Summary
Dans ce protocole d'expression génique, chez la levure (
Abstract
Dans ce protocole, l'expression des gènes dans la levure (Saccharomyces cerevisiae) est modifié après l'exposition au stress oxydatif induit par l'ajout de peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2), un agent oxydant. Dans l'expérience, la levure est cultivée pendant 48 heures dans un bouillon YPD 1/2X contenant du glucose 3X. La culture est divisé en un contrôle et un groupe traité. La culture expérimentation est traitée avec 0,5 mM de H 2 O 2 dans Hanks saline tamponnée (HBSS) pendant 1 heure. La culture de contrôle est traitée avec HBSS uniquement. L'ARN total est extrait de deux cultures et est convertie en un produit marqué à la biotine ARNc à travers un processus en plusieurs étapes. Le produit de synthèse final est repris à l'installation de base UVM biopuces et hybridé à l'GeneChips levures Affymetrix. Les données résultant d'expression génique sont téléchargés dans le logiciel d'analyse de données bioinformatiques.
Protocol
Discussion
Disclosures
La production de cette vidéo article a été parrainé par EMD-Millipore.
Acknowledgments
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Spetrophotometer | |||
Thermocyler | |||
Microcentrifuge | |||
Vortex | |||
Stir Plates (2) | |||
P-10s pipettors | |||
P-20's pipettors: | |||
P-200's pipettors: | |||
P-1000's pipettors: | |||
Camera and transilluminator | |||
E-Gel Apparatus | Invitrogen | G6000-08 | |
E-Gels | Invitrogen | G6018-02 | |
Axygen 1.7 ml. Clear | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT175C | |
Axygen 0.5 ml clear tubes | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT060C | |
Axygen 2ml capture tubes | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT200NC | |
boxes of P-10 ART tips: | CLP | BT10XL | |
Boxes of P-100 ART tips: | CLP | BT200 | |
Boxes of P-20 ART Tips: | CLP | BT20 | |
Boxes of P-1000 ART Tips: | CLP | BT1000 | |
Yeast Chips | |||
25 ml sterile disposable pipets- | |||
5ml sterile disposable pipets- | |||
Microfuge tube racks | |||
KimWipes: | |||
Lab Coats | |||
Stir Bars | |||
Culture flasks | |||
Innoculating loops | |||
Sharpies | |||
Gloves | |||
Autoclave tape | |||
Stirrer bars | |||
30% Hydrogen Peroxide | EMD Millipore | 386790 | |
HBSS without Ca, Mg, or dye | Sigma-Aldrich | H6648-100ml | |
Qiagen Rneasy Mini Kit: | Qiagen | 74104 | |
Qiagen DNase Kit: | Qiagen | 79254 | |
Rnase Remover | Denville Scientific | D1180 | |
Harleco Alcohol 100% | EMD Millipore | 65347 | |
ENZO IVT Kit | Enzo Life Sciences | ENZ-42655-10 | |
Lyticase: one bottle | VWR international | IC19012310 | |
Water, Cell Culture grade | EMD Millipore | 4.86505 | |
Yeast culture: | ATCC | 18824 | |
YPD broth powder | EMD Millipore | 4.8504 | |
D(+) Glucose, Anhydrous | EMD Millipore | 346351 | |
Sorbitol | EMD Millipore | 56755 | |
EDTA | EMD Millipore | 4005 | |
SDS solution, 20% | EMD Millipore | 7990-OP | |
Pellet Paint | EMD Millipore | 69049 | |
PCI RNase DNase free (7 aliquots): | Fisher Scientific | AC32711-500 | |
7.5M NH4OAc | Fisher Scientific | ICN1987 5980 | |
Fragmentation Buffer (200 mM Tris-Acetate, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA) | |||
Trizma Base | Fiaher | 50-899-90034 | |
KOAc | Fisher Scientific | NC9757725 | |
MgOA | Fisher Scientific | NC9681042 | |
Loading Dye | Invitrogen | 10482055 | |
PCR Markers | EMD Millipore | 69278-3 | |
Phase Lock Gels | Fisher Scientific | FP2302820 | |
One-Cycle cDNA Kit | Invitrogen | A10752-030 | |
Includes; | |||
E. coli DNA Pol | |||
dNTP's | |||
T4 DNA Pol. | |||
T-7 oligod(T) | |||
0.5ml EDTA pH 8.0 | |||
First Strand Buffer | |||
E. Coli RNaseH | |||
Second Strand Buffer | |||
E. Coli DNA ligase | |||
SuperScript II | |||
DTT |
References
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