Summary
Imagen de lapso de tiempo de cultivo de tejidos en 3D permite estudiar el comportamiento migratorio de las células individuales procedentes de la eminencia ganglionar en la reacción para extraer proteínas fraccionadas de la corteza cerebral.
Abstract
Migración de las células es un proceso común que lleva al desarrollo y la maduración del sistema nervioso central de vertebrados (Hatten, 99). La corteza cerebral se compone de dos tipos básicos neuronales: excitación e inhibición. Estas células se originan en áreas distintas y migran hacia la corteza a lo largo de diferentes rutas (Pearlman et al., 98). Interneuronas inhibitorias migran tangencialmente de las fuentes subcortical, en su mayoría provenientes de diferentes regiones de las eminencias ganglionares (Gelman et al, 09;. Xu et al, '04.). Su movimiento requiere un control preciso espacio-temporales impuestas por los estímulos ambientales, para permitir el establecimiento de la citoarquitectura adecuada y la conectividad de la corteza cerebral (Caviness y Rakic, 78; Hatten, 90; Rakic, 90). Para estudiar el comportamiento migratorio de las células generadas en las zonas de proliferación de las eminencias ganglionares (GE) en hurones nacidos in vitro se utilizó un arreglo de tres dimensiones en la cultura de una matriz BD Matrigel. La configuración de la cultura consiste en dos explantes de GE y una fuente de proteínas de prueba extraída de la corteza cerebral y adsorbido a fluorescentes de látex IX Retrobeads situado entre los explantes (Hasling et al, '03. Riddle, et al, 97.). Después de 2-3 días de cultivo, las células comienzan a aparecer en el borde del explante mostrando una tendencia a dejar el tejido en una dirección radial. En vivo de imágenes permitió a la observación de los patrones migratorios, sin necesidad de etiquetado o marcado de las células. Cuando se expone a las fracciones de la proteína de extracto obtenido de la corteza hurón isochronic, las células de GE muestra comportamientos diferentes, a juzgar por el análisis cuantitativo cinética de las células individuales en movimiento.
Protocol
1. Preparación de los reactivos
- Descongele Matrigel en hielo, dejando tiempo suficiente antes del experimento (no acelerar el proceso de calentamiento activo). Matrigel se utiliza para establecer un entorno 3D muy parecidas a una matriz extracelular propicio para la migración de las células. Se provee a las células con los dos mecánicos y un sustrato encierra. Matrigel se almacena congelado a -20 ° C. Antes de su uso, debe ser llevado gradualmente a la temperatura de 0-4 ° C, es decir, descongeladas en hielo o en un refrigerador. Matrigel irreversible conjuntos para formar un gel en la temperatura de incubación (37 ° C). Por lo tanto, no se recomienda para acelerar la descongelación sumergiendo el recipiente en agua caliente.
- Fracciones de proteínas son preparados por isoelectroenfoque (IEF) del extracto de proteína total de la corteza cerebral del día postnatal 0 (P0) hurón. Después de la separación, las fracciones se dializó durante la noche contra 20 mM Tris-HCl pH 7.2 para limpiar los extractos de los componentes de amortiguación de enfoque, que podría ser tóxico para el tejido.
- Sistema de la proteína de entrega. Proteínas extraídas de la corteza cerebral son absorbidos por las gotas de látex fluorescentes que se liberan lentamente de las proteínas a la environment.We declara que la fluorescencia de ayuda en el manejo visual de las microesferas y permite una fácil detección de los efectos secundarios mínimos, incluso desde el lugar de de cuentas de depósito, cuando se observan bajo el microscopio de fluorescencia.
- Añadir 10μl de bolas fluorescentes para 100-200μl de solución de proteína
- Incubar durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente en un agitador
- Girar las bolas en una centrífuga de mesa durante 1 hora a la velocidad máxima
- Aspirar el sobrenadante
- Vuelva a suspender en un vórtice con 10μl de medio fresco
- Añadir 30μl de Matrigel a la suspensión, mezcle bien y coloque en el hielo.
- Tampones y medios
- Preparar y esterilizar filtración-líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, NaCl 124 mm, 26 mm de NaHCO3, NaH 2 PO 4 1,2 mm, 3,2 mm de KCl, MgSO4 1,2, CaCl2 2,4, glucosa 10 mM). Sobornos a congelar la LCRa de antemano, para que esté listo en el momento de la disección de los tejidos. Para hacerlo, coloque un recipiente de plástico llena de LCRa estéril en un congelador -80 ° C. Monitor de congelación de vez en cuando, así que cuando una capa de hielo se acumula en el interior de la pared, se rompen y se mezclan con el líquido. Repita hasta que el frasco contiene sobre todo un hielo derretido. Tampón preparado de esta forma no sólo es compatible con la supervivencia del tejido, sino que también llevará a cabo a baja temperatura ya, y es mecánicamente menos perjudiciales para el tejido de los cubos de hielo en trozos.
- Preparar el medio Neurobasal con N-2 y B-27 suplementos agregados de acuerdo a las sugerencias del fabricante, así como 1mg/100ml gentamicina, 2 mM L-glutamina, y el 0,6% de glucosa. Esterilizar por filtración a través de una membrana de 0.22μm. Mantener caliente a 37 ° C hasta su uso.
- Placas de cultivo
- La cultura material de plástico de seis placas son preparados por que salpican cada pozo en el centro con una pequeña cantidad (alrededor de 2μl) de Matrigel frío con 20μl punta de la pipeta, y la colocación de un autoclave cubreobjetos circular de vidrio de 18 mm en cada gota. Ni las placas ni cubres la necesidad de ser de otra manera cultivo tratado.
2. Preparación de tejidos
- La obtención del tejido cerebral
- Después de anestesiar al animal profundamente con Euthasol, retirar el cerebro y colocarlo en el helado LCRa
- Separar los hemisferios con un bisturí y corte coronal a 500μm con un dispositivo de su elección, recoger las rebanadas en un plato pequeño con helado LCRa
- Explantes de decisiones (uso de microscopio de disección)
- Identifique los segmentos que contienen las eminencias ganglionares (GE) y las regiones de corte de la corteza que pueden curvarse sobre GE e interferir con otras medidas
- Pulse una Harris Uni-Core dio en el área cerca de la superficie ventricular de GE, se retracte de un núcleo que contiene principalmente una zona ventricular, y lo expulsan con un émbolo en el medio helada (Fig. 1). De tres a cuatro explantes de 0,5 mm de diámetro se pueden hacer de la GE en una sola porción del cerebro P0 hurón. Tenga en cuenta que tanto en roedores y hurones, el GE medial y lateral se fusionan en esta edad. Si un núcleo se mantiene en el sector o está pegada a la parte inferior de plástico de la antena, se movilizan por chorros LCRa con una punta de la pipeta y transferir con una pipeta en el recipiente que contiene medio Neurobasal frío. Mantener el plato en hielo.
- La transferencia de un lote de explantes del medio en una gran caída de helado de Matrigel (alrededor de 0,25 0,5 ml) colocados en un plato separado, teniendo cuidado de que los explantes totalmente sumergido y evitar burbujas. Mantener el plato en hielo. El tamaño de un lote depende de la velocidad de las aguas abajo del flujo de trabajo.
3. Configuración de la cultura (el uso microscopio de disección)
- Siempre mantenga Matrigel y Matrigel que contienen mezclas de hielo para evitar la polimerización.
- Remix de la suspensión de bolas y el lugar 1-2μl o menos de la suspensión de bolas de helado de Matrigel en el centro de un cubreobjetos colocado previamente en una placa de cultivo y con una punta de pipeta 20μl. Deje que se asiente un poco, evitar que se seque.
- El uso de un 20μl punta de la pipeta recoger dos explantes de la caída de Matrigel y colocarlos en las cercanías deseada del depósito de cuentas (por lo menos 1 mm de distancia desde el borde del depósito) simétricamente en los lados opuestos. Dejar reposar durante no más de 5 minutos a temperatura ambiente. El momento adecuado de los pasos byc es fundamental. Si el tiempo es demasiado corto que dará lugar a la gelificación incompleta y los componentes de la configuración de la cultura se mueven cuando están cubiertas con la capa final de Matrigel, si el tiempo es demasiado largo puede dar lugar a un exceso de secado del gel y la creación de barreras físicas que impidan la libre circulación de las células.
- Cubrir las cuentas y el explante con una capa plana de unos 30μl de Matrigel, que se extiende más allá de los explantes (Fig. 2). Deje que se asiente en la incubadora durante unos 15 minutos.
- Añadir 2 ml de medio Neurobasal con suplementos.
- Se incuba a 37 ° C en el 5% de CO 2 / O 2 95% la actividad de control migratorio al día.
4. Imágenes en vivo
- Después de la incubación durante 3-4 días, revisar las placas de cultivo y elegir cubreobjetos de interés. Los explantes debe generar una nube radialmente uniforme de las células. Vuelva a colocar cubreobjetos elegido en una placa de cultivo fresco que se utilizará en la imagen en vivo.
- Deje que el cubreobjetos se sientan en la nueva placa durante la noche. Antes de colocar la placa en el microscopio en busca de imágenes, en una campana de cultivo celular, use una espátula estéril para mover el cubreobjetos con el fin de liberar las microburbujas que se acumulan entre el cubreobjetos y la placa de cultivo celular. La interferencia de las burbujas de arruinar las imágenes. Mover el cubreobjetos en el centro del pozo.
- Para evitar la evaporación, llenar el espacio entre los pozos de agua.
- Con cuidado, la transferencia de la placa de la campana de cultivo de células al microscopio como para no mover el cubreobjetos del centro del pozo.
- Definir un esquema de imágenes utilizando el software de imágenes. Debido a la naturaleza 3D de la configuración de la cultura de las células también se mueven verticalmente, por lo tanto, es importante recoger Z-aviones que abarca toda su profundidad de la nube de la migración. En la medida XY del área observada también se debe establecer lo suficientemente grande como para cubrir áreas que prometen ser poblado por células que migran durante el transcurso de la grabación, y para contener el depósito de cuentas a fin de registrar una orientación angular del explante y la migración de las células en relación con la fuente de la proteína. Además, consideran que los planos Z más imágenes, o el área cubierta más, cuanto más tiempo se tarda en grabar un ciclo en un momento determinado punto, obligando a los intervalos de tiempo más largo entre las muestras y una pérdida de resolución temporal de seguimiento de la célula. En nuestro caso, utilizando un objetivo de 10x, el esquema óptimo era una grabación de baldosas de 3x3 para cada una de las 10 Z-aviones separados cada 20μm, a intervalos de 30 minutos. Encontramos intervalos de 30 minutos más largo que permite la identificación inequívoca de las células en los puntos de tiempo consecutivos, lo cual es fundamental para el seguimiento confiable de sus movimientos.
- Iniciar imagen de lapso de tiempo.
- Después de la hora deseada, retirar la placa y fijar las culturas en el 4% de tampón fosfato de paraformaldehído. Puede ser usado para su posterior análisis morfológico e inmunocitoquímico.
5. Análisis del movimiento
- Convertir las series temporales de imágenes grabados en un formato más conveniente para su posterior procesamiento, TIFF es el más portátil.
- Seguir el movimiento de las células individuales en el tiempo mediante el registro de coordenadas XY. Esto se puede hacer usando software libremente disponible como ImageJ (NIH), con un seguimiento manual de plug-in, o cualquier otra aplicación comercial, como ImagePro, Volicity o AutoQuant.
- Parcela las pistas usando Excel o en la casa de software desarrollados.
- Para cada celda de seguimiento calcular los parámetros cinéticos como la velocidad media, la curvatura de la trayectoria, la variabilidad de dirección con el tiempo, la ramificación, la desviación hacia la fuente de proteínas, cálculos, etc se puede hacer en MS Excel o cualquier hoja de cálculo equivalente. Nuestra experiencia indica sin embargo que es mucho más productivo para desarrollar scripts de la casa (con R, Matlab, Python, Perl u otros lenguajes, en su mayoría de origen abierto), ya que permiten una mayor personalización flexible y la inclusión de los métodos analíticos más sofisticados que los disponibles en una instalación básica de Excel.
6. Los resultados representativos:
Figura 1. Diagrama de la anatomía origin de los explantes. Este es un dibujo de un corte coronal del cerebro de un hurón hemiseccionada. Los círculos grises indican la región de la cual los explantes fueron tomadas.
Figura 2. Diagrama de una configuración de la cultura. El depósito de cuentas es la fuente de proteínas, los explantes se colocan a ambos lados y todos los elementos están cubiertos de Matrigel.
Figura 3. Parcelas correspondientes de las pistas de células de color por cuadrantes (flechas apuntan hacia el depósito de cuentas). Las pistas de celda de la derecha están migrando hacia la fracción D, que parece atraer a las células, las células de la izquierda están migrando hacia la fracción A, que parece repeler a las células que migran.
Figura 4. A) Una serie de imágenes de puntos de tiempo seleccionados muestran una nube cada vez mayor de células que migran a partir de un explante. Una célula de ejemplo, indica con una flecha, se hace un seguimiento a través del tiempo, como se indica a continuación (barra de escala 200μm). Este explante se visualiza con imágenes en vivo de 38 h. Aquí se muestran imágenes de las células dejando el explante desde el comienzo de la grabación de las imágenes a la imagen final. B) La celda indicada en la parte A en el momento indicado. La celda muestra repetitivo de ramificación (barra de escala 50 micras).
Discussion
Aquí presentamos un sistema sencillo para estudiar y analizar el comportamiento migratorio de las células neuronales en respuesta a señales químicas. En los ensayos de migración in vitro se han utilizado para identificar las moléculas extracelulares que afectan a la locomoción de las células. Nuestro paradigma asegura que cada célula individual tiene un estudio de 3 dimensiones (3D) de medio ambiente con los que interactuar. Es una ventaja considerable sobre las culturas en las células que migran fuera de los explantes se ven obligados a desplazarse sobre la superficie plana de poli-D-lisina cubreobjetos, por lo tanto carente de interacciones con la matriz extracelular (por ejemplo, Hirschberg et al '10;. 8. Metin et al. '07). Sin embargo, con respecto a la mayor escala de seguimiento de la migración de las células, se mantiene en 2 dimensiones, ya que las células están verticalmente limitada al espacio entre el portaobjetos de vidrio en el fondo y la superficie superior de Matrigel, que es relativamente delgado en comparación a la libertad horizontal de la migración. Esta configuración permite un fácil análisis del movimiento, que sigue siendo esencialmente dos dimensiones. Similares paradigmas en 3D que consiste en explantes de GE o volver a los agregados de células de GE incorporado en el colágeno o Matrigel, fueron empleados con anterioridad, con los agregados de células que expresan una proteína de señalización como fuente de señales químicas (por ejemplo, Liodis et al '07;. Martini et .. al '09;. Nóbrega-Pereira et al 08; Wichterle et al '03).. El método que aquí se presenta utiliza un sistema de liberación lenta en forma de bolas de látex con las proteínas adheridas a permitir un nivel constante en el entorno local, que es superior a las proteínas añadido directamente al medio, haciendo el sistema especialmente indicado cuando la cantidad de espacio disponible la proteína es limitada o cuando una mezcla compleja de proteínas es la prueba. La elección de cuentas no se limita a los productos a base de látex, e incluye también otros materiales, por ejemplo, bolas de agarosa, cada uno con características diferentes. Para aumentar aún más la densidad del ensayo, se utilizaron dos explantes adosados a la cuentas de depósito en los lados opuestos. Para asegurar un área específica de origen, se ha utilizado explantes ganglionares eminencia como fuente de células. Se evaluaron las diferencias en las porciones medial y lateral de la eminencia ganglionar, pero no veo ninguna diferencia. Debemos señalar que este estudio utiliza los hurones, en esta especie las eminencias ganglionares medial y lateral del fusible antes que en los roedores (Poluch et al 08.). En el momento de las culturas se hicieron (P0) las eminencias ganglionares medial y lateral se fusionaron, aunque muchas células que pueblan la corteza cerebral están siendo generados y la migración. Sin embargo, si una fuente verdaderamente homogénea de las células se prefiere, una suspensión de células se pueden preparar a partir de los tejidos disecados y mezclarse directamente con el Matrigel, o bien girar hacia abajo y un pellet resultante perforadas para hacer 'explantes. El uso de la digestión enzimática de tejidos para preparar la suspensión de células no es recomendable, incluso para las trazas residuales de la actividad proteolítica se puede licuar Matrigel en el transcurso del experimento. Además, una debida diligencia se debe aplicar al momento de la configuración de la cultura. A pesar de Matrigel requiere un período de calentamiento para polimerizar, incluso un período ligeramente extendida de la exposición de pequeñas gotas de Matrigel (empleado en el presente protocolo) para el aire hace que el secado y los resultados en una cáscara que es impenetrable a la migración de las células y que no se pueden borrar cubriendo posterior con Matrigel fresco.
Disclosures
El uso de animales: Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo a las directrices del NIH y USUHS institucional y aprobado por el IACUC USUHS.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa de Grant PT074620 (SLJ) y de Subvenciones del NIH R01NS245014 (SLJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
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