Summary
Time lapse avbildning av 3D vävnadsodling kan studera flyttande beteendet hos enskilda celler med ursprung från ganglieblockerande företräde som en reaktion på fraktionerade protein utdrag ur hjärnbarken.
Abstract
Migration av celler är en vanlig process som leder till utveckling och mognad av ryggradsdjur centrala nervsystemet (Hatten, '99). Hjärnbarken består av två grundläggande neuronala typer: retande och hämmande. Dessa celler uppstår i olika områden och vandrar in i hjärnbarken längs olika vägar (Pearlman et al. '98). Hämmande interneuron migrera tangentiellt från subkortikala källor, främst från olika regioner i ganglieblockerande höjder (Gelman et al, '09;. Xu et al, '04.). Deras rörelse kräver en exakt Spatiotemporal kontroll som följer av miljö-signaler för att möjliggöra upprättandet av korrekta cytoarchitecture och anslutningsmöjligheter i hjärnbarken (Caviness & Rakic, '78, Hatten, '90, Rakic, '90). För att studera de flyttande beteende celler genereras i proliferativa områden i ganglieblockerande höjder (GE) hos nyfödda illrar in vitro använde vi en 3 dimensionell kultur arrangemang i en BD Matrigel Matrix. Kulturen inställning bestod av två GE explants och en källa till testade proteiner ur hjärnbarken och adsorberad till fluorescerande latex Retrobeads IX placerade mellan explants (Hasling et al, '03;. Riddle et al, 97.). Efter 2-3 dagar av kultur, cellerna börjar visas på kanten av Explantation visar en benägenhet att lämna vävnad i en radiell riktning. Bildproduktion tillåtet observation av vandringsmönster utan nödvändigheten av märkning av celler. När de utsätts för fraktioner av proteinet utvinns ur isochronic iller cortex, visas GE cellerna olika beteenden som bedöms av kvantitativ kinetisk analys av enskilda rörliga celler.
Protocol
1. REAGENSBEREDNING
- Tina frysta Matrigel på våt is, lämnar tillräckligt med tid före försöket (inte påskynda processen genom att aktivt uppvärmningen). Matrigel används för att skapa en 3D-miljö liknar en extracellulärmatrix leder till migration av celler. Det ger celler med både ett substrat och mekanisk innesluta. Matrigel förvaras frysta vid -20 ° C. Före användning bör det successivt tas upp till den temperatur 0-4 ° C, dvs tinas på våt is eller i kylskåp. Matrigel ställer irreversibelt att bilda en gel i temperatur inkubation (37 ° C). Därför rekommenderas inte att påskynda upptiningen genom att sänka ner behållaren i varmt vatten.
- Protein fraktioner förbereds av isoelektrisk fokusering (IEF) av det totala proteininnehållet utdrag ur hjärnbarken av postnatal dag 0 (P0) iller. Efter separering, är de fraktioner dialyseras natten mot 20mm Tris-HCl pH7.2 att rengöra utdrag ur fokus bufferten beståndsdelar som kan vara giftigt för vävnaden.
- Protein leveranssystem. Proteiner ur hjärnbarken är adsorberade på fluorescerande latex kulor som sedan långsamt släppa proteiner till environment.We fann att fluorescens funktion hjälper i visuell hantering av mikrosfärer och gör det lätt att upptäcka även små spridningseffekter från platsen för pärla deposition när observerade under fluorescerande mikroskop.
- Tillsätt 10μl av fluorescerande pärlor till 100-200μl av protein lösning
- Inkubera i 30 min i mörker vid RT på en shaker
- Snurra pärlor i en bänk centrifugera i 1 timme vid max hastighet
- Avlägsna supernatanten
- Re-suspendera i en virvel med hjälp 10μl av färska medelstora
- Tillsätt 30μl av Matrigel till fjädring, blanda väl och lägg på is.
- Buffertar och media
- Förbered och filtrering-sterilisera konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF, NaCl 124mM, NaHCO 3 26mm, NaH 2 PO 4 1,2 mm, KCl 3,2 mm, MgSO 4 1,2 mm, CaCl 2 2,4 mm, glukos 10mm). Slush-frysa aCSF förväg, så det är klart vid tiden för vävnaden dissekering. För att göra det, placera en plastflaska fylld med steril aCSF i -80 ° C frys. Övervaka frysning var så ofta, så när ett lager av is byggs upp på insidan av väggen, bryta det och blanda med vätskan. Upprepa tills kolven innehåller mest en isig snömodd. Buffert beredd på detta sätt inte bara stöder vävnad överlevnad, men kommer också att hålla låg temperatur längre, och är mekaniskt mindre skadlig för vävnad än chunky isbitar.
- Förbered Neurobasal medium med N-2 och B-27 tillskott läggas enligt tillverkarens förslag, liksom 1mg/100ml gentamycin, 2 mM L-glutamin, och 0,6% glukos. Sterilisera genom filtrering genom ett 0.22μm membran. Håll varm vid 37 ° C fram till användning.
- Odlingsplattor
- Kultur grade plast sex brunnar plattor bereds av öronmärkningar varje brunn i mitten med en liten mängd (ca 2μl) kallt Matrigel använda 20μl pipettspetsen och placera en autoklaveras runt 18mm glas täckglas på varje droppe. Varken plattorna eller täckglas måste annars kulturen behandlas.
2. Tissue förberedelse
- Framställning av hjärnvävnad
- Efter djupt anesthetizing djuret med Euthasol, ta bort hjärnan och placera den i iskallt aCSF
- Separera halvklotet med en skalpell och skär koronalt på 500μm använder en enhet val, samla skivor i en liten skål med iskallt aCSF
- Göra explants (använd dissekera mikroskop)
- Identifiera skivor som innehåller ganglieblockerande höjder (GE) och trim regioner i hjärnbarken som kan krypa över GE och stör ytterligare steg
- Tryck en Harris Uni-Core bar i området nära ventrikulär ytan av GE, dra en kärna innehållande huvudsakligen en ventrikulär zon, och utvisa den med en kolv i den iskalla medium (Fig. 1). Tre till fyra explants på 0,5 mm kan göras från GE i enkel P0 iller hjärnan skiva. Observera att både gnagare och iller som är mediala och laterala GES smält i denna ålder. Om en kärna kvar i slice eller fastnat på plasten botten av skålen, mobilisera den genom att spruta aCSF med en pipett spets och överföring med en pipett i skålen med kallt Neurobasal medium. Håll skålen på våt is.
- Överföring ett parti explants från mediet till en stor droppe iskallt Matrigel (ca 0,25-0.5ml) placeras i en separat skål, noga med att ha explants helt nedsänkt och undvika bubblor. Håll skålen på våt is. Storleken på ett parti beror på hastigheten på arbetsflödet nedströms.
3. Kultur inställning (använd dissekera mikroskop)
- Håll alltid Matrigel och Matrigel som innehåller mixar på is för att undvika härdning.
- Remix pärla fjädring och placera 1-2μl eller mindre av den pärla suspension i iskallt Matrigel i centrum av ett glas täckglas tidigare placerad i en kultur platta brunn med en 20μl pipettspetsen. Låt det in lite, undvika uttorkning.
- Med hjälp av en 20μl pipettspets plocka upp 2 explants från Matrigel droppe och placera dem i önskad närheten av pärla insättning (minst 1 mm från kanten för insättning) symmetriskt på motsatta sidor. Låt det stå längre än 5min i rumstemperatur. Rätt tidpunkt för steg b och c är kritisk. Om tiden är för kort kommer det att leda till ofullständig geleringsmedel och komponenter av kultur installationen kommer att flytta när de är täckta med det sista lagret av Matrigel, om tiden är för lång det kan resultera i över-torkning av gelen och skapandet av fysiska hinder som hindrar den fria rörligheten av celler.
- Täck pärlor och Explantation med en platt skikt av ca 30μl av Matrigel, utvidga den bortom explants (Fig.2). Låt det som i inkubatorn i cirka 15 minuter.
- Tillsätt 2 ml Neurobasal medium med kosttillskott.
- Inkubera vid 37 ° C i 5% CO 2 / 95% O 2 övervakning flyttande aktivitet dagligen.
4. Bildproduktion
- Efter inkubering i 3-4 dagar, granska odlingsplattor och välj täckglas av intresse. Den explants ska generera ett radiellt enhetlig moln av celler. Byt valt täckglas i en ny kultur platta som kommer att användas i levande bilder.
- Låt täckglasen sitta i den nya plåten över natten. Innan du placerar plattan på mikroskop för avbildning, i en cellkultur huva, använd en steril spatel för att flytta täckglas för att släppa några mikrobubblor som samlar mellan täckglas och cellodling plattan. Störningar av bubblor kommer att förstöra bilderna. Flytta täckglasen till mitten av brunnen.
- För att förhindra avdunstning, fyller utrymmet mellan brunnar med vatten.
- Försiktigt flytta plattan från cellodling köksfläkten till mikroskop för att inte flytta täckglasen från mitten av brunnen.
- Definiera en avbildning system med hjälp av bildprogram. Tack vare 3D-natur kultur installation cellerna också röra sig vertikalt, därför är det viktigt att samla in Z-plan som omfattar hela djup migration molnet. XY omfattning avbildade området bör också inrättas tillräckligt stor för att täcka områden spås bli befolkas av migrerar cellerna under inspelningen, och att innehålla pärla insättning för att spela in en kantig orientering Explantation och flyttar celler i förhållande till källan till protein. Anser också att ju mer avbildade Z flygplan, eller den mer område som omfattas, desto mer tid det tar att spela in en cykel vid en viss tidpunkt, vilket tvingar längre tidsintervall mellan prover och en förlust av tidsupplösning av cell tracking. I vårt fall, med en 10x mål, var den optimala systemet en 3x3 kakel inspelning för varje 10 Z-plan fördelade per 20 mikroM, i intervall på 30min. Vi fann 30 min intervaller den längsta som gör att entydig identifiering av celler vid gången i rad punkter, vilket är avgörande för tillförlitlig uppföljning av deras rörelser.
- Initiera avbildning tid förfaller.
- Efter önskad tid, ta bort plattan och fixa kulturer i 4% fosfatbuffrad paraformaldehyd. Den kan användas för vidare morfologiska och immuncytokemiska analys.
5. Analys av rörelse
- Konvertera inspelad tid serie bilder i ett format som mest bekvämt för vidare bearbetning, TIFF är den mest bärbara en.
- Följa utvecklingen av enskilda celler över tiden genom att spela in XY-koordinater. Detta kan göras med hjälp av fritt tillgänglig programvara som ImageJ (NIH) med manuell spårning plug-in, eller någon annan kommersiell tillämpning som ImagePro, Volicity eller AutoQuant.
- Rita upp spår med Excel eller egenutvecklad programvara.
- För varje spårad cell beräkna kinetiska parametrar som medelhastighet, krökning av vägen, riktad variation över tiden, förgrening, avvikelsen mot källan av proteiner, etc. Beräkningarna görs i MS Excel eller motsvarande kalkylprogram. Vår erfarenhet visar dock att det är betydligt mer produktivt att utvecklas internt skript (med R, Matlab, Python, Perl eller andra, mestadels öppen språk Source), eftersom de möjliggör en mer flexibel anpassning och integration av mer sofistikerade analysmetoder än de som tillgänglig i en grundläggande installation av Excel.
6. Representativa resultat:
Figur 1. Diagram över de anatomiska ursprungn explants. Detta är en teckning av en koronalt bit av en hemisected iller hjärna. Den grå cirklarna indikerar den region från vilken explants togs.
Figur 2. Diagram av en kultur setup. Den pärlan insättning är källan av proteiner, de explants är placerade på vardera sida och alla delar är täckta med Matrigel.
Figur 3. Motsvarande tomter av cell spår färgad av kvadranter (pilar pekar mot pärla deposition). Cellen spåren till höger flyttar mot bråkdel D, som verkar för att locka celler, celler till vänster migrerar mot bråkdel A, som verkar avvisa vandrande celler.
Figur 4. A) En serie bilder från utvalda tidpunkter visar en växande moln av celler migrerar ut ur en Explantation. Ett exempel cell, indikeras av en pil, spåras genom tiden som anges nedan (skala bar 200μm). Detta Explantation visualiserades med levande bildhantering för 38 h. Som visas här är bilder av celler lämnar Explantation från början av inspelningen bilderna till den slutliga bilden. B) Cellen som anges i del A vid de tider som anges. Cellen visar repetitiva förgrening (skala bar 50μm).
Discussion
Här presenterar vi ett enkelt system för att studera och analysera vandrande beteende neurala celler som svar på kemiska signaler. In vitro migration-analyser har använts för att identifiera extracellulära molekyler som påverkar rörelseorganen av celler. Vår paradigmet säkerställer att varje enskild cell studerat har en 3-dimensionell (3D) miljö som man kan interagera. Det är en stor fördel över kulturer där celler migrerar ut ur explants tvingas flytta på den plana ytan av poly-D-lysin-belagda täckglas och därmed saknar interaktion med extracellulära matrix (t.ex. Hirschberg et al '10;. 8. Metin et al. '07). Men med avseende på större skala av spårning vandrande celler, är det fortfarande 2-dimensionella, eftersom cellerna är vertikalt begränsad till utrymmet mellan glaset täckglas på botten och ovansida Matrigel, som är relativt tunn jämfört med den horisontella frihet av migration. En sådan inställning gör det enklare analys av rörelse, som fortfarande är i huvudsak 2-dimensionella. Liknande 3D paradigm bestående av GE explants eller nytt aggregat av GE celler inbäddade i kollagen eller Matrigel, tidigare var anställd, med hjälp av aggregat av celler som uttrycker en viss signalering protein som en källa till kemiska signaler (t.ex. Liodis et al '07;. Martini et .. al '09;. Nobrega-Pereira et al '08; Wichterle et al '03).. Den metod som presenteras här används en slow release-system i form av latex pärlor med levt proteiner för att möjliggöra en bibehållen i den lokala miljön, vilket är högre än proteiner tillsättas direkt till mediet, vilket gör systemet särskilt lämplig när mängden tillgängligt protein är begränsad eller när en komplex blandning av proteiner testas. Valet av pärlor är inte begränsat till latex-baserade produkter, och omfattar även andra material, till exempel agaros pärlor, alla med olika egenskaper. För att ytterligare öka tätheten av analysen har vi använt två explants apposed till pärlorna insättning på motsatta sidor. För att säkerställa ett visst område i ursprung, har vi använt ganglieblockerande eminens explants som en källa av celler. Vi utvärderade skillnader i mediala och laterala delar av ganglieblockerande berömmelse, men såg inga skillnader. Vi bör påpeka att denna studie använder illrar, i denna art i mediala och laterala ganglieblockerande höjder säkringen tidigare än hos gnagare (Poluch et al '08.). Vid den tidpunkt då kulturerna gjordes (P0) den mediala och laterala ganglieblockerande höjder var smält, även om många celler befolka hjärnbarken fortfarande genereras och migrerar. Men om en verkligt homogen källa av celler är att föredra, kan en cellsuspension vara beredd från dissekeras vävnaden och direkt blandas med Matrigel, alternativt snurrade ner och en resulterande pellets stansade att göra "explants". Användning av enzymatisk vävnad matsmältningen att förbereda cellsuspension är avskräckt, för även rester av proteolytiska aktivitet kan smälta Matrigel under loppet av experimentet. Dessutom har en due diligence som skall tillämpas på tidpunkten för kulturen installationen. Även Matrigel kräver en period av uppvärmning till polymeriseras, till och med en något längre exponering av små droppar Matrigel (som används i detta protokoll) till luft uttorkar och resulterar i ett skal som är ogenomtränglig för vandrande celler och som inte kan raderas genom efterföljande täcker med färsk Matrigel.
Disclosures
Användningen av djur: Alla som deltar i djurförsök har utförts i enlighet med de USUHS och NIH institutionella riktlinjer och godkännas av USUHS IACUC.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av DoD Grant PT074620 (SLJ) och NIH Grant R01NS245014 (SLJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
- Caviness, V. S. Jr, Rakic, P. Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice. Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).
- Gelman, D. M., Martini, F. J., Nóbrega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Marín, O. The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons. J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).
- Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia. Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).
- Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., Götz, M., Offermanns, S., Kuner, R. Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis. Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).
- Hatten, M. E. Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain. Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).
- Hatten, M. E. Central nervous system neuronal migration. Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).
- Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).
- Métin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Molnár, Z. Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development. Development. 134, 2815-2827 (2007).
- Martini, F. J., Valiente, M., López Bendito, G., Szabó, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Marín, O. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. , 136-1341 (2009).
- Nóbrega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Marín, O. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59, 733-745 (2008).
- Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. New directions for neuronal migration. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).
- Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia. Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).
- Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
- Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres. Biotechniques. 23, 928-937 (1997).
- Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).
- Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).
