اشتقاق خطوط التوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية من أجهزة الصراف الآلي ^{-- / -- و البروتين p53 -- / -- الفئران}

Protocol

1. تشريح الأورام

1. لتشريح الورم ، يتم وضع منشفة ورقية نظيفة أو ثنى الجراحية المتاح على لوحة التشريح ورشها مع الايثانول 70 ٪.
2. يصرح باستخدامها بشكل روتيني الفئران لهذا البروتوكول مع CO _2. ضع الماوس الموت الرحيم على منصة التشريح ورذاذ جانبي الحيوان مع الايثانول. يقام الماوس في مكان على منصة التشريح باستخدام دبابيس دفع أربعة أو أكثر من خلال إدراج الساقين ورشها جيدا مع الايثانول 70 ٪.
3. يتم قطع الجلد فوق العانة من خط الوسط الى قاعدة الرأس باستخدام مقص العقيمة ، مع تجنب عضلات الكامنة واختراق في تجاويف الجسم.
4. فتح التجويف البطني مع زوج جديد من مقص وملقط معقم والحرص على عدم الاضرار الأعضاء الداخلية.
5. فتح التجويف الصدري عن طريق تشريح وتنحرف القفص الصدري للكشف عن الورم ، دون الأوعية الدموية المدمرة.
6. تبقى منفصلة الورم من الأجهزة الأخرى ، ونقل قطعة حوالي 40-50 ٪ من الورم الكلي (تقريبا ما يصل الى 1.5 X 0.8 X 0.8 سم) في برنامج تلفزيوني الباردة على الجليد.
7. يمكن حفظ الجزء المتبقي من الورم لفحوصات أخرى ، ويمكن إجراء التشريح الكامل في هذا الوقت.

2. زراعة خلايا الغدد اللمفاوية

1. رذاذ الأنبوب الذي يحتوي على الورم مع تشريح الإيثانول 70 ٪ ونقلها إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
2. إضافة 10 مل من المتوسط ​​لثقافة عقيمة طبق بيتري 150 مم ^2.
3. نقل قطعة من ورم في طبق بتري عن طريق الشفط لطيف مع ماصة.
4. منحنى اثنين العقيمة إبرة قياس 18 التي تواجه الجانب مشطوف بها.
5. فصل الورم باستخدام الإبر عازمة.
6. دوامة الطبق ، اضغط برفق ومكان في زاوية لجمع تعليق خلية إلى جنب ، مع تجنب القطع الكبيرة من الورم.
7. نضح تعليق الخلية ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل مع تجنب القطع الكبيرة من الورم.
8. غسل لوحة مع 10 مل من متوسطة ونقل في أنبوب نفس الوقت تجنب القطع الكبيرة من الورم.
9. مزيج تعليق خلية مكونة من الخلايا الليمفاوية وخلايا انسجة بلطف ونقل 5 مل في دورق نسيج الثقافة T - 25 و 10 مل إلى T - 75 قارورة نسيج الثقافة. دوامة القوارير بلطف.
10. تعليق استخدام الخلايا المتبقية لجعل 2 و 4 و 10100 و 1000 التخفيفات أضعاف في حجم 2.5 مل النهائي (خلايا زراعة بكثافات مختلفة باستخدام عدة أنواع من السفن الثقافة يزيد من احتمال إنشاء خط T - الخلية).
11. الصفيحة 2.0 مل من كل تخفيف في الآبار الفردية لوحة 6 - جيدا. دوامة بلطف لوحة.
12. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة في ترطيب الاجواء ₂ أكسيد الكربون في الهواء.

3. تغذية الخلايا الليمفاوية

1. بعد 48 ساعة من الحضانة ، إضافة 5 مل من المتوسط ​​إلى القارورة T - 25 و 10 مل من المتوسط ​​إلى القارورة T - 75 على طول الجدار مع الحد الأدنى من اضطراب في الخلايا.
2. إضافة 2 مل من المتوسط ​​إلى كل بئر من لوحة 6 - جيدا على طول الجدار مع الحد الأدنى من اضطراب في الخلايا.
3. احتضان خلايا لحاء 72 إضافية

4. الركض خلايا الغدد اللمفاوية

1. الأولي مرور
   1. في نهاية اليوم الخامس من الحضانة ، وpassaged الخلايا في نسبة 1:1 ، مع الحفاظ على القوارير واللوحات الأصلية (الحفاظ على كثافة خلايا بتركيز حوالي مل / 3x106 خلال الممرات first يعزز النجاح في إنشاء استمرار خط الخلية).
      1. للقارورة T - 25 ، ونقل 5 مل تعليق خلية في قارورة جديدة تحتوي على 5 مل من المتوسط. إضافة 5 مل من المتوسط ​​في قارورة الأصلي.
      2. للقارورة T - 75 ، ونقل 10 مل من تعليق خلية في قارورة جديدة تحتوي على 10 مل من المتوسط. إضافة 10 مل من المتوسط ​​في قارورة الأصلي.
      3. لوحة 6 - جيدا ، ونقل 2 مل من تعليق خلية من كل بئر في الآبار المماثلة من لوحة جديدة تحتوي على 2 مل من المتوسط ​​في كل بئر. إضافة 2 مل من المتوسط ​​في كل بئر من آبار الأصلي.
   2. احتضان جميع القوارير واللوحات ل72 ساعة إضافية في تجربتنا وضعت معظم خطوط الخلية من هذه إحدى الفقرات الثقافات (وجود مجاميع فضفاضة ملتصقة الخلية تعليق على خلايا انسجة المرفقة مؤشرا مبكرا على خط خلايا المنشأ).
   3. لثقافات مع أقل أو لا تعليق خلية المجاميع ملتصقة فضفاضة ، وإطعام قوارير أو من خلال استبدال اللوحات بعناية ما يقرب من 50 ٪ من المتوسط ​​في كل ساعة 72 لتجنب إزالة الخلايا من الثقافة الأصلية ، ويتم ترك السفن ثقافة دائمة ودون عائق ما لا يقل عن 5 دقائق للسماح للخلايا الرواسب في قاع بواسطة الجاذبية قبل التطلع لطيف لطاف المتوسطة.
2. الحفاظ على خطوط الخلايا المنشأ
   1. وpassaged خطوط الخلايا أنشئت في قوارير جديدة والصفائح. لT - 25 و T - 75 قوارير ، إضافة 5 مل من النسخة الأصلية أوتعليق إحدى الفقرات في 5 مل من المتوسط. لمدة 6 - جيدا لوحات ، أضف 3 مل من التعليق الأصلي أو مرور خلية واحدة إلى 7 مل من المتوسط ​​في قارورة T - 25. الأعلاف والاحتفاظ الأصلي أو المرور من خلال استبدال ثقافة واحدة حجم إزالة مع مستنبت الطازجة.
   2. أنشئ ممر خطوط الخلايا في قوارير T - 25 الجديدة. خطوط الخلية وقتا مضاعفة 18-24 ساعة. يتم الاحتفاظ بصورة روتينية الثقافات في كثافة مل / 1 - 3x106 وpassaged كل 3 أيام. إضافة الحجم المطلوب من الثقافة السابقة لمرور متوسطة جديدة لجعل ما يصل الى 10 مل. الأعلاف والإبقاء على الثقافة الأصلية.
   3. بعد بضع فقرات ، فإن الخلايا غير ملتصقة مصيره دون دعم خلايا انسجة ملتصقة وتنفذ عددا أقل من الخلايا الملتصقة مع بعضها عبر الممر. بعد هذه النقطة ، يمكن الحفاظ على الثقافات في نسيج الثقافة غير المعالجة T - 25 قوارير.

5. تجميد واستعادة خطوط خلية ورم الغدد اللمفاوية

1. يتم تجميد خطوط الخلية الطازجة في المتوسط ​​1640 RPMI تحتوي على 20 ٪ و DMSO FBS 10 ٪.
2. وطرد الخلايا من ثقافة قديمة في 48 ساعة T - 25 قارورة (حوالي 1.5x10 ⁶ خلية / مل) في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من طاف ، هي الخلايا إعادة علقت في 2 مل من المتوسط ​​تجميد الباردة. يتم وضع اثنين من 1.0 مل من حجم الخلية تعليق من كل قارورة في قنينات تجميد وتجميدها على الفور عند -80 درجة مئوية ، ونقل إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي.
3. وتسترد الخلايا من تخزين النيتروجين السائل بواسطة ذوبان سريع ، وإعادة التعليق على محتويات في 10 مل من المتوسط ​​ثقافة جديدة. بدلا من ذلك ، يتم غسل الخلايا إذابة طازجة مرة واحدة في مستنبت دافئ لإزالة DMSO قبل إعادة التعليق في 10 مل من المتوسط ​​ثقافة جديدة. يتم استزراع الخلايا على الأقل قبل مرور 72 ساعة لاحقة.

6. ممثل النتائج

جهاز الصراف الآلي ^{-- / --} تي خلية الخط تطويرها باستخدام هذا البروتوكول ، وعينت DWJ - ATM - 1 تميزت تلطيخ المضادة للCD3 - FITC ، APC - المضادة والمعادية للCD4 CD8 PE وتحليل تدفق الخلوي (Figure1). وكان أكثر من 90 ٪ من الخلايا T - CD3 ، CD4 و CD8 الثلاثي إيجابية.

الشكل 1. توصيف خط تي خلية تم تطويرها باستخدام هذا البروتوكول.

علامات سطح الخلية من جهاز الصراف الآلي المنشأة ^{-- / --} خط الخلية المعينة تميزت DWJ - ATM - 1 بواسطة تلطيخ المضادة للCD3 - FITC ومعاداة CD4 - APC ، ومكافحة CD8 - PE وتدفق تحليل الخلوي. لفترة وجيزة ، تم غسلها 1X10 ⁶ خلايا جديدة مرة واحدة في برنامج تلفزيوني الباردة (1500 دورة في الدقيقة / 5 دقائق) ، وحضنت في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة مع 200 ميكرولتر من الكوكتيل الأضداد (الأجسام المضادة في كل 1:200 التخفيف في برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 1 ٪. يمكن فحص الخلايا على الفور في حين تعد الخلايا الثابتة طازجة أو ثابتة لتحليلها لاحقا. بواسطة الفورمالين محايدة مضيفا مخزنة في نهائي تركيز 4 ٪ (المجلد / المجلد) وحضنت في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تحصد بواسطة الطرد المركزي (1500 دورة في الدقيقة / 5 دقائق) ومعلق في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 1 ٪. تم تحليل ما مجموعه 1 ⁴ 10 X الخلايا باستخدام FACS Calibur دينار بحريني ومحلل البرمجيات CellQuest دينار بحريني (العلوم البيولوجية ، وسان خوسيه ، كاليفورنيا).

Materials

Ice bucket 70% ethanol Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins Two sets of small sterile scissors and forceps Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13) Sterile 18 gauge needles 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829) 10% buffered formalin Tissue culture flasks T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025) T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075) 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506) Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS) Culture medium RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following: 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03) 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI) 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI) 55 mM 2β-mercapt–thanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752) Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275) Antibodies (eBioScience, San Diego, CA) anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85) anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83) anti-CD8-PE (cat.#12-081-85) Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017) Concanavalin A (Sigma cat# C5275) 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)