거
- 신선한 매체의 10μl를 사용하여 소용돌이에 다시 중지
- 중지 Matrigel의 30μl를 추가, 잘 믹스하고 얼음에 놓으십시오.
- 버퍼와 미디어
- 인공 뇌척수를 (; NaCl 124mM, NaHCO 3 26mM, 아니 2 PO 4 1.2mM, 3.2mM KCl, MgSO 4 1.2mM, CaCl 2 2.4mM, 10mM 포도당 aCSF) 준비하고 여과 - 소독. 미리 aCSF을 슬러쉬 - 동결, 그래서 그것이 조직 해부의 시간에 준비가되지.하려면, -80 ° C의 냉동고에 살균 aCSF 가득한 플라스틱 플라스크를 놓으십시오. 그래서 얼음 층 벽 안쪽에 빌드 때, 그것을 휴식하고 유체와 혼합, 자주마다 냉동 모니터링합니다. 술병은 대부분 얼음 윤활유를 포함 때까지 반복합니다. 버퍼뿐만 아니라 조직의 생존을 지원하는이 방법을 준비하지만, 낮은 온도가 더 이상 인정할 것이다 게다가, 청키 얼음 조각보다는 조직에 기계적으로 덜 유해합니다.
- N - 2, B - 27 보충은 제조 업체의 제안뿐만 아니라 1mg/100ml gentamycin, 2 MM L - 글루타민, 및 0.6 % 포도당에 따라 추가되었습니다.들과 Neurobasal 매체를 준비 0.22μm 세포막을 통해 여과하여 소독. 37 보온 ° C를 사용까지.
- 문화 플레이트
- 문화 학년 플라스틱 여섯 잘 플레이트는 20μl 피펫 팁을 사용하여 감기 Matrigel 소량 (2μl에 대한)를 중심으로 각 우물을 dotting, 각 드롭 autoclaved 라운드 18mm 유리 coverslip을 배치 준비가되어 있습니다. 나도 접시이나 coverslips 달리 문화가 대접 필요가 없습니다.
2. 조직 준비
- 뇌 조직을 구하기
- 깊이 Euthasol과 동물을 anesthetizing 후, 머리를 제거하고 얼음처럼 차가운 aCSF에 배치
- 메스로 반구를 분리하고 얼음처럼 차가운 aCSF을 포함하는 작은 그릇에 조각을 수집, 선택의 장치를 사용하여 500μm에서 coronally 슬라이스
- 만들기 explants (해부 현미경을 사용)
- GE를 통해 내면 추가 단계를 방해할 수 있습니다 ganglionic eminences (GE)과 피질의 트림 지역을 포함하는 조각을 식별
- GE의 심실 표면에 가까운 지역에 구멍 해리스 유니 코어를 눌러 주로 심실 영역을 포함하는 핵심을 접어야하고 얼음처럼 차가운 매체 (Fig.1)에 플런저로 추방. 0.5의 서너 explants가 mm 직경은 단일 P0 페렛 뇌 슬라이스에 GE에서 할 수 있습니다. 설치류와 기가 실려 모두에서, 중간과 측면 릿지이 나이에 융합되는 유의하시기 바랍니다. 코어 통에 숙박이나 음식의 플라스틱 바닥에 붙어있다면, 차가운 Neurobasal 매체를 포함하는 그릇에 피펫과 피펫 팁 및 전달 aCSF를 squirting하여 동원. 서부 유럽 표준시 얼음 접시 보관하십시오.
- explants가 완전히 잠겨와 거품을 피하게 할 간병, 별도의 접시에 배치 얼음처럼 차가운 Matrigel의 큰 드롭 (0.25 - 0.5ml 정도)로 매체에서 explants의 배치를 전송합니다. 서부 유럽 표준시 얼음 접시 보관하십시오. 배치의 크기는 워크플로우 하류의 속도에 따라 달라집니다.
3. 문화 설치 (해부 현미경을 사용)
- 항상 경화를 방지하기 위해 Matrigel 얼음에 Matrigel 함유 믹스를 유지.
- 리믹스 비드 정지 장소 이전에 잘 20μl 피펫 팁을 사용하여 문화 접시에 놓인 유리 coverslip의 중심에 얼음처럼 차가운 Matrigel에 비드 정지 1 - 2μl 이하. 조금을 설정하자 건조하지 마십시오.
- 20μl 피펫 팁을 사용하면 Matrigel 드롭에서 2 explants를 선택하고 반대편에 대칭 (떨어진 보증금의 가장자리에서 1mm 이상) 비드 보증금을 원하는 주변에서 그들을 놓으십시오. 는 상온에서 5 분 이상 더 이상을 설정하자. 단계의 오른쪽시기가 B와 C가 중요합니다. 시간이 너무 짧은 경우에는 그것은 그들이 Matrigel의 최종 층으로 덮여있을 때 이동 문화 설치의 불완전 겔화 및 부품으로 이어질 것이며 시간이 너무 긴 경우 그것은의 젤과 창조 이상의 건조가 발생할 수 있습니다 세포의 자유로운 움직임을 방해 물리적인 장벽.
- explants (Fig.2) 이상을 확대, Matrigel의 30μl 약 평면 레이어로 비즈와 explant 표지. 약 15 분 동안은 인큐베이터에서 설정하자.
- 보조제와 함께 Neurobasal 매체의 2ml를 추가합니다.
- 매일 37 ° C 5 % CO 2 / 95% O 2 모니터링 철새 활동 품어.
4. 라이브 영상
- 3-4일에 대한 부화 후, 문화 접시를 검토하고 관심 coverslips를 선택합니다. explants은 세포의 반경 유니폼 구름을 생성한다. 라이브 영상에 사용될 수있는 새로운 문화 접시에 선택한 coverslips를 교체하십시오.
- coverslips 밤 동안 새 접시에 앉아 보자. 이미징을위한 현미경의 번호판을 배치하기 전에, 세포 배양 후드에 coverslip 및 세포 배양 플레이트 사이의 수집에 microbubbles을 공개하기 위해 coverslip을 이동하는 살균 주걱을 사용합니다. 거품의 간섭은 이미지를 망치는 것입니다. 잘의 중심에 coverslips 이동합니다.
- 증발을 방지하기 위해 물을 우물 사이의 공간을 채우십시오.
- 우물의 중심에서 coverslips를 이동하지 않도록으로 세포 배양 후드에서 현미경으로 접시를 주의깊게 전송합니다.
- 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지 방식을 정의합니다. 문화 설정의 3D 특성으로 인해 세포가도 수직으로 이동, 따라서 그것은 이주 구름의 전체 깊이를 포함한 Z - 비행기를 수집하는 것이 중요합니다. 몇 군데 지역의 XY 범위는 또한 상대 explant의 각도 방향 및 마이 그 레이션하는 세포를 기록, 녹음의 과정에서 마이 그 레이션 세포에 의해 채워진 것으로 예측된 영역을 커버하고 위해 비드 보증금을 포함할 정도로 큰 설정해야합니다 단백질의 소스. 또한 더 군데 Z의 비행기, 또는 더 많은 지역, 그건 샘플 및 세포 추적의 시간적 해상도의 손실 사이의 긴 시간 간격을 강요, 특정 시점에서 사이클을 기록하는 데 걸리는 시간을 더 적용되는 고려하십시오. 우리의 경우에는 10 배 목표를 사용하여 최적의 계획은 10 각각의 Z - 비행기 30 분 간격으로 모든 20μm를 간격을위한 3x3 타일 녹음했습니다. 우리는 30 분 간격으로 자신들의 움직임에 안정적인 추적을위한 중요 연속 시간 지점에서 세포의 애매하지 않은 신분을 허용하는 가장 긴을 발견했습니다.
- 시간 경과 이미징을 시작합니다.
- 원하는 시간 후, 접시를 제거하고 4퍼센트 인산염 버퍼 paraformaldehyde의 문화를 해결할 수 있습니다. 그것은 더 형태학의와 immunocytochemical 분석을 위해 사용될 수 있습니다.
5. 운동의 분석
- 추가 처리를위한 가장 편리한 형식, TIFF는 가장 휴대용으로 하나되는 이미지의 기록 시간 시리즈를 변환합니다.
- 녹음 XY 좌표에 의해 시간이 지남에 따라 개별 세포의 움직임을 추적합니다.이 매뉴얼 추적 플러그인, 또는 ImagePro, Volicity 또는 AutoQuant 같은 다른 상업적인 응용 프로그램과 함께 ImageJ (NIH)과 같은 자유롭게 사용할 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다.
- Excel 또는 자체 개발한 소프트웨어를 사용하여 트랙을 플롯.
- 각 추적 세포는 같은 평균 속도, 경로의 곡률, 시간이 지남에 따라 방향 다양성, 분기, 단백질의 원천 대한 편차로 운동 매개 변수를 계산에 대한 등 계산은 MS Excel 또는 이와 동등한 스프레드 시트에서 할 수 있습니다. 그들은 그보다 더 정교한 분석 방법을보다 유연 사용자 정의 및 포함을 허용으로 우리의 경험, 그것이 사내 스크립트를 (R, Matlab, 파이썬, 펄 혹은 다른 주로 오픈 소스 언어를 사용) 개발 훨씬 더 생산적는 것을 나타냅니다 엑셀의 기본 설치 가능합니다.
6. 대표 결과 :
그림 1. 해부 학적 origi의 다이어그램N explants니다. 이것은 hemisected 페렛 두뇌의 코로나 조각의 그림입니다. 회색 동그라미 explants을 찍은하는 지역을 나타냅니다.
그림 2. 문화 설치 프로그램의 다이어그램. 비드 보증금 단백질의 원천이며 explants가 양쪽에 위치하고 있으며 모든 요소가 Matrigel 덮여있다.
그림 3. quadrants (비드 보증금 방향 화살표 지점)에 의해 색깔 세포 트랙에 해당 플롯. 오른쪽에 셀 트랙 세포를 유치하기 위해 나타나는 분수 D, 대한 마이 그 레이션되며 왼쪽에있는 세포가 마이 그 레이션 세포를 격퇴하기 위해 나타나는 분수 방면 마이 그 레이션됩니다.
그림 4. explant 밖으로 마이 그 레이션하는 세포의 성장을 보여주는 구름 선택한 timepoints에서 이미지의) 일련의. (스케일 바 200μm) 아래에 표시로 화살표로 표시 예제 세포는, 시간을 통해 추적할 수 있습니다. 이 explant은 38 H. 삶의 이미지와 함께 시각했습니다 . B) 세포는 시간이 표시된 부분에 표시된 최종 이미지로 이미지를 기록 처음부터 explant 떠나 세포의 이미지가 여기에 표시됩니다. 세포는 반복 분기 (스케일 바 50μm)을 보여줍니다.
Discussion
여기 우리가 화학 신호에 대한 응답으로 신경 세포의 철새 행동을 연구하고 분석하는 간단한 시스템을 제시한다. 체외 마이 그 레이션 assays에서 세포의 운동에 영향을 미치는 세포 분자를 식별하는 데 사용되었습니다. 우리의 패러다임은 공부를 각각의 세포 상호 작용에있는 3 차원 (3D) 환경을 보장합니다. . 그것은 세포외 기질 (예 : Hirschberg 외 '10과 상호 작용함으로써 찾아볼 수없는, 폴리 - D - 라이신 - 코팅 coverslip의 평평한 표면에 이동하도록 강요 아르 세포 explants 밖으로 마이 그 레이션 문화에 비해 상당한 장점이다; 8. Métin 외. '07). 세포가 세로 가로 자유에 비해 바닥에 유리 coverslip 상대적으로 얇은입니다 Matrigel의 상단 표면 사이의 공간에 제약이 있으므로 그러나 추적 마이 그 레이션하는 세포의 큰 규모에 관하여는, 2 차원 유지 마이 그 레이션. 이러한 설정은 여전히 본질적으로 2 차원 운동의 유적 쉽게 분석을 위해 수 있습니다. . 마티니 동부 표준시, 콜라겐이나 Matrigel에 포함된 GE 세포의 GE의 explants하거나 다시 집계 구성된 비슷한 3D 패러다임은 이전에 화학 신호의 소스 (예 : Liodis 외 '07로서 특정 신호 단백질을 표현하는 세포의 집계를 사용하여 고용했다 .. 알 '09,. Nóbrega - 페레 외 '08; Wichterle 외 '03).. 여기서 제시하는 방법은 시스템이 특히 적합, 단백질은 매체에 직접 추가보다 높은 지역 환경에 지속적인 수준에 대해 허용을 준수 단백질과 라텍스 구슬의 형태로 속도가 느린 릴리스 시스템을 사용하면 사용 가능한 양을 단백질은 단백질의 복잡한 혼합물이 테스트 때 제한이나됩니다. 구슬의 선택은 라텍스 기반 제품에 한정하고, 또한 다른 재료, 예를 들어, 아가로 오스 비즈, 다양한 특성과 각각 포함되지 않습니다. 추가 분석의 밀도를 증가하기 위해, 우리는 반대편에있는 비즈 입금 apposed이 explants를 사용합니다. 원산지의 특정 영역을 보장하기 위해, 우리는 세포의 소스로 ganglionic 에미넨스 explants를 사용했습니다. 우리는 ganglionic 예하의 중간과 측면 부분의 차이를 평가하지만, 어떤 차이를 보지 못했어요. 우리는이 연구가 기가 실려을 사용하는 지적한다,이 종류에있는 중간과 측면 ganglionic eminences은 (. Poluch 외 '08) 설치류보다 이전 퓨즈. 문화가 만들어진 시간 (P0)의 중간과 측면 ganglionic eminences는 네크로 텍스 채우지 많은 세포가 여전히 발생하고 마이 그 레이션되고있다하더라도, 융합되었다. 세포의 진정한 동질적인 소스가 선호하는 경우 그러나, 세포 현탁액은 해부 조직에서 준비할 수 있으며, 직접 Matrigel과 혼합하거나, 또는 아래로 돌다 결과 펠렛은 'explants'을 만들어 냈어. proteolytic 활동도 잔여 흔적이 실험의 과정을 통해 Matrigel 녹일 수에 대한 세포 현탁액을 준비하는 효소 조직 소화의 사용은 낙담이다. 또한, 실사는 문화 설치의 타이밍에 적용되어야합니다. Matrigel은 온난 기간은 건조 공기 원인과 마이 그 레이션 세포로 꿰뚫을 수 있으며, 지울 수없는 쉘에있는 결과에 Matrigel의 작은 방울의 노출 (이 프로토콜에서 사용되는)의도 약간 연장 기간을 중합하기 위해 필요하지만 신선한 Matrigel과 후속 취재하여.
Disclosures
동물을 사용 : 동물과 관련된 모든 절차 USUHS와 NIH 기관 지침에 따라 수행하고 USUHS IACUC 승인되었습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국방부 부여 PT074620 (SLJ)와 NIH 그랜트 R01NS245014 (SLJ)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
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