에서 Thymic 림프종 T - 세포 라인의 유도 ATM ^{- / -과 p53의 - / - 마우스}

Summary

이 비디오에서는 마우스 thymic 림프종 세포 라인을 확립 프로토콜을 보여줍니다. 및 p53의 - / - - thymic 림프종과 생쥐이 프로토콜에 따라, 우리는 성공적으로 여러 ATM - /에서 T - 세포 라인을 설립했습니다.

Abstract

설립 세포 라인은 연구 실험 동물의 사용을 줄일 수있는 중요한 연구 도구입니다. 특정 같은 ATM과 같은 유전자 변형 생쥐의 변종 ^{- / -와} p53의 ^{- /이 -} 일관되게 일찍 삶 ^1,2에서 thymic 림프종을 개발하고, 따라서, murine T - 세포 라인의 유도를위한 신뢰할 수있는 소스로 검색할 수 있습니다. 여기는 이전의 프로토콜 ^1,3에서 설명한 interleukins를 추가할 필요없이 설립 murine thymic T - 세포 림프종 라인의 개발을위한 세부적인 프로토콜을 제시한다. 종양은 hunched 자세의 관찰을 바탕으로 눈에 보이는 종양의 초기 표시에서 3~6개월 세 생쥐에서 수확 호흡, 가난한 정리하고 민감한 스트레인 ^1,4의 낭비를 보람 있었다. ^{/ - -} [FVB/N- ATM ^tm1Led / J] ² p53의 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] ⁵ 쥐가 우리는 성공적으로이 프로토콜을 사용하여 여러 개의 T - 세포 라인과 ATM의 근친 변종을 설립했습니다. 우리는 더 이상 기존 T - 세포 인구의 90 % 이상이 인 경우에는 3 번 CD, CD4와 CD8을 표현 것을 보여줍니다. 안정 설립 세포 라인과 일치, 현재 프로토콜을 사용하여 발생하는 T - 세포는 일년 이상 passaged되었습니다.

Protocol

1. 종양의 해부

1. 종양 절개 들어, 깨끗한 종이 타월이나 일회용 외과 드레이프는 해부 패드에 위치하고 있으며 70 %의 에탄올로 뿌렸어요.
2. 이 프로토콜에 대한 생쥐가 일상적으로 CO ₂ euthanized 있습니다. 절개 패드에 euthanized 마우스를 놓고 에탄올과 동물의 양쪽을 스프레이. 마우스는 다리를 통해 삽입 70 % 에탄올로 철저하게 뿌려놓은 4 개 이상의 푸시 핀을 사용하여 절개 패드에 장소에서 개최됩니다.
3. 정중선을 통해 피부는 기본 근육을 피하와 본문 충치에 관통하면서, 멸균 가위를 사용하여 치골에서 머리의 기본으로 들어가있다.
4. 무균 가위와 내부 장기를 손상하지 않도록주의하는 포셉의 새로운 쌍을로 복강을 엽니다.
5. 해부 및 손상 혈관없이 종양을 나타내기 위해 갈빗대을 왜곡하여 흉강을 엽니다.
6. 다른 장기에서 종양을 분리하고, 차가운 PBS로 작품 전체 종양의 약 40~50%를 (약 최대 1.5 X 0.8 X 0.8 cm) 전송 얼음이 있었죠.
7. 종양의 나머지 부분은 다른 assays 저장 수 있으며 완벽한 검시이 시간에 수행할 수 있습니다.

2. Culturing의 림프종 세포

1. 70 % 에탄올과 biosafety 캐비닛에 전송으로 해부하는 종양을 포함하고있는 튜브를 스프레이.
2. 멸균 150mm ² 페트리 접시에 배지 10 ML을 추가합니다.
3. 피펫과 부드러운 흡입하여 페트리 접시에 종양의 조각을 전송합니다.
4. beveled 측면을 마주보고 두 멸균 18 게이지 바늘을 구부.
5. 벤트 바늘을 사용하여 종양을 떼어 놓다.
6. 소용돌이 접시를 부드럽게 탭 및 종양의 큰 조각을 피하면서, 측면에 세포 현탁액을 수집하는 각도로 놓으십시오.
7. 종양의 큰 조각을 피하면서 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액과 전송 대기음.
8. 종양의 큰 조각을 피하는 동안 같은 튜브에 매체 및 전송의 10 ML과 접시를 씻으십시오.
9. 부드럽게 lymphocytes와 stromal 세포로 구성된 세포 현탁액을 혼합하고 T - 75 조직 배양 플라스크에 T - 25 조직 문화 플라스크 10 ML에 5 ML을 전송하기만하면됩니다. 부드럽게 소용돌이 flasks합니다.
10. 2.5 ML 최종 볼륨 (문화 선박의 여러 유형을 사용하여 서로 다른 밀도에 culturing 세포 T 세포 라인을 확립 가능성을 극대화) 2, 4, 10100 1000 배 dilutions를 만들기 위해 나머지 세포 현탁액을 사용합니다.
11. 6 잘 접시의 각각의 우물에 각 희석의 플레이트 2.0 ML. 부드럽게 소용돌이 접시합니다.
12. 공기 humidified CO ₂ 분위기에서 48 H에 대한 세포를 품어.

3. 림프종 세포를주고

1. 부화 48 H 후, 세포의 최소한의 방해와 벽 함께 T - 75 플라스크에 T - 25 플라스크와 매체의 10 ML 중간의 5 ML를 추가합니다.
2. 세포의 최소한의 방해와 벽을 따라 6 잘 플레이트의 각 물론 중간 2 ML을 추가합니다.
3. 추가 72 H.에 대한 세포를 품어

4. 림프종 세포를 Passaging

1. 초기 통로
   1. 원래 flasks 및 접시 (첫 번째 구절 중에 약 3x106 / ML의 농도에서 세포 밀도를 유지의 성공적인 구축을 촉진 유지하면서 부화의 다섯 번째 하루의 끝에서, 세포는 1:1 비율로 passaged 아르 연속 세포주).
      1. T - 25 플라스크의 경우, 매체의 5 ML을 포함하는 새로운 플라스크에 세포 현탁액의 5 ML을 전송. 원래 플라스크에 매체의 5 ML을 추가합니다.
      2. T - 75 플라스크 들어, 중간의 10 ML을 포함하는 새로운 플라스크에 세포 현탁액의 10 ML을 전송. 원래 플라스크에 배지 10 ML을 추가합니다.
      3. 6 - 잘 접시, 각 우물에 중간 2 ML을 포함하는 새 접시의 해당 우물에 각 우물에서 세포 현탁액 2 ML을 전송. 원래 우물의 각 우물에 미디어 2 ML을 추가합니다.
   2. 추가 72 H. 모든 flasks과 접시를 품어 우리의 경험에서 대부분의 세포 라인은 이러한 통로 한 문화 (첨부된 stromal 세포를 통해 느슨하게 자기편 서스펜션 셀 집계의 존재가 설립 세포주의 초기 표시이다)에서 설정됩니다.
   3. 적게 또는 전혀 느슨하게 자기편 서스펜션 세포 집계와 문화, 신중하게 중간마다 72 H.의 약 50 %를 대체하여 flasks이나 접시를 피드 원래 문화의 세포를 제거 방지하기 위해, 문화 선박이 뜨는 매체의 부드러운 열망 전에 중력에 의해 아래에있는 세포의 퇴적물을하도록 서있는 최소한 5 분 그대로 남아 있습니다.
2. 설립 세포 라인을 유지
   1. 설립 셀 라인은 새로운 flasks 및 플레이트로 passaged 있습니다. T - 25 T - 75 flasks 들어, 원본 또는 5 ML을 추가중간 5 ML에 통과 한 현탁액. 6 - 잘 접시 들어, T - 25 플라스크에 중간 7 ML에 원본 또는 통로 한 셀 서스펜션 3 ML를 추가합니다. 피드 신선한 배지로 제거 볼륨을 대체하여 원본 또는 통로 한 문화를 유지합니다.
   2. 통로는 새로운 T - 25 flasks로 셀 라인을 설립하였습니다. 셀 라인은 18-24 H.의 두 배로 시간을 문화가 일상적으로 1 3x106 / ML의 밀도 유지, 3 일마다 passaged 있습니다. 10 ML까지 할 수있는 새로운 매체 이전에 통과 문화의 필요한 볼륨을 추가합니다. 피드와 원래의 문화를 유지합니다.
   3. 몇 구절 후, 비 점착 성의 세포가 자기 점착 성의 stromal 세포없이 유지되며, 자기편 세포의 작은 숫자는 각 통로로 이월됩니다. 이 시점 이외에도, 문화가 T - 25 flasks을 처리하지 않는 조직 문화를 유지하실 수 있습니다.

5. 림프종 세포 라인을 동결 복구

1. 셀 라인 20% FBS 및 10 % DMSO를 포함하는 신선한 RPMI 1640 배지에 냉동 수 있습니다.
2. T - 25 플라스크 (약 1.5x10 ⁶ 셀 / ML)에 48 H 옛 문화의 세포는 상온에서 5 분 1,500 rpm으로 centrifuged 있습니다. 폐기 뜨는 후, 세포는 추위 동결 중간 2 ML에 다시 일시 중지됩니다. 각각의 플라스크에서 세포 현탁액의 두 1.0 ML 볼륨 즉시 -80시 냉동, 동결 튜브에 배치됩니다 ° C, 그리고 그 다음날 액체 질소로 전학 왔어.
3. 전지는 빠른 해동하고, 신선한 문화 매체 10 ML에있는 내용을 resuspending하여 액체 질소 저장에서 복구됩니다. 또는, 갓 해동 세포는 신선한 문화 매체의 10 ML에 resuspending 전에 DMSO를 제거하는 따뜻한 문화 매체에 한 번 세탁하고 있습니다. 세포는 이후 통과하기 전에 최소한 72 H에 대한 양식입니다.

6. 대표 결과

ATM은 ^{- / -} T - 세포 라인이 프로토콜을 사용하여 개발된 및 지정 DWJ - ATM - 1 반 인 경우에는 3 번 CD - FITC, 안티 - CD4 - APC 및 안티 CD8 - PE 및 유동세포계측법 분석 (Figure1)와 얼룩에 의해 특징되었습니다. T - 세포의 90 % 이상 인 경우에는 3 번 CD, CD4 및 CD8 트리플 긍정했다.

그림 1.이 프로토콜을 사용하여 개발된 T - 세포 라인의 특성화.

^{/ - -} 설립 ATM의 세포 표면 마커 세포 라인 DWJ - ATM - 1과 얼룩을 특징으로했다 지정한 안티 인 경우에는 3 번 CD - FITC, 안티 - CD4 - APC, 안티 - CD8 - PE 및 유동세포계측법 분석. 간단히, 1X10 ⁶ 신선한 세포는 차가운 PBS (1500 RPM / 5 분)에 한 번 씻어, 그리고 4 incubated 있었다 ° 1 % BSA와 PBS에서 1:200 희석에서 항체 칵테일 (각 항체의 μL 200 10 분 C. 신선한 이상 분석을 위해 고정. 수정된 세포가 4 % (권 / 권) 최종 농도에 추가 중립 버퍼 포르말린에 의해 준비 및 원심 분리에 의해 수확 30 분 (4 ° C에서 incubated하는 동안 세포는 즉시 검사 수있는 1,500 RPM / 5 분) 및 1 % BSA와 PBS 200 μL에 resuspended. 1 X 10 ⁴ 세포의 총 BD 외과 Calibur 분석기 및 CellQuest 소프트웨어 (BD ​​Biosciences, 산호세, CA)를 사용하여 분석되었다.

Discussion

이 프로토콜에서는, 우리는 두 개의 다른 마우스 genotypes에서 murine T - 세포 라인을 확립하기위한 자세한 절차를 제공한다 ^{- / -} [FVB/N- ATM ^tm1Led / J]와 p53의 ^{- / -} ATM [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] . ^{/ - -} 세 (5 시도 아웃) p53의 ^{- / -이} 프로토콜, 6 총 (7 시도 아웃) ATM을 사용하여 murine T - 세포 라인은 우리 연구실에서 설립되었습니다. ^{/ - -} 그 세포주 DWJ - ATM - 1, ATM 보여주는 대표적인 데이터 셀 라인은 세포 표현 인 경우에는 3 번 CD, CD4 및 CD8 표면 마커보다 90 % 이상 그 clonal T - 세포 라인이 수 확인하는 세포 인구로 구성되어 있습니다 우리의 프로토콜을 사용하여 만들었습니다.

murine T - 세포 라인 개발이 ^{3,6,7을보고되었습니다} 있지만, 이러한 라인을 설립에 대한 자세한 프로토콜은 이전에 설명되지 않았습니다. 두 마우스 genotypes 우리의 연구실에 murine T - 세포 라인의 유도에 사용 되었으나, 우리는 이러한 절차가 같은 결함 Kras 호텔로 생쥐의 다른 변종에서 발견 자발적인 T - 세포 lymphomas의 다양한 적용되는 생각하고, 잠재적으로 다른 동물 종. Murine T - 세포 라인은 면역학 및 종양학의 기본적인 질문을 이해 잠재적인 응용 프로그램을했습니다. 현재, 우리는 세포주기 체포 apoptosis의 메카니즘을 포함하여 호스트 병원체 상호 작용 및 genotoxin 유도된 세포 독성을 특성화 목표로 연구에서 이러한 세포 라인을 사용하고 있습니다. murine T - 세포 라인이 급성 인간 T - 세포 lymphoblastic leukemias과 lymphomas과 공통점 같은 PTEN 및 FBXW7의 삭제 등 게놈 변경을 공유 감안할 때, 그들은 특히 암 생물학 ⁸ 연구에 적합하며, 빠른 사전에 대한 자세한 애플 리케이션을 수 있습니다 체외에서 면역 및 암 chemotherapeutic 요원의 효험 - 임상 검사. 이러한 세포 라인이 syngeneic 또는 immunocompromised 중 생쥐에서 생체내에 전달 될 ​​수 있는지 여부를 결정되지 않았습니다.

T - 세포 라인의 성공적인 구축 석 달 ⁶ 현재 프로토콜을 사용하여 개발된 셀 라인을 차지하는 이전 프로토콜과는 달리 (통로 2-8 사이) 개월 이내에 설립되었다. 우리는 첨부 stromal 세포를 통해 느슨하게 자기편 세포 집계의 존재가 설립 세포주의 중요한 초기 표시되고있는 것으로 나타났습니다. murine T - 세포가 무한정 증식 수 있도록하기 위해, 우리는 또한 feedings 동안 그대로 초기 느슨하게 자기편 세포 집계를 떠날 중요하다는 것을 발견했습니다. 또한, 첫 번째 구절 중 약 3x10 ⁶ / ML의 농도에서 세포 밀도를 유지하는 것은 또한 지속적인 세포 라인의 성공적인 설립을 추진하고 있습니다. 우리의 경험에서는, 문화 선박의 여러 유형을 사용하여 서로 다른 밀도에 culturing 세포는 T - 세포 라인을 확립 가능성을 극대화할 수 있습니다. 대부분의 T - 세포 라인은 T - 75 flasks 또는 6 - 잘 접시 약 1x10 ⁷ 1x10 ⁶ 셀 / ML에 해당하는 10 개 또는 100 배 dilutions에서 설립되었다. 이전 프로토콜은 5 × 10 ^6, 1 X10 ⁷ 6 - 잘 접시에 잘 당 2 X 10 ⁷ 세포에서 culturing 세포를 권장하고, 칠일 (7) 이후에 먹이. 우리는 5 일째에, 나중에 48 H 및 통로 72 H에 초기 문화를 수유하는 것이 최적이라고 보여집니다. 처음으로 먹이를하고 통과하기 전에 더 이상 기다리는 것은 세포들이 생존을 잃게하고 분리를 중단시킬 것입니다.

우리가 발견한 마지막 매개 변수는 체외에서 T - 세포 murine의 성공적인 번식에 중요한 것은 빠른 세포 성장을 지원할 수 배지에 FBS의 존재입니다. FBS의 다른 많은 공급 업체가 적절한 시약의 식별을위한 T - 세포 라인의 유도를 시작하기 전에 검사를해야합니다. murine T - 세포 라인 검사를 사용할 수없는 경우, 빠른 세포 성장을 자극 concanavalin A를 (1μg / ML)이있는 시험 매체 ML 당 1x10 ⁶ 농도에서 24 잘 접시의 우물에 위치 thymic lymphocytes의 주요 문화 적합합니다. FBS의 최적 소스의 면전에서, 세포의 숫자는 매 18-24 H.을 두 번해야

Materials

Ice bucket 70% ethanol Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins Two sets of small sterile scissors and forceps Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13) Sterile 18 gauge needles 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829) 10% buffered formalin Tissue culture flasks T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025) T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075) 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506) Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS) Culture medium RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following: 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03) 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI) 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI) 55 mM 2β-mercapt–thanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752) Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275) Antibodies (eBioScience, San Diego, CA) anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85) anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83) anti-CD8-PE (cat.#12-081-85) Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017) Concanavalin A (Sigma cat# C5275) 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)