Summary
Nucleosoom ELISA (NU-ELISA) is een gevoelige en kwantitatieve methode om de wereldwijde patronen van post-translationele modificaties te detecteren in de voorbereiding van de inheemse, intacte nucleosomen. Deze wijzigingen zijn onder methylations, acetyleringen en fosforylaties op specifieke histon aminozuur residuen, en dus NU-ELISA geeft een globaal proteomics analyse van de totale chromatine modificatie staten van specifieke celtypen.
Abstract
Het genoom van eukaryoten bestaat als chromatine die zowel DNA en eiwitten bevat. De fundamentele eenheid van chromatine is het nucleosoom, die 146 basenparen van DNA geassocieerd met twee elk van de histonen H2A, H2B, H3, H4 en 1 bevat. De N-terminale staarten van histonen zijn rijk aan lysine en arginine en zijn post-transcriptioneel gemodificeerd door acetylering, methylering, en andere post-translationele modificaties (PTMs). De PTM configuratie van nucleosomen kan invloed hebben op de transcriptionele activiteit van het DNA, en zo een manier van genregulatie dat epigenetische in de natuur 2,3. We ontwikkelden een methode genaamd nucleosoom ELISA (NU-ELISA) voor het kwantitatief bepalen wereldwijde PTM handtekeningen van nucleosomen uit cellen. NU-ELISA is gevoeliger en kwantitatieve dan western blotting, en is handig om het epiproteomic staat van specifieke celtypen te ondervragen. Deze video tijdschriftartikel toont gedetailleerde procedures uit te voeren NU-ELISA-analyse.
Protocol
1. Zoogdiercelculturen
NU-ELISA kan worden uitgevoerd op alle zoogdieren celtype dat kan worden gekweekt in cultuur. Wij geven de voorkeur tot matig voor te bereiden op grote hoeveelheden van de cellen, zodat nucleosomen kunnen worden geïsoleerd in voldoende hoeveelheid om een aantal identieke geladen ELISA-platen voor te bereiden, zodat testen met verschillende antilichamen (Abs). De volgende cultuur schalen bieden voldoende materiaal:
Voor muis embyronic stamcellen groeien een of twee 15 cm platen van cellen zonder feeder-cellen. Voor de fibroblasten, groeien 5 tot 10 cm 15 platen tot confluentie.
2. Isolatie van Kernen
Opmerking: Alle stappen zijn op ijs met pre-gekoelde buffers, behalve waar aangegeven.
- Trypsinize cellen met 3 ml trypsine per plaat, combineren, en voeg 20 ml ijskoud PBS / butyraat. Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de cellen in 10 ml PBS / butyraat en centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer in 4 ml lysis buffer met proteaseremmers (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce homogeniseren 20 slagen met type B stamper op ijs.
- Centrifugeer bij 2000g gedurende 10 min bij 4 ° C. (Het supernatant bevat cytoplasma, wat niet nodig is voor dit protocol, maar het kan bewaard worden voor andere doeleinden worden indien gewenst).
- Resuspendeer de pellet in 2 ml ijskoude wasbuffer C (met protease-remmers).
- Laag de geresuspendeerde materiaal meer dan 5 ml 30% sucrose kussen, centrifugeer bij 2400G gedurende 5 minuten in een swingende emmer rotor. Kernen zal migreren door kussen, en het puin blijft in de interface.
- Verwijder zorgvuldig alle vloeistof volume en resuspendeer de kernen in 250 ul ijskoude wasbuffer C + protease-remmers.
3. Isolatie van Nucleosomen door in situ Micrococcal Nuclease (MNase) Spijsvertering
We maken gebruik van een procedure waarbij chromatine is in situ verteerd binnen de kernen door het inbrengen van MNase, gevolgd door een hypotone behandeling om vrij intacte nucleosomen rijden in het supernatant.
- Voeg 3 il 0,1 M CaCl 2 tot en met het monster. Zet in 37 ° C verwarmen blokkeren. Laat tot 37 ° C temperatuur te nemen.
- Voeg 2 eenheden MNase (Micrococcal Nuclease, Sigma-Aldrich, opgelost in 2 units/10μl in MNase buffer), daarna voor incuberen bij 37 ° C gedurende 12 min, met frequente mixen met behulp van een pipet tip.
- Voeg 6 pi van 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0 om de reactie te stoppen. Leg op het ijs.
- Centrifugeer bij 2000g gedurende 4 min, gooi supernatant. Resuspendeer de pellet in 300 ui 0,2 mM Na-EDTA. Op te slaan op ijs gedurende 1 uur af en toe lichtjes pipetteren. (Deze hypotone voorwaarden vrij nucleosomen te bevrijden van de kernen).
- Centrifugeer bij 3000 g gedurende 4 minuten bij 4 ° C. Sla de supernatant, die gratis nucleosomen bevat, op het ijs.
- Weer resuspendeer de pellet met 300 ul 0,2 mM Na-EDTA. Op te slaan op ijs gedurende 1 uur af en toe lichtjes pipetteren.
- Centrifugeer bij 3000g voor 4min bij 4 ° C. Bewaar de supernatant en combineren met de eerste supernatans van stap 5. De resulterende mononucleosome preparaten kunnen worden gealiquoteerd en opgeslagen bij -80 ° C.
Opmerking: De hoeveelheid chromatine kan ruw worden gekwantificeerd door het meten van absorptie bij 260 nm van een 10 ul monster toegevoegd aan 990 ul van water. A 260 = 10 (na correctie voor de 1 / 100 verdunning) komt overeen met ongeveer 1mg/ml van het chromatine. Ook tijdens de bovenstaande procedure, kunnen kleine monsters worden bewaard en later geanalyseerd op hun DNA inhoud aan de kwaliteit en de omvang van MNase ontsluitingen, die vooral moeten bevatten DNA van 146 bp in lengte te controleren. Laddering is een indicatie van onvolledige MNase spijsvertering.
Let op: Fig.1 bevat een schematisch overzicht van de nucleaire isolement en MNase ontsluitingen stappen.
4. Nucleosoom-ELISA (NU-ELISA)
We ontdekken PTMs over fracties die inheemse intact nuclesosomes die zijn geïmmobiliseerd op 96 well ELISA microtiterplaten. Voor elk monster, maken we een serie van 2-voudige verdunningen, en deze zijn voorzien op bronnen in drievoud.
- Coat MaxiSorp plaatjes gedurende een nacht bij 4 ° C met 50 ul / putje van de nucleosomen verdund in coating buffer. Suggesties voor seriële tweevoudige verdunningen van nucleosomen worden bereid uit de bovenste rij naar de onderste rij door het toevoegen van 0,1 ug, 0,05 ug, 0.025 ug, 0,0125 ug, 0,00625 ug, 0,00313 ug, 0,00156 ug, met een coating buffer alleen (0 ug chromatine) in de bodem rij. (Opmerking: plaat dekt zijn nodig voor deze stap.)
- In de ochtend was de platen 4 keer met 200 ul / putje PBS/0.5% Tween-20 bij kamertemperatuur (RT) voor een totaal van 10 minuten met een plaat wasmachine.
- Blok 1 uur bij RT met 100 ul / putje PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA.
- Verwijder de blokkering buffer door schudden van de omgekeerde plaat flinkboven een gootsteen. Deksel en bewaar de platen bij -20 ° C, of ga direct naar de volgende stap.
- Voeg 1 ° Abs in een volume van 50 ul / well verdund 1:1000 (of zoveel als nodig) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA, incuberen bij KT 1 uur op een rotator.
- Spoel de platen 4 keer met 200 pl / well PBS/0.5% Tween-20 in RT en voor een totaal van 10 min in een plaat wasmachine.
- Voeg mierikswortel peroxidase (HRP)-geconjugeerd 2 ° Abs, verdund 1:5000 (of zoveel als nodig) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA bij RT voor een uur op een rotator.
- Spoel de platen 4 keer met 200 pl / well PBS/0.5% Tween-20. Elke wasbeurt is bij kamertemperatuur en voor een totaal van 10 minuten met een plaat wasmachine.
- Ontwikkelen van de platen door het toevoegen van 50 pi van TMB substraat aan elk goed voor 10 min bij RT. Stop de reactie door toevoeging van 50 ul / putje van 2N H 2 SO 4 en lees de platen 450 nm. (Tip: Centrifugeer bij 1500 rpm gedurende 2 minuten met behulp van een plaat rotor om eventuele luchtbellen in de putjes verdwijnen voorafgaand aan het lezen van absorptie).
- Exporteer de metingen te spreadsheet bestanden voor kwantitatieve en statistische analyses.
Reagentia
| PBS / butyraat |
| 135 mM NaCl |
| 2,5 mM KCl |
| 8 mM Na 2 HPO 4 |
| 1,5 mM KH 2 PO 4 |
| 10 mM Na-butyraat |
| Lysis Buffer |
| 250 mM sucrose |
| 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 |
| 10 mM Na-butyraat |
| 4 mM MgCl 2 |
| 0,1% Triton X-100 |
| Wasbuffer C |
| 250 mM sucrose |
| 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 |
| 10 mM Na-butyraat |
| 4 mM MgCl 2 |
| Sucrose Kussen |
| 30% (w / v) sucrose in wasbuffer C |
| Microccocal Nuclease Buffer |
| 5 mM NaPO 4 Buffer, pH 7,0 |
| 0,025 mM CaCl 2 |
| Coating buffer |
| 80 ml Oplossing A + 170ml Oplossing B + 250ml dH 2 O |
| Oplossing A: 0,2 M Na 2 CO 3 |
| Oplossing B: 0.2 M NaHCO 3 |
5. Representatieve resultaten
Met behulp van de NU-ELISA methode, een reeks van verschillende identieke platen zijn bereid die kunnen worden geladen met chromatine opgesteld in de vorm van mononucleosomes. We meestal voor te bereiden serie van identiek-geladen platen, zodat elke kan worden afgetast met verschillende anti-PTM specifieke antilichamen (ABS). We hebben ook altijd voor te bereiden een plaat die kan worden gemerkt met een Ab die histon-eiwitten detecteert zonder te letten op hun wijziging staat in totaal chromatine het laden van controle. Deze controle is essentieel om later kwantitatief vergelijken PTM inhoud van de nucleosomen bereid uit verschillende monsters. Om kwantificeren de niveaus van PTMs binnen een bepaalde chromatine monster corrigeren we de ruwe absorptie waarden met behulp van deze aanpak: Ten eerste, trekken we elke achtergrond signaal met behulp van waarden die zijn verkregen van de controle putjes die geen chromatine (achtergrond is meestal te verwaarlozen). Vervolgens hebben we standaardiseren PTM-specifieke signalen naar NU-ELISA-resultaten van een identiek geladen plaat die werd getest met een Ab die nucleosomen onafhankelijk van hun wijziging staat detecteert. (We hebben polyklonale Abs specifiek voor histonen H2A H2B of voor dit doel). Vervolgens bepalen wij de middelen en varianties voor elke verdunning van chromatine en de gegevens die zijn verkregen uit het lineaire gedeelte van de ELISA-test. Gedetailleerde voorbeelden van NU-ELISA wiskundige en statistische analyses zijn eerder vier gemeld
Figuur 1. Schematische diagam van de NU-ELISA stappen. A. zoogdiercellen zijn geoogst; B. Kernen worden gescheiden van de cellen door Dounce homogenization, C. Verstoorde cellen worden geladen op de top van een 30% w / v sucrose kussen, D. Na centrifugeren, worden kernen afgezet in de pellet, E, F. chromatine worden verteerd in situ overwegend mononucleomes door MNase, G, H , ik. Oplosbare mononucleosomes worden geëxtraheerd door hypotone behandeling en herhaaldelijk centrifugeren van de resterende nucleair materiaal. J. Mononucleosomes uit verschillende monsters (het label samp. 1 en 2 in dit geval) zijn bekleed microtiterputjes in serie van identiek-geladen platen en ondervraagd met PTM-specifieke Abs en PTM-onafhankelijke Abs aan de totale chromatine belasting te bepalen. K. Voorstelling van differentiële signaal detectie niveaus in twee steekproeven die verschillen in hun PTM inhoud, maar hebben soortgelijke algemene chromatine-inhoud, zoals beoordeeld door de anti-H2B immunoreactiviteit.
Discussion
NU-ELISA is een methode om de wereldwijde status van nucleosoom PTMs aanwezig in een bepaald celtype vast te stellen. NU-ELISA studies hebben aangetoond dat de wereldwijde nucleosoom wijziging verklaart verschillen in vergelijkingen van verschillende celtypen 4. Daarnaast, NU-ELISA PTM-profielen te wijzigen wanneer de cellen worden blootgesteld aan epigenetische modulerende middelen zoals trichostatine-A of wanneer de muis embyronic stamcellen zijn gedifferentieerd 4. De methode is ook met succes toegepast op de chromatine van menselijke embryonale stamcellen 5 studiepunten. Het is belangrijk op te merken van de NU-ELISA, in de huidige vorm, kan alleen de composiet handtekening van PTMs aanwezig in de totale som van de cellulaire epigenoom op te sporen. Dit verschilt duidelijk van genoom-brede chromatine immunoprecipitatie, die de verdeling van een specifieke PTM over specifieke genetische loci kan bepalen.
De eerste stappen van de NU-ELISA procedures worden aangepast van bovenstaande methoden om mononucleosomes isoleren van zoogdieren kernen 6,7. Deze aangepaste methoden geven een doelmatige manier om de hoge kwaliteit intact mononucleosomes te verkrijgen van zoogdiercellen, en de daaruit voortvloeiende fracties zijn uitgebreid in de chromatine inhoud, maar bevatten een veel extra nucleair materiaal. Aangezien de specifieke Abs worden gebruikt, is niet-vervuilende nucleosomale materiaal goed wordt verdragen in de NU-ELISA-test, in tegenstelling tot de massa-spec benaderingen die grotere zuiverheid nodig hebben. Echter, NU-ELISA is gevoeliger en kwantitatieve dan western blotting 4, en zo goede alternatieven voor westerns en de massa spec voor de detectie van nucleosomale PTMs.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Ontwikkeling van de NU-ELISA-methode werd ondersteund door NIH subsidie RO1AG023687.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micrococcal Nucleae | Sigma-Aldrich | N3755 | Make aliquots of 2 U/10μl buffer, stored at -20°C |
| Nunc MaxiSorp Microtiter Plates | Fisher Scientific | 12-565-135 | Adhesive plate covers can also be ordered through Fisher |
| Automated Plate Washer | |||
| 1-Step TMB-ELISAsubstrate | Pierce, Thermo Scientific | 34028 | Store at 4°C pre-warm to RT before use or as directed on the specification sheet |
| Microtiter Plate Reader | Bio-Rad | Most colorimetric plate reader models are suitable |
References
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Turner, B. M. Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays. 22, 836-845 (2000).
- Dai, B., Rasmussen, T. P. Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells. Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).
- Tanasijevic, B. Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture. Epigenetics. 4, 330-338 (2009).
- Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. Chromatin: a practical approach. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).
- Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. Chromatin: a practical approach. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).
