Summary
في هذا البروتوكول التعبير الجيني ، في الخميرة (
Abstract
في هذا البروتوكول ، ويتم تغيير الجينات في الخميرة (خميرة السكيراء) بعد التعرض لالاكسدة التي تسببها إضافة بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) ، وعامل مؤكسد. في التجربة ، ويزرع الخميرة لمدة 48 ساعة في مرق YPD 1/2X تحتوي على الجلوكوز 3X. يتم تقسيم الثقافة الى مجموعة المراقبة والمعالجة. يتم التعامل مع الثقافة التجربة مع 0.5 مم H 2 O 2 هانكس في التخزين المؤقت المالحة (HBSS) لمدة 1 ساعة. يتم التعامل مع سيطرة ثقافة HBSS فقط. يتم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من كل الثقافات ويتم تحويلها إلى البيوتين المسمى كرنا المنتج من خلال عملية متعددة الخطوات. أخذ المنتج التجميع النهائي مرة أخرى إلى الأساسية UVM مرفق ميكروأري والمهجنة للGeneChips Affymetrix الخميرة. يتم تحميلها على التعبير الجيني البيانات الناتجة في صناعة البرمجيات المعلوماتية الحيوية تحليل البيانات.
Protocol
Discussion
Disclosures
وقد رعت إنتاج هذه المادة عن طريق الفيديو EMD - ميليبور.
Acknowledgments
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Spetrophotometer | |||
Thermocyler | |||
Microcentrifuge | |||
Vortex | |||
Stir Plates (2) | |||
P-10s pipettors | |||
P-20's pipettors: | |||
P-200's pipettors: | |||
P-1000's pipettors: | |||
Camera and transilluminator | |||
E-Gel Apparatus | Invitrogen | G6000-08 | |
E-Gels | Invitrogen | G6018-02 | |
Axygen 1.7 ml. Clear | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT175C | |
Axygen 0.5 ml clear tubes | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT060C | |
Axygen 2ml capture tubes | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT200NC | |
boxes of P-10 ART tips: | CLP | BT10XL | |
Boxes of P-100 ART tips: | CLP | BT200 | |
Boxes of P-20 ART Tips: | CLP | BT20 | |
Boxes of P-1000 ART Tips: | CLP | BT1000 | |
Yeast Chips | |||
25 ml sterile disposable pipets- | |||
5ml sterile disposable pipets- | |||
Microfuge tube racks | |||
KimWipes: | |||
Lab Coats | |||
Stir Bars | |||
Culture flasks | |||
Innoculating loops | |||
Sharpies | |||
Gloves | |||
Autoclave tape | |||
Stirrer bars | |||
30% Hydrogen Peroxide | EMD Millipore | 386790 | |
HBSS without Ca, Mg, or dye | Sigma-Aldrich | H6648-100ml | |
Qiagen Rneasy Mini Kit: | Qiagen | 74104 | |
Qiagen DNase Kit: | Qiagen | 79254 | |
Rnase Remover | Denville Scientific | D1180 | |
Harleco Alcohol 100% | EMD Millipore | 65347 | |
ENZO IVT Kit | Enzo Life Sciences | ENZ-42655-10 | |
Lyticase: one bottle | VWR international | IC19012310 | |
Water, Cell Culture grade | EMD Millipore | 4.86505 | |
Yeast culture: | ATCC | 18824 | |
YPD broth powder | EMD Millipore | 4.8504 | |
D(+) Glucose, Anhydrous | EMD Millipore | 346351 | |
Sorbitol | EMD Millipore | 56755 | |
EDTA | EMD Millipore | 4005 | |
SDS solution, 20% | EMD Millipore | 7990-OP | |
Pellet Paint | EMD Millipore | 69049 | |
PCI RNase DNase free (7 aliquots): | Fisher Scientific | AC32711-500 | |
7.5M NH4OAc | Fisher Scientific | ICN1987 5980 | |
Fragmentation Buffer (200 mM Tris-Acetate, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA) | |||
Trizma Base | Fiaher | 50-899-90034 | |
KOAc | Fisher Scientific | NC9757725 | |
MgOA | Fisher Scientific | NC9681042 | |
Loading Dye | Invitrogen | 10482055 | |
PCR Markers | EMD Millipore | 69278-3 | |
Phase Lock Gels | Fisher Scientific | FP2302820 | |
One-Cycle cDNA Kit | Invitrogen | A10752-030 | |
Includes; | |||
E. coli DNA Pol | |||
dNTP's | |||
T4 DNA Pol. | |||
T-7 oligod(T) | |||
0.5ml EDTA pH 8.0 | |||
First Strand Buffer | |||
E. Coli RNaseH | |||
Second Strand Buffer | |||
E. Coli DNA ligase | |||
SuperScript II | |||
DTT |
References
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., Kao, C. M., Carmel-Harel, O., Eisen, M. B., Storz, G., Botstein, D., Brown, P. O. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 11, 4241-4257 (2000).
- D'Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
- Shenton, D., Smirnova, J. B., Selley, J. N., Carroll, K., Hubbard, S. J., Pavitt, G. D., Ashe, M. P., Grant, C. M. Global translational responses to oxidative stress impact upon multiple levels of protein synthesis. J Biol Chem. 281, 29011-29021 (2006).
- Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J. M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M. B., Labarre, J. The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 273, 22480-229 (1998).
- Vermont Genetics Network. Microarray Outreach. , (2008).
- Affymetrix GeneChip Expression Analysis: Technical Manual. , Affymetrix. Santa Clara, CA. (2004).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Dennis, G. Jr, Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery. Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).