Summary
3D doku kültürü Zaman atlamalı görüntüleme, serebral korteks fraksiyone protein ayıklamak için tepki olarak ganglion eminens kaynaklanan bireysel hücrelerinin göç davranışı eğitim sağlar.
Abstract
Hücre göçü, omurgalı ve merkezi sinir sisteminin gelişimi ve olgunlaşma (Hatten, '99) yol açar ortak bir süreç. Eksitatör ve inhibitör: Serebral korteks, iki temel nöronal türleri oluşur. Bu hücreler, farklı alanlarda ortaya çıkan ve farklı yollar boyunca (Pearlman ve ark. '98) Korteks göç . Inhibitör çoğunlukla ganglion eminences (. Xu ve ark, '04. Gelman ve ark, '09) farklı bölgelerinde, teğet subkortikal kaynaklardan göç. (Hatten, '90; Caviness & Rakic Rakic, '90, '78) Onların hareketi uygun serebral korteksteki hücre mimarisini ve bağlantı kurulması için izin vermek, çevresel ipuçları dayattığı hassas Spatiotemporal kontrolü gerektirir. Ganglion eminences (GE), in vitro yenidoğan ferrets proliferatif bölgelerde üretilen hücrelerin göç davranışlarını incelemek için bir BD Matrigel Matrix 3 boyutlu bir kültür düzenleme kullandı. Kültür kurulum iki GE eksplantlar ve serebral korteks çıkarılır ve eksplantlar (Riddle ve ark, '97 ve ark Hasling, '03) arasında konumlandırılmış floresan lateks Retrobeads IX adsorbe test proteinlerin kaynağıdır oluşuyordu. Kültür 2-3 gün sonra, hücreler, radyal yönde doku terk bir eğilim gösteren eksplant kenarında görünmeye başlar. Canlı görüntüleme, etiketleme veya işaretleme hücrelere gerek kalmadan göçmen desen gözlem izin verdi. Isochronic gelincik korteks elde ayıklamak protein fraksiyonları için maruz kaldığında, GE hücreleri nicel kinetik analiz bireysel hareket eden hücreler tarafından değerlendirilecek gibi farklı davranışlar sergilemiştir.
Protocol
1. Reaktif hazırlama
- Çözülme, ıslak buz üzerinde deneyi (aktif ısınma sürecini hızlandırmak) önce yeterli zaman bırakarak Matrigel dondurulmuş Matrigel hücrelerin göç için elverişli bir ekstrasellüler matriks yakından benzeyen 3 boyutlu bir ortam oluşturmak için kullanılır. Bu bir substrat hem de mekanik encasing hücreleri sağlar. Matrigel -20 ° C'de dondurularak saklanmalıdır Kullanmadan önce, yavaş yavaş sıcaklığını 0-4 büyümüş olmalı ° C, yani ıslak buz üzerinde veya bir buzdolabı çözülmüş. Matrigel geri dönüşümsüz inkübasyon sıcaklığı (37 ° C) bir jel formu için ayarlar. Bu nedenle, sıcak su konteyner çeker çözülme hızlandırmak için tavsiye edilmez .
- Protein fraksiyonları, doğum sonrası günlük 0 (P0) gelincik serebral korteks total protein ekstresi izoelektrik odaklama (IEF) tarafından hazırlanmıştır. Ayrıldıktan sonra, kesirler 20mm Tris-HCl pH7.2 karşı doku için toksik olabilir odaklama tampon bileşenler, özleri temiz bir gecede diyalize vardır.
- Serebral korteks çıkarılan Protein dağıtım sistemi. Proteinler, sonra yavaş yavaş floresan özellik mikroküreler görsel işleme yardımcı olur ve site bile minimal yayılımı kolay algılanmasını sağlar bulundu environment.We proteinler serbest floresan lateks boncuk adsorbe boncuk mevduat, floresan mikroskop altında gözlenen.
- 10μl, floresan boncuk protein solüsyonu 100-200μl ekle
- Çalkalayıcı üzerinde RT karanlıkta 30 dakika inkübe
- Maksimum hızda 1sa bir tezgah santrifüj boncuk Spin
- Süpernatantı
- Taze orta 10μl kullanarak bir vorteks yeniden askıya
- Süspansiyon Matrigel, 30μl ekleyin, iyice karıştırın ve buz üzerinde yer.
- Tamponlar ve medya
- Yapay beyin omurilik sıvısı (NaCl 124mm, NaHCO 3 26mm, NaH 2 PO 4 1.2mm, KCl 3.2mm, MgSO 4 1.2mm, CaCl 2 2.4mm, Glikoz 10mM aCSF) hazırlayın ve filtrasyon sterilize. Önceden aCSF Slush dondurma, böylece doku diseksiyonu zamanda hazır olmak için, -80 ° C derin dondurucuda steril aCSF ile dolu bir plastik şişeyi koyun. Duvarın içine kadar buz tabakası oluşturur, onu kırmak ve sıvı ile karıştırın, çok sık her dondurma izleyin. Balondaki çoğunlukla buzlu sulu kar içerir kadar tekrarlayın. Tampon sadece doku hayatta kalma destekler bu şekilde hazırlanmış, fakat düşük sıcaklıkta uzun süre tutacak ve tıknaz buz küpleri daha doku mekanik olarak daha az zararlı.
- N-2 ve B-27 takviyesi, üreticinin önerileri yanı sıra 1mg/100ml gentamisin, 2 mM L-glutamin ve% 0.6 glukoz doğrultusunda ekledi. Neurobasal ortamı hazırlayın 0.22μm zarından filtrasyon ile sterilize edin. 37 sıcak tutun ° C kullanana kadar.
- Kültür plakalar
- Kültür dereceli plastik altı kuyucuğu 20μl pipet kullanarak soğuk Matrigel küçük bir miktarı (2μl hakkında) ile merkezi her yanı süsleyen ve her damla otoklavlanmış yuvarlak 18mm cam lamel yerleştirerek tarafından hazırlanmıştır. Ne plakaları ne lamelleri aksi kültür tedavi gerekir.
2. Doku hazırlanması
- Beyin dokusu elde etmek
- Derin anestezi ile hayvan Euthasol sonra, beyin kaldırmak ve buz aCSF
- Bir neşter hemisferlerin ayırın ve küçük bir çanak içine buz aCSF içeren bir dilim toplama, koronal dilim tercih edilen bir cihaz kullanarak 500μm
- Yapma eksplantlar (diseksiyon mikroskop kullanmak)
- GE üzerinde kıvrılma ve daha ileri adımlar müdahale ganglion eminences (GE) ve korteks Döşeme bölgeleri içeren dilimleri belirleyin
- Harris Uni-Core basın GE ventriküler yüzeye yakın alanda deliği, ağırlıklı olarak ventriküler dilimini içeren bir çekirdek geri çekmek ve buz orta (Şekil 1) bir piston ile sınırdışı 0.5 Üç dört eksplantlar mm çapında tek P0 gelincik beyin dilim GE yapılabilir. Hem kemirgenler ve dağ gelinciği, medial ve lateral GES bu yaşta erimiş olduğunu lütfen unutmayınız. Çekirdek bir dilim kalır ya da yemeğin plastik altına sıkışmış ise, soğuk Neurobasal orta içeren çanak içine bir pipet ile bir pipet ve transfer ile aCSF püskürtme seferber . Islak buz üzerinde çanak tutun.
- Eksplantlar tam dalmış ve kabarcıkları kaçınarak özen, ayrı bir kapta, yerleştirilen buz Matrigel büyük bir damla (yaklaşık 0.25-0.5 ml) orta eksplantlar toplu aktarın. Islak buz üzerinde çanak tutun. Bir toplu iş boyutu, iş akışı akış aşağı hızına bağlıdır.
3. Kültür kurulumu (diseksiyon mikroskobu kullanın)
- Daima Matrigel kür önlemek için buz üzerinde Matrigel içeren karışımları tutun.
- Remix boncuk süspansiyonu ve 20μl bir pipet kullanarak daha önce bir kültür plaka yerleştirilmiş bir cam lamel merkezinde buz Matrigel boncuk süspansiyon 1-2μl veya daha az. Bir küçük set, kurutma kaçının.
- 20μl bir pipet kullanarak Matrigel açılan 2 eksplantlar pick up ve ters tarafta simetrik (depozito kenarından uzak 1mm en azından) boncuk mevduat istenen çevresinde koyun. 5dk daha oda sıcaklığında artık ayarlamanıza olanak sağlar. B ve c adımları doğru zamanlama kritik öneme sahiptir. Süresi çok kısa ise Matrigel son tabakası ile kaplıdır hareket edecek, kültür kurulum eksik jelleşme ve bileşenleri yol açacaktır; süresi çok uzun ise, jel ve yaratılış üzerinde kuruyan neden olabilir hücreleri serbest dolaşımı engelleyen fiziksel bariyerler.
- Eksplantlar (Şekil 2) ötesinde uzanan yaklaşık 30μl Matrigel, düz bir tabaka ile boncuk ve eksplant örtün. Yaklaşık 15 dakika süreyle inkübatör ayarlanmış olsun.
- Takviyeleri ile Neurobasal orta 2 ml ekleyin.
- Günlük 37 ° C,% 5 CO 2 /% 95 O 2 izleme göç aktivitesi inkübe edin.
4. Canlı görüntüleme
- 3-4 gün inkübasyondan sonra, kültür plakaları gözden geçirin ve ilgi lamelleri seçin. Eksplantlar hücre radyal tekdüze bir bulut oluşturmak gerekir. Canlı görüntülemede kullanılacak olan yeni bir kültür plakasına seçilen lamelleri değiştirin.
- Lamelleri yeni plaka gece boyunca bekletin. Görüntüleme için mikroskop plaka yerleştirmeden önce, hücre kültürü kaputu lamel, lamel ve hücre kültürü plakası arasındaki toplamak herhangi bir mikro kabarcık serbest bırakmak amacıyla hareket etmek için steril bir spatula kullanın. Baloncuklar Girişim görüntüleri berbat. Lamelleri iyi merkezine taşıyın.
- Buharlaşmasını önlemek için, su ile kuyu arasındaki boşluğu doldururlar.
- Iyi merkezinde lamelleri hareket olarak mikroskop hücre kültürü kaputu plaka dikkatli bir şekilde aktarmak.
- Görüntüleme yazılımı kullanarak bir görüntüleme sistemini tanımlayın. Hücrelerin kültür kurulum 3D doğası nedeniyle de dikey hareket, bu nedenle göç bulutun tam derinliği kapsayan Z bilgi toplamak için önemlidir. Görüntülü alanı XY ölçüde de göreli bir eksplant açısal yönelim ve göç hücreleri kaydetmek için, kayıt sırasında göç eden hücreler tarafından doldurulur tahmin alanları kapsayacak şekilde ve boncuk depozito içeren set yeterince büyük olmalı protein kaynağıdır. Ayrıca görüntülü Z uçaklar, ya da daha fazla alan arasında daha uzun zaman aralıklarında örnekler ve hücre izleme temporal çözünürlük kaybına zorlayarak, belli bir zaman noktasında bir döngü kayıt için gereken daha fazla zaman kapsadığını düşünün . Bizim durumumuzda, 10x objektif kullanarak, en uygun düzeni her 10 Z-uçakları, 30 dakika aralıklarla her 20μm aralıklı için 3x3 kiremit kayıt edildi. Biz 30 dakika aralıklarla hareketlerinin güvenilir bir izleme için kritik öneme sahiptir kez puan, hücrelerin kesin kimlik izin veren uzun bulundu .
- Zaman atlamalı görüntüleme başlatın.
- Istenen süre sonra, plaka kaldırmak ve fosfat tamponlu paraformaldehid% 4 kültürler düzeltmek. Bu morfolojik ve immünositokimyasal analizi için kullanılabilir.
5. Hareket Analizi
- Daha fazla işlem için en uygun bir biçimde, TIFF en taşınabilir görüntülerin kayıt süresi serisi dönüştürün.
- Zamanla kayıt XY koordinatları ile tek tek hücrelerin hareketini izleyin. Manuel İzleme plug-in ya da ImagePro VOLICITY veya AutoQUANT başka herhangi bir ticari uygulama ile ImageJ (NIH) gibi serbestçe kullanılabilir yazılım kullanılarak yapılabilir.
- Excel ya da in-house geliştirilmiş yazılım kullanarak izleri çizilir.
- Takip her hücre, ortalama hız, yol eğrilik, zaman içinde yön değişkenlik, dallanma, protein kaynağı doğru sapma gibi kinetik parametreleri hesaplamak için, vb Hesaplamalar MS Excel veya eşdeğer herhangi bir tablo yapılabilir . Onlar daha sofistike analitik yöntemlerin dışında, daha esnek özelleştirme ve dahil edilmesi için izin Deneyimlerimiz, ancak içi scriptleri (R, Matlab, Python, Perl veya diğer çoğunlukla Open Source dilleri kullanarak) geliştirmek için çok daha verimli olduğunu gösterir Excel'in temel bir kurulum mevcuttur.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1. Anatomik uydu alıcısı diyagramın eksplant. Bu hemisected bir gelincik beyin koronal dilim bir çizim. Gri daireler eksplantlar alındığı bölgeye işaret etmektedir.
Şekil 2 bir kültür kurulum Diyagramı. Boncuk mevduat proteinlerin kaynağıdır; eksplantları iki tarafına yerleştirilir ve tüm unsurları Matrigel kaplıdır.
Şekil 3. Kadran (boncuk mevduat doğru oklar noktası) tarafından renkli hücre parça Sorumlu araziler. Sağdaki hücre parçaları hücreleri çekmek için görünür fraksiyonu-Ge, doğru geçiriyorsanız; soldaki hücreleri göç hücreleri geri püskürtmek için görünür fraksiyonu, doğru göç.
Şekil 4. A) bir eksplant dışına göç eden hücreler büyüyen bir bulut gösteren seçilmiş timepoints görüntüleri bir dizi. (Ölçek çubuğu 200μm) aşağıda gösterildiği gibi bir ok ile gösterilen bir örnek hücre, zaman içinde izlenir. Bu eksplant 38 saat canlı görüntüleme ile görüntülendi B) Hücre zaman bir belirtilen bölümünde belirtilen nihai görüntü görüntüleri kayıt başından itibaren eksplant bırakarak hücrelerin görüntülerini burada gösterilir. Hücre tekrarlayan dallanma gösterir (ölçek çubuğu 50μm).
Discussion
Burada kimyasal uyaranlara yanıt olarak sinir hücrelerinin göç davranışlarını incelemek ve analiz etmek için basit bir sistem sunuyoruz. In vitro göç deneyleri, hücre lokomosyon etkileyen ekstrasellüler molekülleri tanımlamak için kullanılır olmuştur . Paradigma, incelenen her bir hücre ile etkileşim kurmak için 3 boyutlu (3D) ortamında sahip olmasını sağlar. Ekstrasellüler matriks (örneğin Hirschberg ve ark '10 ile etkileşim dolayısıyla yoksun, poli-D-lizin kaplı lamel düz bir yüzey üzerinde hareket etmek zorunda hücreleri eksplant göçmen kültürleri üzerinde önemli bir avantaj; 8. Metin ve ark. '07). Ancak hücreleri dikey, yatay özgürlüğü göre, alt kısmında bulunan cam lamel ve nispeten ince Matrigel, üst yüzeyi arasındaki boşluk kısıtlı olarak izleme göç hücrelerinin büyük ölçekli saygı, 2-boyutlu kalır göç. Böyle bir kurulum hala esas olarak 2-boyutlu kalır, daha kolay hareket analizi sağlar. Martini ve ark; GE eksplantlar veya kollajen veya Matrigel gömülü GE hücrelerinin yeniden agrega oluşan Benzer 3D paradigmalar, daha önce, hücrelerin kimyasal ipuçları (örneğin Liodis ve ark '07 kaynağı olarak belirli bir sinyal protein ifade agrega kullanılarak istihdam edildi al '09. Nóbrega-Pereira ve arkadaşları '08; Wichterle ark '03). Burada sunulan yöntem, proteinleri orta doğrudan eklenen daha yüksek olan yerel çevre, sürdürülebilir bir düzeyde, izin sistemi, özellikle uygun hale yapıştırılır proteinleri ile lateks boncuk şeklinde yavaş salınımlı sistemi kullanır mevcut miktar protein proteinlerin karmaşık bir karışımı test zaman sınırlı veya. Boncuk seçim lateks bazlı ürünler sınırlıdır ve diğer malzemeler, örneğin agaroz boncuk, her biri farklı özelliklere sahip. Testinin yoğunluğu daha da artırmak için, biz iki zıt tarafta boncuk mevduat apposed eksplantlar kullandı. Kökenli belirli bir alan sağlamak için, biz, bir hücre kaynağı olarak ganglion eminens eksplantlar var. Biz ganglion eminens medial ve lateral kısımları farklılıklar değerlendirildi, ancak herhangi bir farklılık görmedim. Biz bu çalışmada ferrets kullandığı işaret etmelidir; bu türün medial ve lateral ganglion eminences (. Poluch ve ark '08) kemirgenlerde daha önce sigorta. Kültürleri yapıldığı zaman (P0), medial ve lateral ganglion eminences neokorteks doldurmamak birçok hücre, halen üretilen ve göç ediliyor olsa da, erimiş. Ancak gerçek anlamda homojen bir hücre kaynağı tercih edilir, bir hücre süspansiyonu disseke doku hazırlıklı olmak ve doğrudan Matrigel ile karışık, ya da alternatif olarak aşağı doğru bükülmüş ve çıkan pelet 'eksplantlar' yapmak için yumrukladı. Proteolitik aktivite bile kalan izleri deney boyunca Matrigel sıvılaştırılması için enzimatik doku sindirim hücre süspansiyonu hazırlamak için kullanımı önerilmez. Ayrıca, due diligence, kültür kurulum zamanlama uygulanacak. Matrigel ısınmanın bir dönemde, hatta biraz daha uzun süre kurutma hava nedenleri ve sonuçları göç hücreleri aşılmaz ve silinemez hangi bir kabuk Matrigel küçük damla maruz kalma (Bu protokolde kullanılan) polimerize gerektirmesine rağmen taze Matrigel sonraki kaplayarak.
Disclosures
Hayvan kullanımı: hayvanları da içeren tüm prosedürler USUHS ve NIH kurumsal yönergeler doğrultusunda gerçekleştirilen ve USUHS IACUC tarafından kabul edildi.
Acknowledgments
Bu çalışma, DoD Hibe PT074620 (SLJ) ve NIH Hibe R01NS245014 (SLJ) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
| Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |
References
- Caviness, V. S. Jr, Rakic, P. Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice. Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).
- Gelman, D. M., Martini, F. J., Nóbrega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Marín, O. The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons. J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).
- Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia. Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).
- Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., Götz, M., Offermanns, S., Kuner, R. Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis. Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).
- Hatten, M. E. Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain. Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).
- Hatten, M. E. Central nervous system neuronal migration. Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).
- Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).
- Métin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Molnár, Z. Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development. Development. 134, 2815-2827 (2007).
- Martini, F. J., Valiente, M., López Bendito, G., Szabó, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Marín, O. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. , 136-1341 (2009).
- Nóbrega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Marín, O. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59, 733-745 (2008).
- Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. New directions for neuronal migration. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).
- Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia. Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).
- Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
- Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres. Biotechniques. 23, 928-937 (1997).
- Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).
- Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).
