Dérivation des thymique lymphome à cellules T à partir des lignes Atm ^{- / - Et - / - Souris}

Summary

Dans cette vidéo, nous démontrons un protocole pour établir la souris des lignées cellulaires de lymphome thymique. En suivant ce protocole, nous avons établi avec succès plusieurs lignées de lymphocytes T de l'ATM-/ - et p53-/ - ont un lymphome thymique.

Abstract

Des lignées cellulaires établies sont un outil de recherche critique qui peut réduire l'utilisation des animaux de laboratoire dans la recherche. Certaines souches de souris génétiquement modifiées, telles que ATM ^{- / -} et p53 ^{- / -} constamment développer un lymphome thymique tôt dans la vie ^1,2, et donc, peut servir comme une source fiable pour la dérivation de cellules T murines lignes. Nous présentons ici un protocole détaillé pour le développement des établis murin thymique lymphome à cellules T lignes sans avoir besoin d'ajouter les interleukines comme décrit dans les protocoles antérieurs ^1,3. Les tumeurs ont été récoltés à partir des souris âgées de trois à six mois, à la première indication de tumeurs visibles basée sur l'observation d'une posture voûtée, respiration laborieuse, le toilettage pauvres et gaspiller dans une souche sensible ^1,4. Nous avons établi avec succès plusieurs lignées de lymphocytes T en utilisant ce protocole et de souches pures de l'ATM ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] ² et p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] ⁵ souris. Nous avons également démontré que plus de 90% de la place des cellules T CD3 population exprime, CD4 et CD8. Conformément aux lignées cellulaires établies de façon stable, les cellules T générées par l'utilisation du présent protocole ont été repiquées pendant plus d'un an.

Protocol

1. La dissection de la tumeur

1. Pour la dissection tumorale, une serviette en papier propre ou jetable drap chirurgical est placé sur le pavé de dissection et pulvérisé avec de l'éthanol à 70%.
2. Souris pour ce protocole sont systématiquement euthanasiés avec du CO _2. Placez la souris euthanasiées sur le pavé de dissection et de pulvérisation des deux côtés de l'animal avec de l'éthanol. La souris est maintenu en place sur le pad de dissection en utilisant quatre ou plus punaises inséré par les jambes et pulvérisé à fond avec de l'éthanol à 70%.
3. La peau sur la ligne médiane est coupé du pubis à la base de la tête par l'aide de ciseaux stériles, tout en évitant les muscles sous-jacents et pénétrant dans les cavités du corps.
4. Ouvrez la cavité abdominale avec une nouvelle paire de ciseaux stériles et en faisant attention à ne pas endommager les organes internes.
5. Ouvrez la cage thoracique, en disséquant et dévier la cage thoracique pour révéler la tumeur, sans endommager les vaisseaux sanguins.
6. Séparez les tumeurs d'autres organes, et de transférer une pièce d'environ 40-50% de la tumeur au total (environ jusqu'à 1,5 x 0,8 x 0,8 cm) dans du PBS froid conservés sur la glace.
7. La portion restante de la tumeur peuvent être sauvegardées pour d'autres épreuves et une autopsie complète peut être effectuée à ce moment.

2. La culture des cellules de lymphome

1. Vaporiser le tube contenant la tumeur disséqué avec de l'éthanol 70% et le transfert à un poste de sécurité microbiologique.
2. Ajouter 10 ml de milieu de culture stérile à un 150 mm ² boîtes de Pétri.
3. Transférer le morceau de la tumeur dans la boîte de Petri par aspiration douce avec une pipette.
4. Pliez deux stériles aiguille de calibre 18 faisant face au côté biseauté sur.
5. Dissocier la tumeur en utilisant les aiguilles tordues.
6. Swirl le plat, appuyez doucement et laisser à un angle de recueillir la suspension cellulaire à un côté, tout en évitant les gros morceaux de tumeur.
7. Aspirer la suspension cellulaire et transférer dans un tube conique de 50 ml, tout en évitant les gros morceaux de tumeur.
8. Laver la plaque avec 10 ml de milieu et de transfert dans le même tube tout en évitant les gros morceaux de tumeur.
9. Mélanger la suspension cellulaire composé de lymphocytes et les cellules stromales en douceur et de transfert de 5 ml dans un flacon T-25 de culture de tissus et de 10 ml dans un T-75 flacon de culture tissulaire. Remuer doucement le flacon.
10. Utiliser la suspension de cellules restant à faire des dilutions de 2, 4, 10100 et 1000 fois plus 2,5 ml volume final (culture de cellules à des densités différentes en utilisant plusieurs types de récipients de culture maximise la probabilité d'établir une lignée de cellules T).
11. Plate 2,0 ml de chaque dilution dans des puits individuels d'une plaque de 6 puits. Agiter doucement la plaque.
12. Incuber les cellules pendant 48 h en atmosphère de CO ₂ dans l'air humidifié.

3. Nourrir les cellules de lymphome

1. Après 48 h d'incubation, ajouter 5 ml de milieu dans le flacon T-25 et 10 mL de milieu dans le flacon T-75 le long du mur avec une perturbation minimale des cellules.
2. Ajouter 2 mL de milieu de chaque puits de la plaque de 6 puits le long du mur avec une perturbation minimale des cellules.
3. Incuber les cellules pour une période supplémentaire de 72 h.

4. Le repiquage des cellules de lymphome

1. Passage initial
   1. A la fin du cinquième jour d'incubation, les cellules sont repiquées dans un rapport 1:1, tout en conservant les flacons d'origine et de plaques (maintien de la densité cellulaire à une concentration d'environ 3x106 / mL durant les premiers passages favorise l'établissement réussi d'un lignée cellulaire continue).
      1. Pour le flacon T-25, le transfert de 5 mL de suspension cellulaire dans un nouveau flacon contenant 5 ml de milieu. Ajouter 5 ml de milieu dans le flacon d'origine.
      2. Pour le flacon T-75, le transfert de 10 mL de suspension cellulaire dans un nouveau flacon contenant 10 ml de milieu. Ajouter 10 ml de milieu dans le flacon d'origine.
      3. Pour la plaque de 6 puits, transférer 2 ml de suspension cellulaire dans chaque puits dans les puits correspondants d'une nouvelle plaque contenant 2 mL de milieu dans chaque puits. Ajouter 2 mL de milieu dans chaque puits des puits d'origine.
   2. Incuber tous les flacons et les plaques pour une période supplémentaire de 72 h. Dans notre expérience, la plupart des lignées cellulaires établies à partir de ces cultures seul passage (la présence d'agrégats de cellules faiblement adhérentes de suspension sur les cellules stromales est attachée une indication précoce d'une lignée cellulaire établie).
   3. Pour les cultures avec peu ou pas d'agrégats faiblement adhérentes de cellules en suspension, les aliments pour les flacons ou des plaques en prenant soin de remplacer environ 50% de la moyenne toutes les 72 h. Pour éviter de prélever des cellules de la culture d'origine, des récipients de culture sont laissés debout et au repos pendant au moins 5 min pour laisser le sédiment des cellules vers le bas par gravité avant d'aspiration douce du milieu surnageant.
2. Le maintien des lignées cellulaires établies
   1. Des lignées cellulaires établies sont passées dans des flacons de nouvelles plaques. Pour T-25 et T-75 flacons, ajoutez 5 ml de l'original ouseul passage suspension dans 5 ml de milieu. Pour plaques de 6 puits, ajouter 3 mL de l'original ou de passage une suspension cellulaire dans 7 ml de milieu dans un flacon T-25. Flux et conserver l'original ou le passage d'une culture en remplaçant le volume enlevé du milieu de culture frais.
   2. Passage des lignées cellulaires établies dans les nouveaux T-25 flacons. Les lignées cellulaires ont un temps de doublement de 18-24 h. Les cultures sont régulièrement maintenus à une densité de 1-3x106 / mL et passées tous les 3 jours. Ajouter le volume nécessaire de la culture précédent passage dans le nouveau milieu pour faire un maximum de 10 ml. Flux et de conserver la culture d'origine.
   3. Après quelques passages, les cellules non adhérentes seront auto maintenir sans les cellules stromales adhérentes et un plus petit nombre de cellules adhérentes sont reportés à chaque passage. Au-delà de ce point, les cultures peuvent être maintenues en culture de tissus non traités T-25 flacons.

5. Le gel et la récupération lignées cellulaires de lymphome

1. Les lignées cellulaires sont congelés dans fraîchement préparés milieu RPMI 1640 contenant 20% de FBS et 10% de DMSO.
2. Les cellules d'une culture vieille de 48 h T-25 flacon (environ 1.5x10 ⁶ cellules / ml) sont centrifugés à 1500 rpm pendant 5 min à température ambiante. Après élimination du surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 2 mL de milieu de congélation froid. Deux volumes 1,0 ml de suspension cellulaire de chaque flacon sont placés dans des flacons de gel, immédiatement congelés à -80 ° C, et transféré à l'azote liquide le lendemain.
3. Les cellules sont récupérées à partir de stockage d'azote liquide par décongélation rapide, et la remise en suspension du contenu dans 10 ml de milieu de culture frais. Alternativement, des cellules fraîchement décongelées sont lavées une fois en milieu de culture chaud pour éliminer le DMSO, avant la remise en suspension dans 10 ml de milieu de culture frais. Les cellules sont cultivées pendant au moins 72 h avant le passage ultérieur.

6. Les résultats représentatifs

Un distributeur de billets ^{- / -} T lignée cellulaire développée en utilisant ce protocole et désigné DWJ-ATM-1 a été caractérisé par une coloration anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC et anti-CD8-PE et de l'analyse par cytométrie en flux (Figure 1). Plus de 90% des cellules T CD3-été, CD4 et CD8 triple positif.

Figure 1. Caractérisation d'une lignée de cellules T développées en utilisant ce protocole.

Les marqueurs de surface cellulaire d'un guichet automatique mis en place ^{- / -} lignée cellulaire désigné DWJ-ATM-1 ont été caractérisées par une coloration anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, anti-CD8-PE et l'analyse par cytométrie de flux. En bref, 1X10 ⁶ cellules fraîches ont été lavées une fois dans du PBS froid (1500 tr / min 5), et incubées à 4 ° C pendant 10 min avec 200 pi de cocktail d'anticorps (anticorps à chaque 1:200 dilution dans du PBS avec 1% de BSA. Les cellules peuvent être examinées immédiatement à l'état frais ou fixes pour une analyse ultérieure. cellules fixes sont préparés en ajoutant du formol tamponné neutre à une concentration de 4% (vol / vol) finale et incubées à 4 ° C pendant 30 min, récoltées par centrifugation (1500 tr / 5 min) et remis en suspension dans 200 ul de PBS avec 1% de BSA. Un total de 1 X 10 ⁴ cellules ont été analysées en utilisant une BD FACS Calibur analyseur et CellQuest logiciels (BD Biosciences, San Jose, CA).

Discussion

Dans ce protocole, nous fournir des procédures détaillées pour établir murin lignées de lymphocytes T à partir de deux génotypes différents de souris; ATM ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] et p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] . En utilisant ce protocole, un total de 6 (sur 7 tentatives) ATM ^{- / -} et trois (sur 5 tentatives) p53 ^{- / -} murins lignées de lymphocytes T ont été établis dans notre laboratoire. Des données représentatives démontrant que la lignée cellulaire DWJ-ATM-1, un guichet automatique ^{- / -} lignée cellulaire consiste en une population de cellules dans lesquelles plus de 90% de l'express cellules CD3, CD4 et CD8 des marqueurs de surface confirme que clonale de cellules T de ligne peut être établie à l'aide de notre protocole.

Développement des lymphocytes T murins lignes ont été signalés ^3,6,7, cependant, des protocoles détaillés pour l'établissement de ces lignes n'ont pas été décrites précédemment. Bien que seulement deux génotypes de souris ont été utilisés pour la dérivation de cellules T murines lignes dans notre laboratoire, nous croyons que ces procédures sont applicables à un large éventail de spontanée lymphomes T trouvées dans d'autres souches de souris telles que Kras défectueux, et potentiellement d'autres espèces animales. Murin lignées de lymphocytes T ont des applications potentielles dans la compréhension de questions fondamentales en immunologie et en oncologie. Actuellement, nous utilisons ces lignées cellulaires dans des études visant à caractériser les interactions hôte-pathogène et génotoxine cytotoxicité induite notamment des mécanismes d'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose. Étant donné que les cellules T murines lignes part altérations génomiques telles que les suppressions de PTEN et FBXW7 en commun avec aiguë des cellules T humaines leucémies lymphoblastiques et les lymphomes, ils sont particulièrement bien adaptés pour la recherche en biologie du cancer ^8, et peut avoir d'autres demandes de pré rapide cliniques de dépistage immunologique efficacité des agents chimiothérapeutiques et le cancer in vitro. Que ce soit ou non ces lignées cellulaires peuvent être propagées in vivo dans des souris syngéniques soit ou immunodéprimés n'a pas été déterminée.

Contrairement aux précédents protocoles dans lesquels l'établissement réussi d'une lignée de cellules T ont pris jusqu'à trois mois ^six lignées de cellules développées en utilisant le protocole actuelles ont été établies dans un mois (entre le passage 2-8). Nous avons constaté que la présence d'agrégats de cellules faiblement adhérentes plus attachés cellules stromales est une indication essentielle début d'une lignée cellulaire établie. Afin de permettre à cellules T murin de se propager indéfiniment, nous avons également constaté qu'il est important de laisser les agrégats de cellules initiales faiblement adhérentes dérangés pendant les tétées. En outre, le maintien de la densité cellulaire à une concentration d'environ 3x10 ⁶ / ml au cours des premiers passages favorise également la création réussie d'une lignée cellulaire continue. Dans notre expérience, la culture de cellules à des densités différentes en utilisant plusieurs types de récipients de culture maximise la probabilité d'établir une ligne de T-cellule. La plupart des lignées de lymphocytes T ont été établies à partir de flacons T-75 ou des plaques de 6 puits et de 10 ou 100 dilutions qui correspond à environ 1x10 ⁷ ou 1x10 ⁶ cellules / ml. Un protocole précédent recommandée en culture de cellules de 5 x 10 ^6, 1 x10 ^7, et 2 x 10 ⁷ cellules par puits dans des plaques 6 puits, et l'alimentation après 7 jours (7). Nous avons observé que l'alimentation des cultures initiales à 48 h et 72 h le passage plus tard, le jour 5 est optimale. Attendre plus longtemps avant le premier repas et le passage provoque les cellules perdent leur viabilité et arrêtent de se diviser.

Le dernier paramètre que nous avons trouvé est essentielle à la propagation réussie de murin de cellules T in vitro est la présence de FBS dans le milieu de culture qui puisse soutenir la croissance cellulaire rapide. Différents lots et des fournisseurs de FBS devraient être examinés avant d'initier la dérivation de lignées de lymphocytes T pour l'identification d'un réactif approprié. Si murin lignées de lymphocytes T ne sont pas disponibles pour le dépistage, des cultures primaires de lymphocytes thymiques placés dans les puits d'une plaque de 24 puits à une concentration de 1x10 ⁶ par ml de milieu d'essai contenant la concanavaline A (1 pg / ml) pour stimuler la croissance cellulaire rapide est adéquate. En présence d'une source optimale de FBS, le nombre de cellules devrait doubler tous les 18 à 24 h.

Materials

Ice bucket 70% ethanol Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins Two sets of small sterile scissors and forceps Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13) Sterile 18 gauge needles 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829) 10% buffered formalin Tissue culture flasks T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025) T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075) 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506) Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS) Culture medium RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following: 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03) 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI) 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI) 55 mM 2β-mercapt–thanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752) Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275) Antibodies (eBioScience, San Diego, CA) anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85) anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83) anti-CD8-PE (cat.#12-081-85) Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017) Concanavalin A (Sigma cat# C5275) 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)