Summary
В этом видео мы продемонстрируем протокол установить мышь тимуса клеточных линиях лимфомы. Следуя этому протоколу, мы успешно создано несколько Т-клеточных линий из банкоматов-/ - и p53-/ - мышей с лимфомой тимуса.
Abstract
Основанная клеточных линий являются одним из важнейших инструментов исследования, которые могут уменьшить использование лабораторных животных в научных исследованиях. Некоторые штаммы генетически модифицированных мышей, таких как ATM - / - и р53 - / - последовательно развивать вилочковой железы лимфомы в раннем возрасте 1,2, и, таким образом, может служить надежным источником для вывода мышиные Т-клеточных линиях. Здесь мы представляем подробный протокол для развития создан мышиной лимфомы тимуса Т-клеточных линий без необходимости добавлять интерлейкины, как описано в предыдущих протоколах 1,3. Опухоли были собраны от мышей в возрасте от трех до шести месяцев, при первой указанием видимых опухолей основана на наблюдении выгибание спины, затрудненное дыхание, плохой уход и тратить в 1,4 восприимчивы напряжения. Мы успешно создано несколько Т-клеточных линий с использованием этого протокола, и инбредных линий банкоматов - / - [FVB/N- Атм tm1Led / J] 2 и p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 мышей. Кроме того, мы показали, что более 90% от установленной Т-клеточной популяции выражает CD3, CD4 и CD8. В соответствии со стабильно установленных линий клеток, Т-клеток, созданный с помощью данного протокола были пассировать в течение года.
Protocol
1. Препарирование опухоли
- Для опухоли вскрытия, чистым бумажным полотенцем или одноразовой хирургической драпировка делается на вскрытие блокнот и опрыскивают 70% этанола.
- Мыши для этого протокола обычно усыпляют с CO 2. Место эвтаназии мыши на вскрытии площадку и брызг с обеих сторон животных этанолом. Мыши удерживается на месте на вскрытии площадку с помощью четырех или более толчок контакты вводится через ноги и опрыскивают водой с 70% этанола.
- Кожа над средней линии режется от лобка до основания головы с помощью стерильных ножниц, избегая при этом основные мышцы и проникающие в полости тела.
- Открытое брюшной полости с новой пары стерильными ножницами и щипцами будьте осторожны, чтобы не повредить внутренние органы.
- Открытое грудной полости анализируя и отклоняющих грудной клетки, чтобы выявить опухоль, не повреждая кровеносные сосуды.
- Отдельные опухоли из других органов, а также передачу части примерно 40-50% от общего объема опухоли (примерно до 1,5 х 0,8 х 0,8 см) в холодном PBS держится на льду.
- Оставшуюся часть опухоли могут быть сохранены для других анализов и полного вскрытия может быть выполнена в это время.
2. Клетки лимфомы Культивирование
- Спрей трубка с расчлененным опухоли на 70% этанола и трансфер в кабинет биобезопасности.
- Добавьте 10 мл питательной среды для стерильных 150 мм 2 чашки Петри.
- Передача части опухоли в чашке Петри, осторожно всасывания с пипеткой.
- Бенд две стерильные иглы 18 калибра, стоящих перед скошенной стороной наружу.
- Диссоциируют опухоли использованием изогнутых игл.
- Swirl блюдо, коснитесь мягко и место под углом к сбору клеточной суспензии в стороне, избегая при этом больших кусков опухоли.
- Аспирируйте суспензии клеток и перенос в 50 мл коническую трубку, избегая при этом больших кусков опухоли.
- Промыть пластины с 10 мл среды и передача в ту же трубку, избегая при этом больших кусков опухоли.
- Смешайте суспензии клеток состоят из лимфоцитов и стромальных клеток, мягко и передачи 5 мл на Т-25 ткани колбу культуры и 10 мл в Т-75 колбу культуры ткани. Аккуратно водоворот колб.
- Используйте оставшиеся суспензии клеток, чтобы сделать 2, 4, 10100 и 1000 кратные разведения в 2,5 мл конечного объема (культивирования клеток на различных плотностей с использованием нескольких типов культуры судов максимизирует вероятность создания Т-клеточная линия).
- Пластины 2,0 мл каждого разведения на отдельные скважины 6-луночный планшет. Аккуратно водоворот пластины.
- Инкубируйте клетки в течение 48 ч во влажной атмосфере CO 2 в воздухе.
3. Кормление клеток лимфомы
- Через 48 ч инкубации, добавляют 5 мл средних Т-25 колбу и 10 мл средних Т-75 колбу вдоль стены с минимальным нарушением клеток.
- Добавьте 2 мл среды в каждую лунку 6-луночный планшет вдоль стены с минимальным нарушением клеток.
- Инкубируйте клетки для дополнительных 72 ч.
4. Пассирования клеток лимфомы
- Первоначальные проход
- В конце пятого дня инкубации клетки пассировать в соотношении 1:1, сохранив при этом оригинальные флаконы и пластины (поддержание плотности клеток в концентрации примерно 3x106 / мл в течение первых мест способствует успешному созданию непрерывную линию клеток).
- Для Т-25 колбу, передача 5 мл клеточной суспензии в новый флакон, содержащий 5 мл среды. Добавьте 5 мл среды в оригинальной колбу.
- Для Т-75 колбу, трансфер 10 мл клеточной суспензии в новый флакон, содержащий 10 мл среды. Добавьте 10 мл среды в оригинальной колбу.
- Для 6-луночный планшет, передача 2 мл клеточной суспензии из каждой лунки в соответствующие лунки новой пластинкой, содержащий 2 мл среды в каждую лунку. Добавить 2 мл среды в каждую лунку оригинальные скважин.
- Инкубируйте все флаконы и пластины для дополнительных 72 ч. По нашему опыту большинство клеточных линий устанавливаются из этих прохождения одна культур (наличие свободно присоединенными агрегатов суспензии клеток через прилагаемый стромальных клеток является ранним признаком создана клеточная линия).
- Для культур с меньшим или не свободно присоединенными агрегатов суспензии клеток, кормов колбах или пластин, тщательно заменить около 50% средний каждые 72 ч. Чтобы избежать удаления клеток с самобытной культурой, культурой суда остались стоять и спокойно, по крайней мере 5 минут, чтобы клетки осадка на дне под действием силы тяжести до нежного стремление надосадочной среды.
- В конце пятого дня инкубации клетки пассировать в соотношении 1:1, сохранив при этом оригинальные флаконы и пластины (поддержание плотности клеток в концентрации примерно 3x106 / мл в течение первых мест способствует успешному созданию непрерывную линию клеток).
- Поддержание установленных клеточных линий
- Основанная клеточные линии пассировать в новые флаконы и пластины. Для Т-25 и Т-75 колб, добавляют 5 мл оригинал илипрохождение несущий в 5 мл среды. Для 6-луночный, добавьте 3 мл оригинал или прохождение одной клетки суспензии в 7 мл среды в Т-25 колбу. Поток и сохранить оригинал или прохождение одной культуры, заменив удаленный объем свежей питательной среды.
- Прохождение установленных клеточных линий в новые Т-25 колб. Клеточные линии имеют время удвоения 18-24 ч. Культуры текущее техническое обслуживание при плотности 1-3x106 / мл и пассировать каждые 3 дня. Добавить необходимый объем предыдущей культуры переход к новой среде, чтобы сделать до 10 мл. Поток и сохранить самобытную культуру.
- После нескольких проходов, не соблюдают клетки самостоятельно выдержать без приверженцем стромальных клеток и меньшее число прилипшие клетки переносятся с каждым переходом. За этой точкой, культуры могут быть сохранены в не-культуры тканей лечение Т-25 колб.
5. Замораживание и восстановление линий клеточной лимфомы
- Клеточные линии заморожены в свежеприготовленный RPMI 1640, содержащей 20% FBS и 10% ДМСО.
- Клетки из 48 ч старой культуры в Т-25 колбы (около 1.5x10 6 клеток / мл) центрифугируют при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре. После отбрасывания супернатант, клетки ресуспендировали в 2 мл холодной замораживания среды. Два 1,0 мл объемы клеточной суспензии из каждой колбы помещены в замораживании флаконы, немедленно замораживали при -80 ° С, и переданы в жидком азоте на следующий день.
- Клетки оправился от хранения в жидком азоте при быстром таянии и ресуспендирования содержимое в 10 мл свежей питательной среды. Кроме того, недавно талой клетки промывают один раз в теплой питательной среды для удаления ДМСО до суспендирования в 10 мл свежей питательной среды. Клетки культивировали в течение по крайней мере 72 часов до последующего прохода.
6. Представитель Результаты
Атм - / - Т-клеточная линия разработана с использованием этого протокола и назначил DWJ-ATM-1 было характерно окрашивание анти-CD3-FITC, анти-CD4-APC и анти-CD8-PE и проточной цитометрии анализа (рисунок 1). Более 90% от Т-клетки CD3, CD4 и CD8 тройной положительный.
Рисунок 1. Характеристика Т-клеточная линия разработана с использованием этого протокола.
Поверхности клеток маркеры установленных атм - / - клеточная линия назначенные DWJ-ATM-1 было характерно окрашивание анти-CD3-FITC, анти-CD4-APC, анти-CD8-PE и анализа проточной цитометрии. Короче говоря, 1x10 6 свежих Клетки промывали один раз в холодной PBS (1500 об / 5 мин), и инкубировали при 4 ° С в течение 10 мин при 200 мкл антител коктейль (каждое антитело в разведении 1:200 в PBS с 1% BSA. Клетки могут быть немедленно осмотрен в то время как свежие или фиксированный для последующего анализа. Фиксированные клетки получают путем добавления нейтральный буферный формалин на 4% (об / об) конечная концентрация и инкубировали при 4 ° С в течение 30 мин, собирали центрифугированием (1500 об / 5 мин) и ресуспендировали в 200 мкл PBS с 1% BSA. общей сложности 1 X 10 4 клеток были проанализированы с помощью BD FACS Calibur анализатор и CellQuest программное обеспечение (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе, мы предоставляем подробные процедуры создания мышиные Т-клеточных линий от двух разных генотипов мыши; атм - / - [FVB/N- Атм tm1Led / J] и р53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . Используя этот протокол, в общей сложности 6 (из 7 попыток) атм - / - и три (из 5 попыток) р53 - / - мышиные Т-клеточные линии были созданы в нашей лаборатории. Представитель данные, показывающие, что клеточная линия DWJ-ATM-1, атм - / - клеточная линия состоит из клеточной популяции, в которых более 90% от клетки экспрессируют CD3, CD4 и CD8 маркеров поверхности подтверждают, что клональных Т-клеточная линия может быть устанавливается с помощью нашего протокола.
Развитие мышиные Т-клеточных линиях было сообщено 3,6,7, однако подробные протоколы для установления этих строк еще не были описаны ранее. Хотя только два генотипа мыши были использованы для вывода мышиные Т-клеточных линий в нашей лаборатории, мы считаем, что эти процедуры применимы к широкому спектру спонтанного Т-клеточные лимфомы встречаются и в других линий мышей, таких как Крас неисправен, и, возможно, других видов животных. Мышей Т-клеточные линии имеют потенциал применения в понимании основных вопросов в области иммунологии и онкологии. В настоящее время мы используем эти клеточные линии в исследования, направленные на характеризующих хозяин-патоген взаимодействия и genotoxin цитотоксичности, спровоцированной в том числе механизмов клеточного цикла и апоптоза. Учитывая, что мышиные Т-клеточных линиях доля геномной изменения, такие как делеции PTEN и FBXW7 общего с острой человеческий Т-клеточный лимфобластный лейкозы и лимфомы, они особенно хорошо подходят для исследований в области биологии рака 8, и, возможно, другие приложения для быстрой предварительной -клинического скрининга эффективности иммунологических и химиотерапевтических агентов в пробирке. Так или иначе эти клеточные линии могут быть распространены в естественных условиях в любом сингенных или с ослабленным мышей не была определена.
В отличие от предыдущих протоколов, в которых успешное создание Т-клеточной линии уходило до трех месяцев, 6, клеточных линий, разработанных с использованием текущего протокола были установлены в течение месяца (между прохождением 2-8). Мы обнаружили, что наличие свободно присоединенными клеточных агрегатов в течение прилагается стромальных клеток является одним из важнейших ранних указанием установленных клеточной линии. Для того, чтобы позволить мышиные Т-клетки распространяются на неопределенный срок, мы также обнаружили, что очень важно оставить первоначальный свободно присоединенными клеточных агрегатов спокойно во время кормления. Кроме того, сохранение плотности клеток в концентрации примерно 3х10 6 / мл в течение первых мест также способствует успешное создание непрерывной линии клеток. По нашему опыту, культивирования клеток на различных плотностей с использованием нескольких типов культуры судов максимизирует вероятность создания Т-клеточной линии. Большинство Т-клеточные линии были созданы из Т-75 колб или 6-луночных планшетах и 10 или 100 раз разведения, которые соответствуют примерно 1x10 1x10 7 или 6 кл / мл. Предыдущий протокол рекомендуется культивирования клеток в 5 х 10 6, 1 x10 7 и 2 х 10 7 клеток на лунку в 6-луночных планшетах, и кормление через 7 дней (7). Мы обнаружили, что кормление начальной культур на 48 ч и 72 ч прохождения спустя, 5-й день является оптимальным. Ожидание дольше, прежде чем первая подача и прохождение вызовет клетки теряют свою жизнеспособность и прекращают делиться.
Последний параметр, который мы обнаружили, имеет решающее значение для успешного распространения мышиные Т-клетки в пробирке является наличие FBS в культуральной среде, которые могут поддерживать быстрый рост клеток. Различные партии и поставщиков ФБС должны быть обследованы до начала вывода Т-клеточных линий для идентификации соответствующего реагента. Если мышиные Т-клеточных линиях, не доступны для скрининга, первичных культурах тимуса лимфоциты помещают в лунки 24-луночного планшета в концентрации 1x10 6 на мл тест среде, содержащей конканавалин (1 мкг / мл), чтобы стимулировать быстрый рост клеток является адекватной. При наличии оптимального источника FBS, число клеток должно удваиваться каждые 18 до 24 ч.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
|
References
- Barlow, C. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86, 159-171 (1996).
- Elson, A. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).
- Kuang, X. Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone. Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).
- Browne, S. E. Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice. Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).
- Jacks, T. Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice. Curr Biol. 4, 1-7 (1994).
- Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice. Leukemia. 15, 141-147 (2001).
- Sharma, V. M. Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc. Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).
- Maser, R. S. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447, 966-971 (2007).
