Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Gericht Ion Beam Frezen en Scanning Electron Microscopy van hersenweefsel

Published: July 6, 2011 doi: 10.3791/2588

Summary

Dit protocol beschrijft hoe hars ingebed hersenweefsel kan worden voorbereid en afgebeeld in de drie dimensies in de gerichte ion beam, scanning electronen microscoop.

Abstract

Dit protocol beschrijft hoe biologische monsters, zoals hersenweefsel, kunnen worden afgebeeld in drie dimensies met behulp van de gerichte ionenbundel / scanning electronen microscoop (FIB / SEM). De monsters worden bevestigd met aldehyden, heavy metal gekleurd met osmium tetroxide en uranylacetaat. Ze worden vervolgens gedehydrateerd met alcohol en geïnfiltreerd met hars, die vervolgens is verhard. Met behulp van een lichtmicroscoop en ultramicrotoom met glas messen, is een klein blok met de regio rente dicht bij het oppervlak. Het blok wordt dan geplaatst in het FIB / SEM, en de ion beam gebruikt om ongeveer molen een verticale gezicht langs een kant van het blok, niet ver van deze streek. Met behulp van teruggekaatste elektronen aan het imago van de onderliggende structuren, is een kleiner gezicht vervolgens vermalen met een fijnere ionenbundel en het oppervlak onderzocht beter om de exacte oppervlakte van het gezicht af te beelden en gefreesd te bepalen. De parameters van de microscoop wordt dan zo ingesteld dat het gezicht herhaaldelijk is gefreesd en gescand, zodat seriële beelden worden verzameld via een volume van het blok. Het beeld stack bevat doorgaans isotrope voxels met afmetingen zo klein een 4 nm in elke richting. Dit beeldkwaliteit in elke imaging vlak stelt de gebruiker in cel ultrastructuur te analyseren op elke kijkhoek in het beeld stack.

Protocol

1. Sample fixatie en hars inbedding

  1. Monsters van verse weefsels en cellen worden vastgesteld voor ten minste 2 uur in 2% paraformaldehyde, en 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer bij een pH van 7,4. Omvang van de steekproef moet 0.150 mm niet hoger zijn dan in de dikte om voldoende penetratie of fixeermiddel toe te staan, en mag niet worden achtergelaten in de correctie voor langer dan 12 uur.
  2. Plaats de monsters in 20 ml glazen scintillatieflesjes en spoel ze drie keer, 5 minuten elk, in 0,1 M cacodylate buffer.
  3. Vlek met 1,5% (w / v) kaliumferrocyanide en 1% (w / v) osmium tetroxide in 0,1 M cacodylate buffer (0,1 M, pH 7,4) gedurende 30 minuten.
  4. Vlek met 1,0% (w / v) osmium tetroxide in 0,1 M cacodylate buffer gedurende 30 minuten.
  5. Spoel een keer met dubbel gedestilleerd water gedurende 3 minuten.
  6. Vlek met 1% (w / v) uranylacetaat in dubbel gedistilleerd water gedurende 30 minuten.
  7. Spoel secties voor 5 minuten in dubbel gedistilleerd water en vervolgens drogen in gegradeerd alcohol series, op 2 minuten elke verandering (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%).
  8. Insluiten in toenemende concentraties van Durcupan hars gemengd met ethanol, 30 minuten elke verandering, te beginnen bij 50% Durcupan in ethanol, gevolgd door: 70%, 90%, 95%, en vervolgens 100%.
  9. Vervangen met verse Durcupan en schud langzaam gedurende 4 uur.
  10. Plaats delen, met behulp van een houten cocktailprikkers, op glas microscopen dia's bedekt met schimmel scheidingsmiddel, en plaats in 65 ° C oven gedurende 24 uur.

2. De voorbereiding van de steekproef voor de FIB / SEM

  1. Scheiden de harslaag, met de monsters, van tussen de twee glazen microscoopglaasjes en was grondig aan alle schimmels scheidingsmiddel te verwijderen.
  2. Met behulp van een doorvallend licht microscoop met een laag stroomverbruik doelstellingen, of ontleden microscoop met doorvallend verlichting, in de regio van belang vast te stellen binnen het deel van hars.
  3. Snijd een klein (3 mm x 3 mm) vierkant rond de regio van belang met behulp van een scheermesje en plak dit aan de bovenkant van blanco hars blok met acryl lijm (figuur 1). 5 minuten wachten voor de lijm uit te harden, en ga dan verder met de volgende stap.
  4. Klem het blok in de houder van de ulramicrotome en met behulp van de bijgevoegde stereomicroscoop, trim rond de regio van belang met een scheermesje totdat er slechts een kleine piramide van het materiaal blijft.
  5. Verdere afwerking het blok, met een glazen mes vast in de ultramicrotoom, zodat de regio van belang kan exact worden gelokaliseerd ten opzichte van de afmetingen van het oppervlak van het blok (figuur 1). Snij een rand van het blok, dicht bij de regio van belang zijn, zodat een loodrechte stap wordt gesneden door het monster (zie figuur 1 en 2). Deze stap vormt de beeldvorming gezicht (figuur 2).
  6. Verwijder het blok van de ultramicrotoom en foto's in de regio van belang binnen het blok, met behulp van een doorvallend licht microscoop.
  7. Weggesneden de bijgesneden blok van de resterende hars stub. Dit wordt gedaan met behulp van een juwelier zag en zorgt ervoor dat slechts een klein blok is geplaatst in het FIB / SEM. De totale hoogte van dit blok mag niet meer dan 5 mm.
  8. Lijm het blok aan een aluminium stub met carbon pasta ervoor te zorgen dat de zijde die moet worden afgebeeld is op de buitenste rand (figuur 1).
  9. Nadat de lijm droog is, de vacht van de blok met een dun laagje goud (> 20 nm; Cressington vacuüm verdamping systeem).

3. Beeldvorming in de FIB / SEM

  1. Bij een lage vergroting, en het gebruik van secundaire elektronen imaging (5 kV, 0,5 NAMP), richten het blok, zodat de gekozen regio van belang en de zijkant van het blok worden afgebeeld wordt geconfronteerd met de operator (figuur 2 c, d).
  2. Orient het blok zodat het gezicht af te beelden ligt parallel aan het frezen balk. Dit betekent dat elektronenbundel is gericht op 54 ° ten opzichte van dit gezicht (figuur 2 b).
  3. Met behulp van een ionenbundelstroom van 13 tot 27 Namps bij 30 kV verwijderen van een smalle band van hars van de voorkant van de regio af te beelden.
  4. Schakel over naar teruggestrooide imaging-modus om de gefreesde gezicht dat de regio van belang ligt over te geven.
  5. Met behulp van de lichtmicroscopie referentie-afbeelding (genomen op stap 16) en het beeld van de gemalen gezicht vinden van de exacte regio op het blok te worden gefreesd en afgebeeld (figuur 2).
  6. Stort een beschermende laag (ongeveer 1 micron dik) van koolstof (of metaal), met behulp van de gas-injectie systeem van de microscoop, op het oppervlak van het blok, boven de regio van belang (figuur 2).
  7. Met behulp van een stroom van 700 picoAmps, fijn molen de regio van het blok waarbinnen de uiteindelijke beelden zullen worden genomen.
  8. Laat de frezen straal volledig molen dit beeld het gezicht tot er geen frees-artefacten te zien op het gezicht. Een complete molen van het gezicht wordt gecontroleerd door het observeren van veranderingen in elke volgende afbeelding over het hele gezichtsveld. Onvoldoende frezen kan ook gezien worden als witte strepen of 'gordijnen' die verschijnt Vertically in het beeld.
  9. Laat de microscoop voor een minimaal 2 uur voor een thermische veranderingen te verspreiden. Dit vermindert het risico dat het blok gezicht zal drijven tijdens de beeldvorming, wat resulteert in verkeerd uitgelijnde beelden.
  10. Selecteer de microscoop parameters voor beeldvorming van het gezicht serieel. Zorg ervoor dat de elektronenbundel een spanning die laag genoeg is om alleen het imago van een zeer ondiepe diepte van het materiaal in het blok gezicht. Dit moet ook veel minder diep zijn dan de dikte van het gezicht te worden verwijderd. Typische parameters voor beeldverwerking zijn spanningen tussen de 1,2 tot 2,0 kV met een pixel grootte van tussen 4 - 20 nm. De pixelverblijftijd moet worden gehouden, ongeveer 10 μsecs, zodat de totale tijd te frezen het gezicht en het verwerven van een beeld in stand wordt gehouden onder de 2 minuten (Figuur 3).

4. Geheimen tot succes

Stap 1) Zorg ervoor dat de monsters niet dikker zijn dan 150 micron. Dit zal een adequate penetratie van de verschillende vlekken en hars in het materiaal. Dit kan worden bereikt door het snijden van de monsters met een vibratome onmiddellijk na de vastlegging. Deze dikte is geschikt voor hersenweefsel. Andere weefsels moeten worden getest om een adequate fixatie en vlekken zorgen.

Stap 3) De monsters moeten vrij verspreid worden door de oplossing, en niet samengeklonterd samen in een deel van de flacon, terwijl deze secundaire fixatief wordt geïntroduceerd. Dit zal zorgen voor een maximale penetratie van het monster en vermindering van het monster te worden vervormd tijdens dit fixatie proces. Dit wordt bereikt door voorzichtig schudden de monsters binnen de flacon direct na de oplossing wordt toegevoegd.

Stap 15) Zorg ervoor dat de regio van belang direct ligt onder (<30 micron) het oppervlak van het blok. Dit vermindert de hoeveelheid frezen door de ionenbundel tijdens de beeldacquisitie fase.

Stap 22) De scantijd van de ionenbundel moet worden adequte om ervoor te zorgen dat de hele beeldvorming gezicht volledig is gefreesd. Onvoldoende frezen wordt getoond als witte strepen, of 'gordijnen' die verschijnt verticaal naar beneden de beeldvorming gezicht.

Stap 26) Het uiteindelijke gefreesd gezicht moet groter zijn dan het gezicht dat is afgebeeld. Dit komt omdat de gemalen hars wordt uitgeworpen uit het blok en redeposits op het blok oppervlakte in de directe omgeving. Dit redeposition kan inbreuk maken op de beeldvorming gezichtsveld, en wordt vermeden door frezen een veel groot gebied dan is afgebeeld. Voor een imaging venster dat is 20 micrometer breed, de gefreesd blok gezicht is groter dan 30 micron breed.

Stap 29) Het is cruciaal dat de elektronenbundel parameters zijn zodanig dat het beeld wordt gegenereerd door elektronen die voortkomen uit alleen de eerste paar nanometer van het oppervlak van het blok. Dit is een acheved door het minimaliseren van de spanning tot onder 2 kV en ervoor te zorgen dat er geen elektronen dringen te ver. Dit wordt ook geholpen met behulp van een netspanning op de detector, zodat alleen de elektronen met de hoogste energie dragen bij aan het uiteindelijke beeld. Meestal wordt een raster spanning van 1,3 kV gebruikt voor een beeldvorming spanning van 1,5 kV.

5. Representatieve resultaten:

Figuur 1
Figuur 1. Voorbereiding van de hars te blokkeren. A) Resin embedded coronale deel (80 micron dik) door middel van een volwassen hersenen van de rat gezien in een steromicroscope. Het beeld toont duidelijk de verschillende hersengebieden die kan worden gesneden uit de sectie (b) met behulp van een scalpel. Hier wordt een 1 mm vierkant van de cortex verwijderd en (c) vast aan een blanco hars blok. D) De hars blok wordt vervolgens afgewerkt met een glazen mes gemonteerd in een ultramicrotoom, en zodra het blok is teruggebracht tot slechts verlaten regio van belang (e), is een stap loodrecht gesneden om de voorzijde van de embedded materiaal. f) Dit hele gebied is afgezet knip dan van de rest van de hars en gemonteerd op een aluminium stub klaar voor metaal coating en beeldvorming in de scanning electronen microscoop.

Figuur 2
Figuur 2. Voorbereiden het blok gezicht voor FIB / SEM beeldvorming. A) en b) tonen illustraties van het blok en de rand, dat is gefreesd om de beeldvorming gezicht (aangegeven met de zwarte dubbele pijl) te maken. De positie van de ion beam (wit) is parallel getoond aan de beeldvorming gezicht en de elektronenbundel (grijs) wordt weergegeven raken van het gezicht op 54 ° ten opzichte van de ion-beam. C) een aanzicht van het blok gezet met de elektronenbundel en afgebeeld met de secundaire elektronen. Langs deze kant van het blok een donkerder gebied (aangegeven met een gestippelde witte vak) toont een deel van het gezicht dat is ruwweg is gefreesd (weergegeven met dubbele koped zwarte pijl) om de onderliggende monster te onthullen. d) Als deze regio is afgebeeld met alleen de teruggekaatste elektronen het ingebed weefsel kan worden gezien. Hier is de volledige breedte van de embedded weefselsectie aangegeven met een dubbele leiding witte pijl. Schaalbalk in c) is 100 micron.

Figuur 3
Figuur 3. Imaging het een volume van het hersenweefsel met isotrope voxels. A) Reversed contrast teruggekaatste beeld van het blok gezicht met de ultrastructuur binnen een regio van de hersenen van de rat. Alle membranen zijn zichtbaar als grote macromoleculaire structuren. B) Een totaal van 1600 foto's werden verzameld op 5 nm afstand resulteert in een beeld stack met isotrope voxels. C) Deze stack kan worden afgebeeld in een vliegtuig met dezelfde resolutie. Dit beeld toont enkele synaptische verbinding die is afgebeeld in het xy vlak en de YZ-vlak.

Discussion

De techniek van FIB / SEM werkt optimaal als de regio van belang is niet te groot is. De bovengrens voor een afgebeeld volume is afhankelijk van de ion beam en het gebied dat het consequent molen herhaaldelijk gedurende vele uren. Tot nu toe dit is gedaan met gebieden van ongeveer 60 x 60 micron, echter, imaging dit hele gebied is niet mogelijk met een geschikte beeldresolutie, voornamelijk als gevolg van de factor tijd in het verzamelen van dergelijke een grote afbeelding. Als een voorbeeld, een 4 kx 4 k beeld met een pixelverblijftijd tot 10 microseconden zou 2 minuten en 40 seconden te verwerven te nemen, en voor een beeldhoek van 60 micron dit zou geven slechts een pixelgrootte van 15 nm. Voor beeldvorming van de ultrastructuur van cellen en weefsels, een kleinere pixelgrootte is meer geschikt is, meestal tussen de 4 en 10 nm / pixel. Voor een oppervlakte van 60 x 60 micron het beeld zou worden overgenomen in 10 uur, ook als de microscoop had deze mogelijkheid. Om deze redenen, de microscoop is een ideaal hulpmiddel voor het imago van volumes in de orde van 10 x 10 x 10 micrometer, of belangrijke regio's van gehele cellen. Dit kan eenvoudig worden gedaan binnen een periode van 48 uur op monsters die zijn goed in contrast met deze procedure.

Tot nu toe het protocol is voornamelijk gebruikt met hersenweefsel, evenals verschillende soorten gekweekte zoogdiercellen vast te houden aan dekglaasjes. Echter, de fixatie en kleuring gebruikt worden met vele andere soorten van biologisch materiaal, met inbegrip van fabrieken materiaal om even goed contrasterende beelden stacks te produceren.

Daarom is het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om de afbeelding volumes met isotrope voxels. Afbeelding stapels van dit type zorgen voor analyses van de 3D-volume met behulp van beelden die op elk vlak in de stapel. Het voordeel hiervan is om de toeschouwer te laten beeldkenmerken in het beeld-serie vanuit elke richting en het verstrekken van een grotere afbeelding detail (figuur 3).

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanoacrylate glue
Dissecting microscope: Leica MZ8 Leica Microsystems
Durcupan resin Sigma-Aldrich
FIB/SEM microscope (Zeiss, NVision 40)
Glass histology slides Menzel-Glaser AA00008032E
Glass knife maker: Leica EM KMR2 Leica Microsystems
Glass scintillation vials (20ml) EMS 72634
Glutaraldehyde EMS 16222
Jeweler’s saw EMS 72010
Mould separating agent Glorex, Switzerland 62407445
Osmium tetroxide EMS 19110
Paraformaldehyde EMS RT 19208
Phosphate salts for phosphate buffer Sigma-Aldrich 71642 and 71496
Sodium cacodylate Sigma-Aldrich 20840
Sputter Coater with gold target Cressington Co.
Tris base (TBS) Sigma-Aldrich T1378
Ultramicrotome: Leica UCT Leica Microsystems
Uranyl acetate EMS RT 22451

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).
  2. Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue. J Microsc. 235, 336-347 (2009).
  3. Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy. PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).
Gericht Ion Beam Frezen en Scanning Electron Microscopy van hersenweefsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue. J. Vis. Exp. (53), e2588, doi:10.3791/2588 (2011).More

Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue. J. Vis. Exp. (53), e2588, doi:10.3791/2588 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter