Summary
Imagem lapso de tempo de cultura de tecidos 3D permite estudar o comportamento migratório de células individuais provenientes de eminência ganglionar em reação ao extrato de proteínas fracionadas do córtex cerebral.
Abstract
Migração de células é um processo comum que leva ao desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central de vertebrados (Hatten, 99). O córtex cerebral é composto por dois tipos básicos de neurônios: excitatórios e inibitórios. Essas células surgem em áreas distintas e migrar para o córtex ao longo das rotas diferentes (Pearlman et al., 98). Interneurônios inibitórios migrar tangencialmente a partir de fontes subcortical, principalmente a partir de diferentes regiões do eminências ganglionares (Gelman et al, '09;. Xu et al, '04).. Seu movimento espaço-temporal requer um controle preciso impostas por estímulos ambientais, para permitir o estabelecimento de adequada citoarquitetura e conectividade no córtex cerebral (Caviness & Rakic, 78; Hatten, '90; Rakic, '90). Para estudar o comportamento migratório de células geradas em zonas proliferativa das eminências ganglionares (GE) em furões recém-nascido in vitro foi utilizado um arranjo de três dimensões em uma cultura Matrigel BD Matrix. A configuração de cultura consistiu em dois explantes GE e uma fonte de proteínas testadas extraído do córtex cerebral e adsorvido em fluorescentes Retrobeads latex IX posicionado entre os explantes (Hasling et al, '03;. Riddle et al, 97.). Depois de 2-3 dias de cultura, as células começam a aparecer na borda do explante mostrando uma propensão a deixar o tecido em uma direção radial. Imagens ao vivo permitiu a observação de padrões migratórios sem a necessidade de rotulagem ou marcação das células. Quando expostas a frações da proteína extrato obtido de córtex ferret isocrônico, as células GE apresentado comportamentos diferentes, a julgar pela análise cinética quantitativa de células individuais em movimento.
Protocol
1. Preparação de reagentes
- Descongele congelados no gelo Matrigel molhada, deixando tempo suficiente antes do experimento (não acelerar o processo de aquecimento ativo). Matrigel é usado para estabelecer um ambiente 3D muito parecidas com uma matriz extracelular propício para a migração de células. Ele fornece células com ambos um substrato e mecânicos que encerra. Matrigel é armazenado congelado a -20 ° C. Antes de usar, ele deve ser gradualmente trazidos para a temperatura de 0-4 ° C, ou seja descongelado em gelo triturado ou em uma geladeira. Matrigel irreversivelmente conjuntos para formar um gel na temperatura de incubação (37 ° C). Portanto, não é recomendado para acelerar o descongelamento por imersão do recipiente em água morna.
- Frações protéicas são preparados por focalização isoelétrica (IEF) do extrato de proteína total do córtex cerebral pós-natal de dia 0 (P0) furão. Após a separação, as frações são dialisada durante a noite contra a 20mM Tris-HCl pH7.2 para limpar os extratos dos constituintes tampão foco, o que pode ser tóxico ao tecido.
- Sistema de proteína de entrega. Proteínas extraídas do córtex cerebral são adsorvidas em esferas de látex fluorescentes que então liberam lentamente as proteínas para o environment.We descobriu que o recurso de fluorescência ajuda no tratamento visual de microesferas e permite fácil detecção do mesmo spillovers mínima do local de talão de depósito, quando observados em microscópio fluorescente.
- Adicionar 10μl de contas fluorescentes para 100-200μl da solução de proteína
- Incubar por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente em um agitador
- Girar a contas para baixo em uma centrífuga de bancada para a velocidade máxima de 1h
- Remover o sobrenadante
- Re-suspender em um vórtice utilizando 10μl de meio fresco
- Adicionar 30μl de Matrigel à suspensão, misture bem, e colocar no gelo.
- Tampões e meios de comunicação
- Preparar e esterilizar-filtração do líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF; NaCl 124mm, 26mm NaHCO 3, NaH 2 PO 4 1,2 mm, 3,2 mm KCl, MgSO 4 1,2 mm, 2,4 mm CaCl 2, Glicose 10mM). Slush-congelar a ACSF de antemão, que ele está pronto no momento da dissecção dos tecidos. Para fazê-lo, coloque um frasco de plástico cheio de ACSF estéril em um freezer -80 C °. Monitor de congelamento de vez em quando, então, quando uma camada de gelo se acumula no interior da parede, quebrá-lo e misture com o líquido. Repita até que o frasco contém principalmente uma lama gelada. Buffer preparado desta forma não só apoia a sobrevivência do tecido, mas também irá realizar mais baixa temperatura, e é mecanicamente menos prejudicial para o tecido do que cubos de gelo chunky.
- Prepare médio Neurobasal com N-2 e B-27 suplementos adicionados de acordo com sugestões do fabricante, bem como gentamicina 1mg/100ml, 2 mM L-glutamina e glicose 0,6%. Esterilizar por filtração através de uma membrana 0.22μm. Manter aquecida a 37 ° C até o uso.
- Placas de cultura
- Cultura grade de plástico de seis pratos bem são preparados por dotting cada poço em seu centro com uma pequena quantidade (cerca de 2μl) de Matrigel frio utilizando 20μl ponta da pipeta, e colocando uma lamela de vidro autoclavados rodada 18 milímetros em cada gota. Nem as placas nem as lamelas necessidade de ser de outra forma de cultura, tratadas.
2. Preparação dos tecidos
- A obtenção do tecido cerebral
- Depois profundamente anestesiar o animal com Euthasol, remova o cérebro e colocá-lo na gelada ACSF
- Separar os hemisférios com um bisturi e corte coronal em 500μm usando um dispositivo de escolha, coleta de fatias em um pequeno prato contendo gelada ACSF
- Explantes fazer (use microscópio de dissecação)
- Identificar fatias contendo as eminências ganglionares (GE) e regiões da guarnição do córtex que podem curvar sobre o GE e interferir com novas medidas
- Pressione uma Harris Uni-Core furo na região próxima à superfície ventricular da GE, retraia um núcleo contendo predominantemente uma zona ventricular, e expulsá-lo com um êmbolo no meio gelada (Fig.1). Três a quatro explantes de 0,5 mm de diâmetro podem ser feitas a partir da GE na única fatia do cérebro P0 furão. Por favor, note que em ambos os roedores e ferrets, os GEs medial e lateral são fundidos nesta idade. Se um núcleo fica na fatia ou está preso ao fundo do prato de plástico, mobilizá-lo por esguichando ACSF com uma ponteira de pipeta e transferir com uma pipeta no prato contendo meio Neurobasal frio. Mantenha o prato sobre gelo molhado.
- Transferência de um lote de explantes do meio em uma queda grande de gelado Matrigel (cerca de 0,25 0,5 ml) colocados em um prato separado, tendo o cuidado de ter os explantes totalmente imersa e evitando bolhas. Mantenha o prato sobre gelo molhado. O tamanho de um lote depende da velocidade do fluxo de trabalho a jusante.
3. Configuração da cultura (uso de microscópio de dissecação)
- Manter sempre Matrigel e Matrigel contendo mistura no gelo para evitar a cura.
- Remix da suspensão de esferas e coloque 1-2μl ou menos da suspensão de esferas na gelada Matrigel no centro de uma lamela de vidro previamente colocados em uma placa de cultura bem usando uma ponteira 20μl. Deixe-a definir um pouco, evitar a dessecação.
- Usando uma ponteira 20μl pegar dois explantes da queda Matrigel e colocá-los nas imediações do depósito desejado talão (pelo menos um milímetro de distância da borda do depósito) simetricamente em lados opostos. Deixa por não mais de 5min à temperatura ambiente. O tempo certo de passos b e c é crítica. Se o tempo é curto demais ele irá levar a gelificação incompleta e componentes da instalação da cultura vai passar quando eles estão cobertos com a camada final de Matrigel; se o tempo é muito longo pode resultar em excesso de secagem do gel e criação de barreiras físicas que impedem a livre circulação das células.
- Cobrir as contas e o explante com uma camada plana de cerca de 30μl de Matrigel, estendendo-o para além dos explantes (Fig.2). Deixe-a definir na incubadora por aproximadamente 15 minutos.
- Adicionar 2ml de meio de Neurobasal com suplementos.
- Incubar a 37 ° C em 5% de CO O 2 / 95% a atividade de monitoramento 2 migratórias diária.
4. Ao vivo de imagens
- Após a incubação por 3-4 dias, rever a placas de cultura e escolha lamínulas de interesse. Os explantes devem gerar uma nuvem radialmente uniforme de células. Substituir lamínulas escolhido em uma placa de cultura fresco que será usado na geração de imagens ao vivo.
- Deixe as lamelas sentar-se no novo prato durante a noite. Antes de colocar a placa no microscópio para imagens, em uma capa de cultura de células, use uma espátula estéril para mover a lamínula, a fim de liberar qualquer microbolhas que recolhem entre a lamínula ea placa de cultura de células. Interferência de bolhas vai arruinar as imagens. Mover as lamelas para o centro do poço.
- Para evitar a evaporação, preencher o espaço entre os poços com água.
- Transferir cuidadosamente a placa da capa de cultura de células ao microscópio para não mover as lamelas do centro do poço.
- Definir um esquema de imagens utilizando o software de imagem. Devido à natureza da configuração 3D cultura as células também se move na vertical, por isso, é importante recolher Z-aviões abrangendo profundidade total da nuvem de migração. A extensão XY de uma área analisada também deve ser suficientemente grande para cobrir áreas previsto para ser povoada com as células migram durante o curso de gravação, e para conter o depósito talão, a fim de gravar uma orientação angular do explante e células migram em relação ao a fonte de proteína. Considere também que os aviões mais fotografada Z, ou o mais área coberta, mais tempo leva para gravar um ciclo em um ponto determinado momento, forçando intervalos maiores de tempo entre amostras e uma perda de resolução temporal de rastreamento de celular. No nosso caso, utilizando objetiva de 10x, o esquema ideal era uma gravação de azulejos de 3x3 para cada um dos 10 Z-aviões espaçadas a cada 20Hm, em intervalos de 30min. Encontrámos 30 min intervalos mais longos do que permite a identificação inequívoca das células em momentos consecutivos, o que é crítico para o rastreamento confiável de seus movimentos.
- Iniciado imagem lapso de tempo.
- Após o tempo desejado, retire a placa e corrigir as culturas em 4% tamponado paraformaldeído. Ele pode ser usado para análise posterior morfológicos e imunocitoquímicos.
5. Análise do movimento
- Converter a série de tempo de gravação de imagens em um formato mais conveniente para processamento posterior, TIFF sendo a mais portátil.
- Rastrear o movimento de células individuais ao longo do tempo por coordenadas XY de gravação. Isto pode ser feito usando o software disponível gratuitamente como ImageJ (NIH), com um Tracking Manual plug-in, ou qualquer outra aplicação comercial, como ImagePro, Volicity ou Autoquant.
- Plot as faixas usando o Excel ou in-house software desenvolvido.
- Para cada célula rastreado calcular parâmetros cinéticos como velocidade média, a curvatura do caminho, a variabilidade direcional ao longo do tempo, a ramificação, o desvio em direção à fonte de proteínas, cálculos, etc pode ser feito em MS Excel ou qualquer planilha equivalente. Nossa experiência indica, porém, que é muito mais produtivo para o desenvolvimento in-house scripts (usando R, Matlab, Python, Perl ou outras linguagens em sua imensa parte), pois eles permitem uma maior personalização flexível e inclusão de mais sofisticado do que os métodos analíticos disponíveis em uma instalação básica do Excel.
6. Resultados representativos:
Figura 1. Diagrama do origi anatômicasn de explantes. Este é um desenho de um corte coronal do cérebro ferret hemisected. Os círculos cinza indicam a região a partir do qual os explantes foram tomadas.
Figura 2. Diagrama de uma configuração de cultura. O depósito de talão é a fonte de proteínas; os explantes são colocados de ambos os lados e todos os elementos são cobertos com Matrigel.
Figura 3. Parcelas correspondentes de faixas de células coloridas por quadrantes (flechas apontam para o depósito talão). As faixas de células à direita estão migrando em direção a fração D, que parece atrair as células, as células do lado esquerdo estão migrando para fração A, que aparece para repelir as células migratórias.
Figura 4. A) Uma série de imagens de timepoints selecionados mostrando uma nuvem de crescimento de células a migrar para fora de um explante. Uma célula exemplo, indicado por uma seta, é monitorado através do tempo, conforme indicado abaixo (barra de escala 200μm). Este explante foi visualizado com imagens ao vivo por 38 h. Mostrados aqui são imagens de células deixando o explante a partir do início da gravação das imagens para a imagem final. B) A célula indicada na parte A nos horários indicados. A célula mostra a ramificação repetitivos (barra de escala de 50 ìm).
Discussion
Aqui apresentamos um sistema simples para estudar e analisar o comportamento migratório de células neuronais em resposta a estímulos químicos. Em ensaios de migração in vitro têm sido usados para identificar as moléculas extracelulares que afetam a locomoção de células. Nosso paradigma garante que cada célula estudada tem um ambiente 3-dimensional (3D) com os quais interagem. É uma vantagem considerável sobre as culturas onde as células migram para fora de explantes são forçados a mover-se sobre a superfície plana de poli-D-lisina revestido lamela, portanto, desprovida de interações com a matriz extracelular (por exemplo, Hirschberg et al '10;. 8. Metin et al. '07). No entanto, com relação à maior escala de rastreamento de células migratórias, continua a ser de 2 dimensões, como as células são verticalmente restrito ao espaço entre as lamelas de vidro na parte inferior e a superfície superior do Matrigel, que é relativamente fina em comparação com a liberdade horizontal da migração. Tal configuração permite a fácil análise do movimento, que ainda permanece essencialmente 2-dimensional. Similar paradigmas 3D consistindo de explantes GE ou re-agregados de células GE embutidos em colágeno ou Matrigel, anteriormente empregado, utilizando agregados de células que expressam uma determinada proteína de sinalização como uma fonte de pistas químicas (por exemplo '07 Liodis et al;. Martini et .. al '09;. Nóbrega-Pereira et al 08; Wichterle et al '03).. O método aqui apresentado utiliza um sistema de liberação lenta na forma de esferas de látex com proteínas aderido para permitir um nível sustentado no ambiente local, que é maior do que proteínas adicionado diretamente ao meio, tornando o sistema particularmente adequado quando a quantidade de disponíveis proteína é limitado ou quando uma mistura complexa de proteínas é testada. A escolha de contas não se limita ao látex à base de produtos, e inclui também outros materiais, por exemplo, contas de agarose, cada um com características diferentes. Para aumentar ainda mais a densidade do ensaio, foram utilizados dois explantes apposed ao depósito contas em lados opostos. Para garantir uma área específica de origem, temos usado explantes eminência ganglionar como fonte de células. Foram avaliadas diferenças em porções medial e lateral da eminência ganglionar, mas não vejo qualquer diferença. Devemos salientar que este estudo utiliza furões; nesta espécie as eminências medial e lateral ganglionares fusível mais cedo do que em roedores (Poluch et al 08.). No momento em que as culturas foram feitas (P0) as eminências ganglionares medial e lateral foram fundidos, embora muitas células preencher o neocórtex ainda estão sendo gerados e migração. No entanto, se uma fonte verdadeiramente homogênea de células é preferível, uma suspensão de células pode ser preparado a partir do tecido dissecado e diretamente misturado com o Matrigel, ou, alternativamente, girou para baixo e uma pelota resultando perfurado para fazer "explantes". Uso de digestão enzimática do tecido para preparar a suspensão celular é desencorajado, pois mesmo resíduos de atividade proteolítica pode liquefazer Matrigel ao longo do experimento. Além disso, uma diligência tem de ser aplicado para o momento da instalação da cultura. Embora Matrigel requer um período de aquecimento para polimerizar, mesmo período um pouco prolongado de exposição de pequenas gotas de Matrigel (como utilizado neste protocolo) para o ar faz com que a secagem e resulta em um shell que é impenetrável para as células migram e que não podem ser apagados cobrindo posterior com Matrigel fresco.
Disclosures
Uso de animais: Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com a USUHS e diretrizes institucionais NIH e aprovado pelo IACUC USUHS.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo DoD Grant PT074620 (SLJ) e Grant NIH R01NS245014 (SLJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
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