इस प्रोटोकॉल में, खमीर में जीन की अभिव्यक्ति (<em> Saccharomyces cerevisiae</em>) बदल जाता है oxidative तनाव के लिए जोखिम के अलावा हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच द्वारा प्रेरित के बाद<sub2></sub> हे<sub2></sub>), एक ऑक्सीकरण एजेंट.
इस प्रोटोकॉल में, खमीर (Saccharomyces cerevisiae) में जीन की अभिव्यक्ति बदल रहा है हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 2 हे) के अलावा, एक ऑक्सीकरण एजेंट के द्वारा प्रेरित oxidative तनाव के लिए प्रदर्शन के बाद . प्रयोग में, 48 घंटे के लिए खमीर 1/2X YPD 3X ग्लूकोज युक्त शोरबा में उगाया जाता है. संस्कृति एक नियंत्रण और इलाज समूह में विभाजित है. प्रयोग संस्कृति 0.5 मिमी एच 2 हैंक्स में 2 हे के साथ व्यवहार किया जाता है 1 घंटे के लिए खारा (HBSS) buffered. नियंत्रण संस्कृति केवल HBSS के साथ व्यवहार किया जाता है. कुल शाही सेना दोनों संस्कृतियों से निकाली गई है और एक multistep प्रक्रिया के माध्यम से एक बायोटिन लेबल क्रेना उत्पाद में कनवर्ट. अंतिम संश्लेषण उत्पाद UVM माइक्रोएरे कोर सुविधा वापस ले लिया है और Affymetrix खमीर GeneChips संकरित. जिसके परिणामस्वरूप जीन अभिव्यक्ति डेटा जैव सूचना विज्ञान डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में अपलोड कर रहे हैं.
The authors have nothing to disclose.
General Laboratory Equipment | Company | Product number |
Spetrophotometer | ||
Thermocyler | ||
Microcentrifuge | ||
Vortex | ||
Stir Plates (2) | ||
P-10s pipettors | ||
P-20’s pipettors: | ||
P-200’s pipettors: | ||
P-1000’s pipettors: | ||
Camera and transilluminator | ||
Supplies – recommended | ||
E-Gel Apparatus | Invitrogen | G6000-08 |
E-Gels | Invitrogen | G6018-02 |
Axygen 1.7 ml. Clear | Krackler | 383-MCT175C |
Axygen 0.5 ml clear tubes | Krackler | 383-MCT060C |
Axygen 2ml capture tubes | Krackler | 383-MCT200NC |
boxes of P-10 ART tips: | CLP | BT10XL |
Boxes of P-100 ART tips: | CLP | BT200 |
Boxes of P-20 ART Tips: | CLP | BT20 |
Boxes of P-1000 ART Tips: | CLP | BT1000 |
Yeast Chips | ||
General Laboratory Supplies | ||
25 ml sterile disposable pipets- | ||
5ml sterile disposable pipets- | ||
Microfuge tube racks | ||
KimWipes: | ||
Lab Coats | ||
Stir Bars | ||
Culture flasks | ||
Innoculating loops | ||
Sharpies | ||
Gloves | ||
Autoclave tape | ||
Stirrer bars | ||
Reagents | ||
30% Hydrogen Peroxide | EMD Millipore | 386790 |
HBSS without Ca, Mg, or dye | Sigma-Aldrich | H6648-100ml |
Qiagen Rneasy Mini Kit: | Qiagen | 74104 |
Qiagen DNase Kit: | Qiagen | 79254 |
Rnase Remover | Denville Scientific | D1180 |
Harleco Alcohol 100% | EMD Millipore | 65347 |
ENZO IVT Kit | ENZO | ENZ-42655-10 |
Lyticase: one bottle | VWR | IC19012310 |
Water, Cell Culture grade | EMD Millipore | 4.86505 |
Yeast culture: | ATCC | 18824 |
YPD broth powder | EMD Millipore | 4.8504 |
D(+) Glucose, Anhydrous | EMD Millipore | 346351 |
Sorbitol | EMD Millipore | 56755 |
EDTA | EMD Millipore | 4005 |
SDS solution, 20% | EMD Millipore | 7990-OP |
Pellet Paint | EMD Millipore | 69049 |
PCI RNase DNase free (7 aliquots): | Fisher | AC32711-500 |
7.5M NH4OAc | Fisher | ICN1987 5980 |
Fragmentation Buffer (200 mM Tris-Acetate, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA) | ||
Trizma Base | Fiaher | 50-899-90034 |
KOAc | Fisher | NC9757725 |
MgOA | Fisher | NC9681042 |
Loading Dye | Invitrogen | 10482055 |
PCR Markers | EMD Millipore | 69278-3 |
Phase Lock Gels | Fisher | FP2302820 |
One-Cycle cDNA Kit | Invitrogen | A10752-030 |
Includes; | ||
E. coli DNA Pol | ||
dNTP’s | ||
T4 DNA Pol. | ||
T-7 oligod(T) | ||
0.5ml EDTA pH 8.0 | ||
First Strand Buffer | ||
E. Coli RNaseH | ||
Second Strand Buffer | ||
E. Coli DNA ligase | ||
SuperScript II | ||
DTT |