Härledning av thymic Lymfom T-cellinjer från Atm ^{- / - Och P53 - / - Möss}

Summary

I denna video visar vi ett protokoll för att upprätta mus thymic linjer lymfom cell. Genom att följa detta protokoll, har vi framgångsrikt etablerat flera T-cellinjer från ATM-/ - och p53-/ - möss med thymic lymfom.

Abstract

Etablerade cellinjer är en kritisk forskning verktyg som kan minska användningen av försöksdjur i forskning. Vissa stammar av genetiskt modifierade möss, som ATM ^{- / -} och p53 ^{- / -} utvecklar ständigt thymic lymfom tidigt i livet ^1,2, och därmed kan fungera som en tillförlitlig källa för härledning av murina T-cellinjer. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för utveckling av etablerade murina thymic lymfom T-cellinjer, utan att behöva lägga interleukiner som beskrivs i tidigare protokoll ^1,3. Tumörer skördades från möss i åldrarna tre till sex månader, vid första tecken på synliga tumörer bygger på observationer av krökt kroppshållning, ansträngd andning, dålig grooming och slösa i en känslig stam ^1,4. Vi har framgångsrikt etablerat flera T-cellinjer med hjälp av detta protokoll och inavlade stammar av ATM ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] ² och p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] ⁵ möss. Vi visar vidare att mer än 90% av de etablerade T-cells befolkningen uttrycker CD3, CD4 och CD8. I överensstämmelse med stabilt etablerade cellinjer, har T-celler som genereras med hjälp av detta protokoll har passerats i över ett år.

Protocol

1. Dissekering av tumör

1. För tumör dissektion, är en ren pappershandduk eller disponibel kirurgiska drapera placeras på dissekering pad och besprutas med 70% etanol.
2. Möss för detta protokoll rutinmässigt avlivas med CO _2. Placera euthanized musen på dissekering pad och spraya båda sidor av djur med etanol. Musen hålls på plats på dissektion plattan med hjälp av fyra eller fler driva stift in genom ben och sprutade noggrant med 70% etanol.
3. Huden över mittlinjen skärs från pubis till basen av huvudet med hjälp av steril sax och samtidigt undvika de underliggande musklerna och tränger in i kroppen håligheter.
4. Öppna bukhålan med ett par nya steril sax och pincett var noga med att inte skada de inre organen.
5. Öppna brösthålan genom att dissekera och avleda bröstkorgen att avslöja tumören, utan att skada blodkärl.
6. Separera tumören från andra organ, och överföra en bit ca 40-50% av den totala tumören (ungefär 1,5 x 0,8 x 0,8 cm) i kallt PBS hålls på is.
7. Resterande del av tumören kan sparas för andra analyser och en komplett obduktion kan utföras vid denna tid.

2. Odling lymfomceller

1. Spraya röret med dissekerade tumören med 70% etanol och överför till en biosäkerhet skåp.
2. Tillsätt 10 ml odlingsmedium till en steril 150 mm ² petriskål.
3. Överför bit av tumören i petriskålen genom varsam sug med en pipett.
4. Böj två sterila 18 gauge kanyl mot det avfasade sidan ut.
5. Dissociera tumören med böjda nålar.
6. Snurra skålen, tryck försiktigt och placera i en vinkel för att samla cellsuspensionen till en sida, och samtidigt undvika stora bitar av tumör.
7. Sug cellsuspensionen och överför till en 50 ml koniska rör och samtidigt undvika stora bitar av tumör.
8. Tvätta plattan med 10 ml medium och överför till samma rör och samtidigt undvika stora bitar av tumör.
9. Blanda cellsuspension bestående av lymfocyter och stromaceller försiktigt och Överför 5 ml till en T-25 vävnadsodling kolv och 10 ml till en T-75 vävnadskultur kolv. Vagga försiktigt kolvarna.
10. Använd den återstående cellsuspension att göra 2, 4, 10.100 och 1000 gånger utspädningar i 2,5 mL slutlig volym (odling celler vid olika densitet med hjälp av flera olika typer av odlingskärl maximerar sannolikheten för upprättande av en T-cell linje).
11. Plate 2,0 ml av varje spädning i enskilda brunnar i en 6-brunnar. Snurra försiktigt plattan.
12. Inkubera cellerna för 48 h på fuktad CO ₂ atmosfär i luften.

3. Utfodring lymfomceller

1. Efter 48 h inkubering, tillsätt 5 ml av medium till T-25 kolv och 10 ml medium till T-75 kolv längs väggen med minimal störning av celler.
2. Tillsätt 2 ml medium till varje brunn på 6-brunnar längs väggen med minimal störning av celler.
3. Inkubera cellerna i ytterligare 72 h.

4. Passaging lymfomceller

1. Inledande passage
   1. Vid slutet av den femte dagen av inkubation, är de celler passerats i förhållandet 1:1, men behåller den ursprungliga kolvar och tallrikar (upprätthålla celltäthet vid en koncentration av cirka 3x106 / ml under de första passagerna främjar lyckad etablering av ett kontinuerlig cellinje).
      1. För T-25 kolven, överföring 5 ml cellsuspension i en ny kolv som innehåller 5 ml medium. Tillsätt 5 ml av mediet i den ursprungliga kolven.
      2. För T-75 kolv, överföring 10 ml cellsuspension i en ny kolv innehållande 10 ml medium. Tillsätt 10 ml av mediet i den ursprungliga kolven.
      3. För 6-brunnar, överföring 2 ml cellsuspension från varje brunn till motsvarande brunnar på en ny platta som innehåller 2 ml av mediet i varje brunn. Tillsätt 2 ml medium i varje brunn av den ursprungliga brunnar.
   2. Inkubera alla flaskor och plattor för ytterligare 72 h. I vår erfarenhet flesta cellinjer etablerade från dessa passagen en kulturer (det finns löst vidhäftande aggregat fjädring cell över bifogade stromaceller är en tidig indikation på en etablerad cellinje).
   3. För kulturer med färre eller inga löst fastsittande fjädring aggregat cell, foder kolvarna eller plattor genom att försiktigt byta ut ca 50% av de medel var 72 h. För att undvika att ta bort celler från den ursprungliga kulturen, är odlingskärl stående och ostörd i minst 5 minuter för att låta cellerna sediment på botten av gravitationen innan försiktig uppsugning av supernatanten medium.
2. Att bibehålla etablerade cellinjer
   1. Etablerade cellinjer som passerats i nya flaskor och tallrikar. För T-25 och T-75 flaskor, tillsätt 5 ml av den ursprungliga ellerpassage en avstängning i 5 ml medium. För 6-brunnars plattor, tillsätts 3 ml av den ursprungliga eller passage en cellsuspension i 7 ml av mediet i en T-25 kolven. Foder och behålla den ursprungliga eller passage en kultur genom att ersätta den volym bort med färska odlingsmedium.
   2. Passage etablerade cellinjer in nya T-25 kolvar. De cellinjer har en fördubbling tid 18-24 h. Kulturerna rutinmässigt hålls på en täthet av 1-3x106 / ml och passerats var 3 dagar. Lägg till önskad volym av tidigare passage kultur för nytt medium att göra upp till 10 ml. Foder och behålla den ursprungliga kulturen.
   3. Efter några passager, kommer den icke-häftande celler klara sig själv utan den tillhörande stromaceller och ett mindre antal anhängare celler överförs vid varje passage. Bortom denna punkt kan de kulturer hållas i icke-vävnadsodling behandlas T-25 kolvar.

5. Frysning och Återställa Lines lymfom Cell

1. De cellinjer är frysta i nyberedd RPMI 1640 medium som innehåller 20% FBS och 10% DMSO.
2. Celler från en 48 timmar gammal kultur i T-25 kolv (ca 1.5x10 ⁶ celler / ml) centrifugeras vid 1500 rpm i 5 minuter vid rumstemperatur. Efter att kasta supernatanten, är de celler resuspenderas i 2 ml kallt fryser medium. Två 1,0 mL volymer cellsuspensionen från varje kolv är placerade i frysning flaskor, omedelbart fryses vid -80 ° C, och överföras till flytande kväve följande dag.
3. Celler återvinns från flytande kväve lagring genom snabb upptining och resuspending innehållet i 10 ml färska odlingsmedium. Alternativt är färsk tinas cellerna tvättas en gång i varma odlingsmedium för att ta bort DMSO innan resuspending i 10 ml färska odlingsmedium. Cellerna odlas i minst 72 timmar före efterföljande antagande.

6. Representativa resultat

En ATM ^{- / -} T-cell linje utvecklats med hjälp av det här protokollet och utsett DWJ-ATM-1 präglades av färgning med anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC och anti-CD8-PE och flödescytometri analys (figur 1). Mer än 90% av T-celler var CD3, CD4 och CD8 triple-positiv.

Figur 1. Karakterisering av en T-cell linje utvecklats med hjälp av detta protokoll.

Cellytan markörer för en etablerad ATM ^{- / -} cellinje utsetts DWJ-ATM-1 präglades av färgning med anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, anti-CD8-PE och flödescytometri analys. Kortfattat var 1x10 ⁶ friska celler tvättas en gång i kallt PBS (1500 varv / 5 min), och inkuberas vid 4 ° C i 10 min med 200 mikroliter av antikroppar cocktail (varje antikropp vid 1:200 spädning i PBS med 1% BSA. Celler kan undersökas omedelbart medan färska eller fastställts för senare analys. Fasta celler bereds genom att tillsätta buffrat neutrala formalin på 4% (vol / vol) slutlig koncentration och inkuberas vid 4 ° C i 30 min, skördas genom centrifugering (1500 varv / 5 min) och suspenderade i 200 mikroliter av PBS med 1% BSA. Sammanlagt 1 X 10 ⁴ celler analyserades med hjälp av en BD FACS Calibur analysatorn och CellQuest programvara (BD Biosciences, San Jose, CA).

Discussion

I detta protokoll, vi tillhandahåller detaljerade förfaranden för att upprätta murin T-cellinjer från två olika möss genotyper, ATM ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] och p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] . Genom att använda detta protokoll, totalt 6 (av 7 försök) ATM ^{- / -} och tre (av 5 försök) p53 ^{- / -} murin T-cellinjer har fastställts i vårt laboratorium. Representativa uppgifter som visar att cellinje DWJ-ATM-1, en ​​ATM ^{- / -} cellinje består av en cell population där mer än 90% av cellerna uttrycker CD3, CD4 och CD8 markörer yta bekräfta att klonal T-cell linje kan etablerat med våra protokoll.

Utveckling av murina T-cellinjer har rapporterats ^3,6,7, men har detaljerade protokoll för upprättandet av dessa linjer inte beskrivits tidigare. Även om endast två mus genotyper har använts för härledning av murina T-cellinjer i vårt laboratorium, tror vi att dessa förfaranden är tillämpliga på ett brett spektrum av spontana T-cellslymfom i andra stammar av möss som Kras defekt, och eventuellt andra djurarter. Murina T-cellinjer kan tillämpas för att förstå grundläggande frågor inom immunologi och onkologi. För närvarande är vi med hjälp av dessa cellinjer i studier som syftar till att karakterisera värd-patogen interaktioner och genotoxin-inducerad cytotoxicitet inklusive mekanismer för cellcykelarrest och apoptos. Med tanke på att murina T-cellinjer dela genomiska förändringar, såsom strykningar av PTEN och FBXW7 gemensamt med akut humant T-cell lymfatisk leukemi och lymfom, de är särskilt väl lämpade för forskning inom cancerbiologi ^8, och kan ha ytterligare ansökningar för snabb pre -kliniska effekten screening av immunologiska och cytostatikabehandling in vitro. Huruvida dessa cellinjer kan fortplantas in vivo i antingen syngena eller med nedsatt immunförsvar möss har inte fastställts.

I motsats till tidigare protokoll som lyckas upprätta en T-cell linje tog upp till tre månader ^6, cellinjer utvecklats med det nuvarande protokollet var etablerat i en månad (mellan passage 2-8). Vi fann att förekomsten av löst vidhäftande cellaggregat över bifogade stromaceller är en kritisk tidig indikation på en etablerad cellinje. För att möjliggöra murina T-celler att föröka på obestämd tid, fann vi också att det är viktigt att lämna den inledande löst vidhäftande cellaggregat ostört under matning. Dessutom bibehålla celltätheten vid en koncentration av cirka 3x10 ⁶ / ml under de första passagerna främjar även lyckas upprätta en kontinuerlig cellinje. Enligt vår erfarenhet maximerar odling celler vid olika densitet med hjälp av flera olika typer av odlingskärl sannolikheten för upprättande av en T-cell linje. De flesta T-cellinjer bildades från T-75 flaskor eller 6-brunnar och 10 eller 100 gånger spädningar vilket motsvarar cirka 1x10 ⁷ eller 1x10 ⁶ celler / ml. En tidigare protokollet rekommenderas odling cellerna på 5 x 10 ^6, 1 x10 ^7, och 2 x 10 ⁷ celler per väl i 6-brunnars plattor, och utfodring efter 7 dagar (7). Vi observerade att utfodring första kulturer i 48 h och passagen 72 timmar senare, på dag 5 är optimal. Väntar längre tid innan den första utfodring och passagen gör att cellerna förlorar sin livskraft och sluta dela sig.

Den sista parametern som vi funnit är avgörande för en framgångsrik spridning av murina T-celler in vitro är förekomsten av FBS i odlingsmediet som kan stödja en snabb celltillväxt. Olika partier och leverantörer av FBS ska kontrolleras före start härledningen av T-cellinjer för identifiering av lämpliga reagens. Om murina T-cellinjer är inte tillgängliga för screening, primära kulturer av thymic lymfocyter placeras i brunnar i en 24-brunnar vid en koncentration av 1x10 ⁶ per mL testmediet innehåller concanavalin A (1μg / ml) för att stimulera en snabb celltillväxt är tillräcklig. I närvaro av en optimal källa av FBS, bör antalet celler fördubblas var 18 till 24 timmar

Materials

Ice bucket 70% ethanol Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins Two sets of small sterile scissors and forceps Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13) Sterile 18 gauge needles 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829) 10% buffered formalin Tissue culture flasks T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025) T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075) 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506) Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS) Culture medium RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following: 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03) 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI) 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI) 55 mM 2β-mercapt–thanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752) Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275) Antibodies (eBioScience, San Diego, CA) anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85) anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83) anti-CD8-PE (cat.#12-081-85) Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017) Concanavalin A (Sigma cat# C5275) 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)