Derivación de linfoma tímico líneas de células T de Atm ^{- / - Y P53 - / - Ratones}

Summary

En este video se demuestra un protocolo para establecer ratón timo líneas celulares de linfoma. Siguiendo este protocolo, hemos establecido con éxito varias líneas de células T de la ATM-/ - y p53-/ - ratones con linfoma del timo.

Abstract

Las líneas celulares establecidas son una herramienta de investigación fundamental que puede reducir el uso de animales de laboratorio en la investigación. Ciertas cepas de ratones genéticamente modificados, tales como ATM ^{- / -} y p53 ^{- / -} consistentemente desarrollar linfoma del timo primeros años de vida ^1,2, y por lo tanto, puede servir como una fuente confiable para la derivación de murino líneas de células T. Aquí presentamos un protocolo detallado para el desarrollo de linfomas tímicos murinos establecido líneas de células T, sin necesidad de añadir las interleucinas como se describe en los protocolos anteriores ^1,3. Los tumores se cosecharon de los ratones de tres a seis meses, en la primera indicación de tumores visibles sobre la base de la observación de la postura encorvada, dificultad para respirar, la preparación pobre y perder en un ^1,4 cepa susceptible. Hemos establecido con éxito varias líneas de células T que utilizan este protocolo y cepas puras de ATM ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] ² y p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] ⁵ ratones. Además, demuestran que más del 90% de lo establecido población de células T expresa CD3, CD4 y CD8. De acuerdo con las líneas celulares establecidas de forma estable, las células T generados por el uso del presente Protocolo se han pases para más de un año.

Protocol

1. La disección del tumor

1. Para la disección del tumor, una toalla de papel o paño quirúrgico desechable se coloca en la plataforma de la disección y rociado con etanol al 70%.
2. Los ratones de este protocolo son habitualmente sacrificados con CO _2. Coloque el ratón sacrificados en la plataforma de la disección y el spray ambos lados del animal con etanol. El ratón se mantiene en su lugar en la almohadilla de la disección a través de cuatro o más alfileres inserta a través de las piernas y los roció abundantemente con etanol al 70%.
3. La piel que cubre la línea media se corta desde el pubis hasta la base de la cabeza con unas tijeras estériles, evitando al mismo tiempo los músculos subyacentes y penetrar en las cavidades del cuerpo.
4. Abrir la cavidad abdominal con un nuevo par de tijeras y pinzas estériles, teniendo cuidado de no dañar los órganos internos.
5. Abrir la cavidad torácica por disección y desviar la caja torácica para revelar el tumor, sin dañar los vasos sanguíneos.
6. Separar el tumor de otros órganos, y la transferencia de una pieza de aproximadamente el 40-50% del total del tumor (aproximadamente de 1,5 x 0,8 x 0,8 cm) en PBS frío se mantienen en hielo.
7. La parte restante del tumor se pueden guardar para otros ensayos y una necropsia completa puede llevarse a cabo en este momento.

2. El cultivo de células del linfoma

1. Rocíe el tubo que contiene el tumor disecada con un 70% de etanol y la transferencia de un gabinete de bioseguridad.
2. Agregar 10 ml de medio de cultivo estéril a un 150 mm ² placa de Petri.
3. La transferencia de la pieza de tumor en la placa de Petri por succión suave con una pipeta.
4. Doble dos estéril aguja de calibre 18 frente a la cara biselada hacia fuera.
5. Disociar el tumor mediante las agujas dobladas.
6. Agite el plato, golpear suavemente y coloque en un ángulo para recoger la suspensión celular a un lado, evitando al mismo tiempo grandes trozos de tumor.
7. Aspirar la suspensión celular y transferir a un tubo cónico de 50 ml, evitando grandes trozos de tumor.
8. Lavar la placa con 10 ml de medio y de transferencia en el mismo tubo, evitando grandes trozos de tumor.
9. Mezcle la suspensión celular compuesto por linfocitos y células del estroma con suavidad y la transferencia de 5 ml en un matraz de tejido T-25 y la cultura de 10 ml en un T-75 frasco de cultivo de tejidos. Hacer girar suavemente cada vial.
10. Use la suspensión celular restante para hacer diluciones 2, 4, 10100 y 1000 veces en 2,5 ml de volumen final (el cultivo de células en diferentes densidades, utilizando varios tipos de recipientes de cultivo maximiza la probabilidad de establecer una línea de células T).
11. Placa de 2,0 ml de cada dilución en pocillos individuales de una placa de 6 pocillos. Remover con suavidad la placa.
12. Se incuban las células durante 48 h en atmósfera de CO ₂ humidificado en el aire.

3. La alimentación de las células del linfoma

1. Después de 48 h de incubación, añadir 5 ml de medio en el matraz T-25 y 10 ml de medio en el matraz T-75 a lo largo de la pared con la mínima perturbación de las células.
2. Añadir 2 ml de medio en cada pocillo de la placa de 6 pocillos a lo largo de la pared con la mínima perturbación de las células.
3. Se incuban las células durante otras 72 h.

4. Pases las células del linfoma

1. Aprobación inicial
   1. Al final del quinto día de incubación, las células se pasan en una proporción de 1:1, mientras que conserva los frascos originales y las placas (el mantenimiento de la densidad de las células a una concentración de aproximadamente 3x106 / ml durante los primeros pasos promueve el establecimiento exitoso de una línea celular continua).
      1. Para el frasco T-25, la transferencia de 5 ml de suspensión celular en un nuevo frasco que contenía 5 ml de medio. Añadir 5 ml de medio en el matraz original.
      2. Para el frasco T-75, la transferencia de 10 ml de suspensión celular en un nuevo frasco contiene 10 ml de medio. Agregar 10 ml de medio en el frasco original.
      3. Para la placa de 6 pocillos, la transferencia de 2 ml de suspensión celular de cada pozo en los pozos correspondientes de una nueva placa que contiene 2 ml de medio en cada pocillo. Añadir 2 ml de medio en cada pocillo de los pozos original.
   2. Incubar todos los frascos y las placas de un adicional de 72 h. En nuestra experiencia la mayoría de líneas celulares establecidas a partir de estos pasajes una cultura (la presencia de agregados celulares de baja adherencia de suspensión sobre las células del estroma se adjunta una indicación temprana de una línea celular establecida).
   3. Para los cultivos con menos o ningún agregados suspensión de baja adherencia celular, alimentar a los frascos o placas con cuidado reemplazando aproximadamente el 50% de la media cada 72 h. Para evitar la eliminación de las células de la cultura original, recipientes de cultivo se dejan en pie y en reposo durante al menos 5 minutos a que el sedimento células en la parte inferior por gravedad antes de la aspiración suave del medio sobrenadante.
2. El mantenimiento de líneas celulares establecidas
   1. Las líneas celulares establecidas se pasan en nuevos frascos y las placas. Para T-25 y T-75 frascos, añadir 5 ml del original o depaso de una suspensión en 5 ml de medio. Para placas de 6 pocillos, agregar 3 ml de la suspensión celular original o un paso en 7 ml de medio en un frasco T-25. Alimentar y conservar el original o el paso de una cultura mediante la sustitución del volumen extraído con medio de cultivo fresco.
   2. Paso las líneas celulares establecidas en los nuevos T-25 frascos. Las líneas de células tienen un tiempo de duplicación de 18 a 24 h. Los cultivos se mantienen rutinariamente a una densidad de 1-3x106 / ml y se pasaron cada 3 días. Añadir el volumen necesario de la cultura pasaje anterior al nuevo medio para hacer hasta 10 ml. Alimentar y mantener la cultura original.
   3. Después de unos cuantos pasajes, las células no adherentes se auto sostenerse sin las células del estroma adherentes y un número menor de células adherentes se realizan a través de cada paso. Más allá de este punto, las culturas se pueden mantener en cultivo de tejidos no tratados T-25 frascos.

5. Congelación y recuperación de líneas celulares de linfoma

1. Las líneas celulares se congelan en el recién preparada RPMI 1640 que contenía FBS 20% y el 10% de DMSO.
2. Las células de un cultivo de 48 h de edad en el frasco T-25 (aproximadamente 1.5x10 ⁶ células / ml) se centrifuga a 1500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente. Después de descartar el sobrenadante, las células se resuspendieron en 2 ml de medio de un frío. Dos volúmenes de 1,0 ml de suspensión celular de cada frasco se colocan en viales de congelación, inmediatamente congelado a -80 ° C, y se transfieren a nitrógeno líquido al día siguiente.
3. Las células se recuperan de almacenamiento de nitrógeno líquido por descongelación rápida, y resuspender el contenido en 10 ml de medio de cultivo fresco. Alternativamente, las células recién descongeladas se lavan una vez en medio de cultivo caliente para eliminar el DMSO antes de resuspender en 10 ml de medio de cultivo fresco. Las células se cultivan durante al menos 72 horas antes de la aprobación posterior.

6. Resultados representante

Un cajero automático ^{- / -} T-línea celular desarrollada con este protocolo y designado DWJ-ATM-1 se caracterizó por la tinción con anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC y anti-CD8-PE y el análisis de citometría de flujo (Figura 1). Más del 90% de las células T se CD3, CD4 y CD8 de tres positivos.

Figura 1. Caracterización de una línea de células T desarrollado utilizando este protocolo.

Los marcadores de superficie celular de un cajero automático establecido ^{- / -} línea celular designado DWJ-ATM-1 se caracteriza por la tinción con anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, anti-CD8-PE y el análisis de citometría de flujo. En pocas palabras, 1x10 ⁶ células frescas se lavaron una vez en PBS frío (1500 rpm / 5 min), y se incubaron a 4 ° C durante 10 minutos con L de cóctel de anticuerpos (cada anticuerpo en la dilución 1:200 en PBS con BSA al 1% 200. Las células pueden ser examinados de inmediato mientras que las células fijas fresco o fijado para su posterior análisis. se preparan mediante la adición de formalina neutra tamponada a una concentración del 4% (vol / vol) final y se incubaron a 4 ° C durante 30 min, cosechadas por centrifugación (1500 rpm / 5 min) y se resuspendió en 200 l de PBS con BSA al 1%. Un total de 1 x 10 ⁴ células fueron analizadas mediante un analizador de BD FACS Calibur y CellQuest software (BD Biosciences, San Jose, CA).

Discussion

En este protocolo, se proporcionan procedimientos detallados para establecer murino líneas de células T a partir de dos genotipos diferentes del ratón, ATM ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] y p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] . Mediante el uso de este protocolo, un total de 6 (de 7 intentos) ATM ^{- / -} y tres (de 5 intentos) p53 ^{- / -} murino líneas de células T se han establecido en nuestro laboratorio. Los datos representativos que demuestran que la línea celular DWJ-ATM-1, un cajero automático ^{- / -} línea celular se compone de una población de células en las que más del 90% de las células CD3 expresa, CD4 y CD8 marcadores de superficie confirmar que clonal línea de células T puede ser establece mediante el protocolo.

Desarrollo de murino líneas de células T se ha informado ^3,6,7, sin embargo, los protocolos detallados para el establecimiento de estas líneas no se han descrito anteriormente. Aunque sólo dos genotipos del ratón se utiliza para la derivación de murino líneas de células T en nuestro laboratorio, creemos que estos procedimientos son aplicables a una amplia gama de espontánea linfomas de células T se encuentran en otras cepas de ratones como Kras defectuosos, y otros potencialmente especies animales. Murino líneas de células T tienen aplicaciones potenciales en la comprensión de cuestiones básicas de la inmunología y la oncología. Actualmente, estamos utilizando estas líneas celulares en los estudios dirigidos a caracterizar las interacciones huésped-patógeno y la citotoxicidad inducida por genotoxina incluidos los mecanismos de detención del ciclo celular y la apoptosis. Teniendo en cuenta que murino líneas de células T comparten alteraciones genómicas tales como deleciones de PTEN y FBXW7 en común con aguda de células T humanas leucemias linfoblásticas y los linfomas, que son especialmente adecuados para la investigación en biología del cáncer ^8, y puede tener aplicaciones más rápida para pre -clínicos de detección de la eficacia inmunológica y el cáncer de agentes quimioterápicos in vitro. Si estas líneas celulares se pueden propagar in vivo en ratones o singénico o inmunocomprometidos no ha sido determinada.

En contraste con los protocolos anteriores en los que el establecimiento exitoso de una línea de células T tomó ^seis a tres meses, las líneas celulares desarrolladas con el actual protocolo se establecieron dentro de un mes (entre el paso 2-8). Hemos encontrado que la presencia de agregados celulares de baja adherencia a las células del estroma adjunta es una indicación temprana crítica de una línea celular establecida. Con el fin de permitir que las células T murino para propagar de forma indefinida, también encontramos que es importante salir de los agregados celulares de baja adherencia inicial sin perturbaciones durante las comidas. Además, el mantenimiento de la densidad de las células a una concentración de aproximadamente 3x10 ⁶ / mL durante los primeros pasos también promueve el establecimiento exitoso de una línea celular continua. En nuestra experiencia, el cultivo de células en diferentes densidades, utilizando varios tipos de recipientes de cultivo maximiza la probabilidad de establecer una línea de células T. La mayoría de las líneas celulares T fueron establecidos desde el T-75 frascos o placas de 6 pocillos y 10 o 100 diluciones que corresponden a aproximadamente 1x10 ⁷ o 1x10 ⁶ células / ml. Un protocolo anterior se recomienda el cultivo de células de 5 x 10 ^6, 1 x 10 ^7, y 2 x 10 ⁷ células por pocillo en placas de 6 pocillos, y la alimentación después de 7 días (7). Hemos observado que la alimentación de los cultivos iniciales a las 48 horas y el paso 72 horas más tarde, el día 5 es el óptimo. Esperan más tiempo antes de la primera alimentación y el paso será hacer que las células pierden su viabilidad y dejan de dividirse.

El último parámetro que nos encontramos es fundamental para el éxito de la propagación de las células T murino in vitro es la presencia de FBS en el medio de cultivo que pueden apoyar el crecimiento rápido de las células. Diferentes lotes y los proveedores de FBS deben ser examinados antes de iniciar la derivación de líneas celulares T para la identificación de un reactivo apropiado. Si murino líneas de células T no están disponibles para la investigación, los cultivos primarios de linfocitos del timo coloca en pocillos de una placa de 24 pocillos a una concentración de 1x10 ⁶ por ml de medio de ensayo que contienen concanavalina A (1 g / ml) para estimular el crecimiento rápido de las células es la adecuada. En presencia de una fuente óptima de FBS, el número de células se duplica cada 18 a 24 h.

Materials

Ice bucket 70% ethanol Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins Two sets of small sterile scissors and forceps Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13) Sterile 18 gauge needles 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829) 10% buffered formalin Tissue culture flasks T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025) T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075) 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506) Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS) Culture medium RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following: 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03) 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI) 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI) 55 mM 2β-mercapt–thanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752) Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275) Antibodies (eBioScience, San Diego, CA) anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85) anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83) anti-CD8-PE (cat.#12-081-85) Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017) Concanavalin A (Sigma cat# C5275) 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)