पोस्ट translational संशोधन की एलिसा द्वारा मूल निवासी बरकरार Nucleosomes पर जांच
Summary
Nucleosome एलिसा (NU एलिसा) एक संवेदनशील और मात्रात्मक देशी, अक्षत nucleosomes की तैयारी में बाद translational संशोधनों के वैश्विक पैटर्न का पता लगाने की विधि है. इन संशोधनों methylations, acetylations, और विशिष्ट histone अमीनो एसिड के अवशेष पर phosphorylations शामिल हैं, और इसलिए परमाणु एलिसा विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के समग्र chromatin संशोधन राज्यों के एक वैश्विक प्रोटिओमिक परख प्रदान करता है.
Abstract
eukaryotes के जीनोम chromatin के रूप में मौजूद है जो दोनों के डीएनए और प्रोटीन होते हैं. chromatin की मौलिक इकाई nucleosome है, जो 146 डीएनए के आधार जोड़े दो H2A, H2B, H3, और H4 1 histones में से प्रत्येक के साथ जुड़े होते है. Histones के एन टर्मिनल पूंछ lysine और arginine में धनी होते हैं और एसिटिलीकरण, मेथिलिकरण, और अन्य बाद translational संशोधनों (PTMs) के बाद transcriptionally संशोधित. Nucleosomes के PTM विन्यास जुड़े डीएनए के transcriptional गतिविधि को प्रभावित करते हैं, इस प्रकार जीन विनियमन की एक विधा है कि 2,3 प्रकृति में epigenetic है प्रदान कर सकते हैं. हम एक nucleosome एलिसा (NU एलिसा) मात्रात्मक कोशिकाओं से निकाले nucleosomes की वैश्विक PTM हस्ताक्षर निर्धारित करने के लिए बुलाया विधि विकसित की है. परमाणु – एलिसा और अधिक संवेदनशील और सोख्ता पश्चिमी मात्रात्मक है, और विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के epiproteomic राज्य पूछताछ के लिए उपयोगी है. यह वीडियो पत्रिका आलेख विस्तृत प्रक्रियाओं का पता चलता है कि परमाणु – एलिसा विश्लेषण करने के लिए.
Protocol
Discussion
परमाणु – एलिसा nucleosome एक विशेष सेल प्रकार के भीतर मौजूद PTMs की वैश्विक स्थिति का पता लगाने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. परमाणु – एलिसा अध्ययन से पता चला है कि वैश्विक nucleosome संशोधन राज्यों मुक़्तलिफ़ सेल 4 प्रकार की तुलना में अलग हैं. इसके अलावा, परमाणु एलिसा PTM प्रोफाइल बदल जब कोशिकाओं जैसे epigenetic modulatory एजेंट को उजागर कर रहे हैं trichostatin – एक या जब माउस embyronic स्टेम कोशिकाओं 4 भेदभाव कर रहे हैं. विधि को भी सफलतापूर्वक लागू किया गया है है मानव ES 5 कोशिकाओं के chromatin अध्ययन . यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें करने के लिए परमाणु एलिसा, अपने वर्तमान स्वरूप में, केवल सेलुलर epigenome की कुल राशि के भीतर मौजूद PTMs के संयुक्त हस्ताक्षर का पता लगा सकते हैं. इस जीनोम चौड़ा chromatin immunoprecipitation, जो विशिष्ट आनुवंशिक loci भर में एक विशिष्ट PTM का वितरण निर्धारित कर सकते हैं से स्पष्ट रूप से अलग है.
परमाणु – एलिसा प्रक्रियाओं के प्रारंभिक चरणों पिछले तरीकों से अनुकूलित कर रहे हैं स्तनधारी 6,7 नाभिक से mononucleosomes अलग. इन अनुकूलित तरीकों एक समीचीन स्तनधारी कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता बरकरार mononucleosomes प्राप्त करने का तरीका प्रदान करते हैं, और जिसके परिणामस्वरूप भिन्न उनके chromatin सामग्री में व्यापक हैं, लेकिन अतिरिक्त परमाणु सामग्री की एक महान सौदे होते हैं. चूंकि विशिष्ट Abs का उपयोग किया जाता है, गैर nucleosomal सामग्री contaminating NU – एलिसा परख में अच्छी तरह से सहन किया है जन कल्पना दृष्टिकोण है कि अधिक से अधिक शुद्धता की आवश्यकता के विपरीत,. हालांकि, परमाणु – एलिसा पश्चिमी सोख्ता 4, इस प्रकार westerns और nucleosomal PTMs का पता लगाने के लिए बड़े पैमाने पर कल्पना के लिए अच्छा विकल्प प्रदान करने की तुलना में अधिक संवेदनशील और मात्रात्मक है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
परमाणु – एलिसा विधि का विकास NIH अनुदान RO1AG023687 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Micrococcal Nucleae | Sigma | N3755 | Make aliquots of 2 U/10μl buffer, stored at -20°C |
| Nunc MaxiSorp Microtiter Plates | Fisher | 12-565-135 | Adhesive plate covers can also be ordered through Fisher |
| Automated Plate Washer | |||
| 1-Step TMB-ELISA substrate | Pierce | 34028 | Store at 4°C pre-warm to RT before use or as directed on the specification sheet |
| Microtiter Plate Reader | Bio-Rad microplate reader (model: 680) | Most colorimetric plate reader models are suitable |
References
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