Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تسجيل خلية كاملة من إعداد عضوي النمط شريحة من القشرة المخية الحديثة

Published: June 3, 2011 doi: 10.3791/2600
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center

Summary

هذا هو بروتوكول لإعداد والحفاظ على القشرة المخية الحديثة في إعداد شريحة الثقافة عضوي النمط لغرض صنع التسجيلات الكهربائية من العصبونات الهرمية.

Abstract

لقد تم دراسة الأدوار الوظيفية للتعبير والجهد بوابات قنوات البوتاسيوم في الخلايا العصبية المخية الحديثة هرمي من الفئران. بسبب عدم وجود وكلاء الدوائية محددة لهذه القنوات ، اتخذنا نهجا وراثية لمعالجة التعبير القناة. نستخدم إعداد عضوي النمط الثقافة (16) من أجل الحفاظ على التشكل الخلية ونمط الصفحي من القشرة. نحن عادة عزل شرائح القشرة المخية الحديثة الحادة في 8-10 أيام بعد الولادة ، والحفاظ على شرائح في الثقافة لمدة 3-7 أيام. وهذا يسمح لنا لدراسة الخلايا العصبية في سن مماثلة لتلك التي في عملنا مع شرائح الحادة ، ويقلل من تطور مثير للاتصالات مندفعا في شريحة. نسجل من العصبونات الهرمية بصريا المحددة في طبقات الثاني / الثالث أو الخامس الإضاءة باستخدام الأشعة تحت الحمراء (IR) وعلى النقيض التدخل التفاضلية المجهري (DIC) مع كل خلية في المشبك التصحيح الحالي أو المشبك الجهد. نستخدم biolistic (بندقية الجينات) من نوع ترنسفكأيشن البرية أو متحولة قناة البوتاسيوم الحمض النووي لمعالجة التعبير عن قنوات للدراسة وظائفها. يتم التعرف عليها بسهولة بواسطة الخلايا transfected المجهري epifluorescence بعد ترنسفكأيشن بالتعاون مع [كدنا] لبروتين الفلورية الخضراء (GFP). قارنا تسجيلات من الخلايا إلى الخلايا العصبية transfected ، untransfected المجاورة في نفس الطبقة من شريحة واحدة.

Protocol

1. الاستعدادات قبل يوم من التقطيع

نجد أنها أكثر فعالية لتعقيم الأدوات الجراحية وإعداد الحلول قبل يوم من تشريح.

  1. الأوتوكلاف الصكوك. (يتم إجراء الجراحة والتشريح تحت ظروف شبه معقمة). الأوتوكلاف الحزم التالية ، ملفوفة في ورقة منفردة الأوتوكلاف :
    • حزمة الجراحة : ملعقة ، # 22 مقبض النصل مشرط ، مقص ، ملقط
    • حزمة تشريح : 3 المقابض (مقبض النصل قابضة و 2 حمام تأمين المقابض) وشفرة الحارس (الذي يحمل شفرة حلاقة من تقطيع اللحم : Campden Vibroslice ، # MA572) مغلفة بشكل فردي (لأنه سيتم وضعها في الثلاجة) أدلى غرفة مخصصة المعدنية ( عينة الحمام) لتقطيع اللحم (شبكي بمصنع واحد لن تصمد التعقيم المتكررة) ، مرقئ ، مقص ، ملقط.
    • الأواني الزجاجية الحزمة : كل منهما 50 مل الأكواب واحد الدورق 25 مل
  2. قسامة مصل الحصان (Hyclone المانحة الخيلي SH # 30074 : Thermoscientic). قسامة ~ 11 مل من مصل الحصان في أنابيب مخروطية 15 مل. (مطلوب 10ML المصل ، لأن فقاعات ستشكل عند إذابة المصل ، تحتاج إلى 11 مل من خلالها نضح المطلوب 10 مل). aliquoted تخزين المصل في الثلاجة -20 درجة مئوية.
  3. قسامة وسائل الإعلام. بعد أن يتم فتح زجاجات وسائل الإعلام ، فهي الثابت الوحيد لأسابيع 4 ~ (نتيجة للتغيرات درجة الحموضة). شرائح البقاء على قيد الحياة أفضل مع وسائل الإعلام الجديدة.
    • نستخدم ثلاثة أنواع من وسائل الإعلام المتاحة تجاريا (التي تم شراؤها في زجاجات سعة 500 مل) ، بالإضافة إلى مصل الحصان. وسائل الإعلام هي : HMEM (Lonza وسائل الإعلام بالإضافة إلى الحد الأدنى Biowhittaker الأساسية HBSS وHEPES ، لا الجلوتامين : كتالوج # 12 - 137F) ، HBSS (GIBCO هانكس مخزنة المالحة ، # 24020-117) ، وMEM (GIBCO الوسيلة الأساسية الدنيا ، # 12360 -- 038). انظر الجدول رقم 2.
    • لكل واحد من ثلاثة أنواع من وسائل الإعلام (HMEM ، HBSS وMEM) ، قسامة ~ 50 مل من زجاجة سعة 500 مل من وسائل الإعلام في كل من أربعة أنابيب مخروطية 50 مل. Parafilm جميع الأنابيب بعد aliquoting. MEM مخزن في الثلاجة ، وتخزين وHMEM HBSS في درجة حرارة الغرفة.
    • وسائل الإعلام الثقافة تتكون من خليط من مصل الحصان ، HMEM وHBSS (انظر أدناه ، الجدول 2). وتستخدم وسائل الإعلام MEM يغسل.
  4. جعل القطع محلول (الجدول 3). ويتألف من قطع الحل (مم) : كلوريد الصوديوم 125 ، بوكل 3 ، 2 ص 4 ناه 1.25 NaHCO 3 26 ، 2 مم CaCl 2 ، 2 مم MgCl 2 ، و 20 ملي الجلوكوز. نجعل عادة 250 مل (تقديمهم إلى وحدة التخزين في الدورق الحجمي). الاختيار الأسمولية (ينبغي ~ 310) ودرجة الحموضة (7،2-7،3).

يتم تنفيذ الخطوات اللاحقة (# # 2 و 3) في يوم تشريح.

2. الجراحة ، والتقطيع ، والثقافة عضوي النمط

فمن المهم لإجراء الجراحة في مكان منفصل مقابل جميع الإجراءات الأخرى. نستخدم فراغ (الدخان) غطاء لعملية جراحية لإزالة المخ. ويستخدم غطاء تدفق الصفحي للإجراءات التي تجرى في شبه عقيمة الشروط ، مثل تشريح والتلاعب من شرائح والحلول.

  1. إعداد الحلول. (وهذه الإجراءات لا ينبغي أن تتم تحت ظروف معقمة ، حيث سيتم تصفية الحلول في خطوة لاحقة).
    1. تحضير محلول قطع (الجدول 3). فقاعة الحل مع خليط من 95 ٪ O 2 / 5 ٪ CO 2 لا يقل عن 20 دقيقة (الرقم الهيدروجيني لتحقيق الاستقرار والتأكد من جميع الأملاح في الحل). إضافة حمض البيروفيك 1 ملم (مثبط الأيض) and0.6 أسكوربات ملم (مضادات الأكسدة).
    2. أذاب 1 قسامة المصل الحصان (11 مل).
  2. إعداد تدفق الصفحي هود (ارتداء القفازات لجميع الإجراءات ، وتشبع القفازات مع EtOH). في هذا القسم ، ونحن نستعد لناحية العمل على توفير بيئة نظيفة ، ومساحة عمل شبه عقيمة. سوف نقوم أيضا تصفية الحلول لتعقيم لهم.
    1. استخدام الأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة 1 ~ لتعقيم مساحة العمل داخل غطاء تدفق الصفحي (ضوء الأشعة فوق البنفسجية سيضر قطع من البلاستيك لذلك نحن تغطية theCampden Vibroslice نستخدمها لتشريح ، أنظر أدناه). تنظيف جميع الأسطح مع EtOH 70 ٪ (ما عدا مقابض بلاستيكية تقطيع : EtOH سيضر). أيضا موجودة عادة تحت غطاء تدفق الصفحي هي pipetter وpipets ، زجاجة EtOH ، الغراء ، وأنابيب متصلة O 95 ٪ 05/02 ٪ CO 2 و 100 O 2.
    2. ضع التالية تحت غطاء تدفق الصفحي :
      • تعقيمها حزمة تشريح
      • 250 مل من محلول القطع
      • بالإضافة إلى التعبير عن ميليبور التصفية : 250 مل [0.2 ميكرون فلتر (# SC6PU02RE) لتصفية الحل قطع] :
      • مكونات الثقافة الإعلامية :
        • 20 مل HMEM
        • 10 مل HBSS
        • 10 مل مصل الحصان
      • الأواني الزجاجية الحزمة : الأكواب وتعقيمها
      • 50 مل من وسائل الإعلام يغسل MEM
      • Pipetter (دروموندالماصة للمساعدات)
      • نقل سبعة الماصات البلاستيكية (فيشر # 13-711-20). وتستخدم لنقل هذه الشرائح والحلول ، وكذلك لتكون بمثابة قناة للحلول الغاز (O 2 ، 95 ٪ O 2 / 5 ٪ CO 2) لمحتدما الحلول وسائل الاعلام.
      • Cyanoacrylate الغراء
      • شفرة حلاقة أو المقص (لقطع البلاستيك).
      • # 22 العقيمة شفرة مشرط
      • إدراج Millicell خلية ثقافة (0.4 ميكرون ، 30 ميكرون قطر ، # PICM 03050) 3 لإدراج كل لوحة 6 - جيدا
      • 6 كذلك لوحة الثقافة (ق) (كورنينج : Costar # 3516)
    3. تصفية أعدت قطع 250 مل محلول باستخدام 250 مل ميليبور التصفية (انظر أعلاه).
      قسامة 40 مل من محلول القطع في دورق سعة 50 مل. ضع قسامة مل 40 من القطع والحل 210 مل المتبقية الحل القطع في الثلاجة (-20 درجة مئوية). الهدف هو استخدام هذه الحلول على شكل مزيج ذائب في ~ 4 درجات مئوية لتلقي الدماغ بعد إزالة من الجمجمة (40 مل في الدورق) وقطع (210 مل).
    4. المكان غرفة المعادن تشريح (مغطاة رقة الأوتوكلاف) في الفريزر -20 درجة مئوية. ويساعد هذا الحل للحفاظ على القطع والبرد خلال تشريح الدماغ.
    5. تعد وسائل الإعلام ، ووضع الثقافة في الآبار (لا فقاعة الإعلام الثقافة -- سوف زبد).
      • تحضير 40 مل الإعلام الثقافة في 50 مل من البلاستيك أنبوب الطرد المركزي :
        • مزيج 20 مل + 10 HMEM HBSS مل + 10 مل من مصل قسامة الحصان (الجدول 2)
        • الإعلام الثقافة التصفية (لتعقيم) باستخدام 50 مل ميليبور steriflip 0.22 تصفية ميكرومتر (# SCGP00525).
      • مكان 1.1 مل الإعلام الثقافة في 3 آبار متباعدة قطريا لوحة 6 - جيدا (كورنينج : Costar # 3516 المجموعة 6 ثقافة أيضا). مكان جيد لوحة 6 / الثقافة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية حاضنة واحدة على الأقل ساعة.
    6. بمقص معقم أو شفرة حلاقة ، وتقصير 4 من pipets نقل (استخدم لنقل شرائح). تستخدم قطع أنبوب ينتهي دون مزيد من التعديل لتفريق الغازات عن حلول محتدما. هذه الأنابيب توصيل خطوط من الدبابات 95 ٪ O 2 / 5 ٪ CO 2 أو 100 ٪ O 2 إلى حلول.
    7. اغسل تصفية وسائل الإعلام (50 مل) باستخدام 50 مل ميليبور steriflip 0.22 ميكرومتر تصفية (# SCGP00525). اغسل مكان وسائل الإعلام في الثلاجة.
  3. التحضير لعملية جراحية. يجب أن تكون الحلول على استعداد لقبول المخ بعد جراحة (هود فراغ) والسماح للتشريح والتحضير السريع للثقافة (هود تدفق الصفحي). نحن إجراء الجراحة تحت غطاء الفراغ. من المهم أن يتم اجراء عملية جراحية في منطقة منفصلة للحفاظ على الشعر وسوائل الجسم بعيدا عن غطاء تدفق الصفحي شبه عقيمة.
    1. إعداد وسائل الاعلام والحلول.
      • إزالة الدورق 50 مل مع 40 مل من محلول القطع من الثلاجة ووضعها تحت غطاء الفراغ لتلقي الدماغ بعد إزالة من الجمجمة. ~ صب 10 مل من محلول هذه القطع الباردة في دورق سعة 25 مل. وسوف تستخدم لنقل هذا الدماغ على غطاء تدفق الصفحي.
      • إزالة 210 مل من محلول القطع ووضعها في الثلاجة غطاء تدفق الصفحي (للتشريح وجمع شريحة).
      • إزالة المعادن غرفة تشريح من الثلاجة ووضعها تحت غطاء تدفق الصفحي.
      • فقاعة كلا القطع مع حلول 95 ٪ O 2 / 5 ٪ CO 2 (استخدام ماصات نقل قطع من البلاستيك لتوصيل الأنابيب للحل).
    2. وضع البنود التالية تحت غطاء محرك السيارة الفراغ (30 مل حل القطع موجود بالفعل ومحتدما مع 95 ٪ O 2 / 5 ٪ CO 2) :
      • تعقيمها 25 مل دورق
      • الأدوات الجراحية المعقمة ، والقفازات ، وملقط
    3. إزالة اغسل وسائل الإعلام من الثلاجة وفقاعة مع 100 ٪ O 2 (استخدام قطع من البلاستيك نهاية ماصة نقل لتوصيل الأنابيب للحل).
  4. الجراحة (تتم تحت غطاء تدفق الفراغ). هذه الخطوة مطلوبة لإزالة تشريح الدماغ لاحقة. فمن المهم لتقليل الوقت بين التضحية الحيوانية ووضع الحلول الاوكسيجين في الدماغ الباردة ، والقطع. من المهم أيضا للحد من الصدمة إلى الدماغ. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية الحيوان واستعمال وجامعة تينيسي في مركز العلوم الصحية.
    1. نستخدم سبراغ داولي الفئران ، من P6 - P17 (نفضل P8 - P10). الفئران في مكان مغطى 2-4 L حاوية بلاستيكية. للتخدير ، يتم تطبيق ~ 1 مل isofluorane إلى قطعة من الشاش تقع تحت شبكة من البلاستيك (بحيث لا مخدر الاتصال الحيوان). تخدير الفئران مع isoflurane حتى الحيوان areflexive. تشبع القفازات مع EtOH.
    2. بعد تخدير الفئران ، قطع رأس الحيوان مع مشرط كبير ، وإزالة المخ. وضعت في الدماغدورق يحتوي على 30 مل من البرد (~ 4 درجات مئوية) لقطع الحل ~ 30 ثانية. نقل بعناية الدماغ على الدورق 25 مل للحد من نقل الشعر أو غطاء تدفق الدم إلى الصفحي.
    3. قفازات التغيير (تشبع مع EtOH).
    4. الحل في الدماغ نقل قطع الباردة (25 مل دورق) لغطاء تدفق الصفحي.
  5. شريحة الدماغ والاستعداد للثقافة. في هذه الخطوة ، فإننا توجيه المخ ، وإزالة أنسجة المخ لزوم لها ، وقطع وجمع شرائح الدماغ. ثم نغسل الشرائح ، ومكان كل شريحة على إدراج عيون ، وضع شبكة يدرج في لوحات ثقافة 6 - جيدا ، ونقل على لوحات (مع شرائح) إلى حاضنة للثقافة.
    1. توجيه وكتلة الدماغ (المخيخ وإزالة القطب الجبهي ، وجعل جزئي منتصف sagital ~ قطع نصف الطريق من نهاية القشرة الأمامية وهذا ما يسمح القطع المتزامن لشريحتين -- واحدة من كل نصف الكرة الغربي -- ولكن ما زال يحتفظ كلا hemsipheres معا في نهاية عجزي عن قاعدة مستقرة للالغراء لمرحلة). منعت الغراء الدماغ على خشبة المسرح مع cyanoacrylate. الدماغ مكان مع القشرة الأمامية صعودا وقطع شرائح من اللحاء الجبهي الاكليلية. إجراء تخفيضات إضافية مشرط حسب الحاجة للحد من حجم الشريحة.
    2. وضع المسرح مع الدماغ في غرفة معقمة تقطيع المعادن (والذي هو تعلق على تقطيع اللحم والأنسجة تهتز) وملء حوض الاستحمام بالماء البارد الثلج ، وقطع محتدما الحل. صب ~ 30 مل من محلول القطع المتبقية في الدورق 50 مل (في جمع شرائح) وفقاعة مع 95 ٪ O 2 / 5 ٪ CO 2.
    3. قطع شرائح 250-300 ميكرومتر مع تقطيع اللحم والأنسجة تهتز (Campden Vibroslice # MA572 : الآلات الدقيقة العالمي ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة). شرائح مكان في الدورق الذي يحتوي على 30 مل من محلول القطع. جمع أكبر عدد من شرائح ترغب في ثقافة (عادة 3-6) ، بالاضافة الى عدد قليل اضافي.
    4. تغسل شرائح : ضع 2 مل ~ اغسل وسائل الإعلام في طبق بتري البلاستيكية 35 مم. نقل جميع شرائح من الحل لقطع طبق بيتري من البلاستيك مع وسائل الإعلام اغسل. تغسل شرائح 3 مرات ، وذلك باستخدام وسائل الإعلام اغسل جديدة في كل مرة. استخدام ماصات نقل منفصلة لنقل الشرائح وإضافة وسائل الإعلام ، ونضح حلول النفايات.
    5. نقل إلى شرائح الإعلام الثقافة (في مختلف طبق بيتري 35 ملم من البلاستيك ؛ جديدة ماصة نقل). إزالة قمم من التعبئة من أجل إدراج عيون ، ولكن ترك يدرج في التعبئة والتغليف.
    6. شرائح من وسائل الإعلام نقل الثقافة إلى إدراج شبكة (مع cuttransfer ماصة) : شرائح المركز في منتصف إدراج (الشكل 1A). وهناك القليل صغيرة من الإعلام الثقافة تأتي جنبا إلى جنب مع شريحة. باستخدام ماصة نقل سليمة ، وإزالة الإعلام الثقافة الزائد فورا بعد وضع شريحة أسفل على إدراجه. محاولة لوضع شريحة في وسط إدراج (وهذا يسهل ترنسفكأيشن biolistic ويجعل من الأسهل لإزالة شريحة لتسجيل لاحقا).
    7. مكان ادخال شبكة / شريحة في وسائل الإعلام الثقافة في لوحة 6 - جيدا (1B الشكل). توخي الحذر لمنع تشكيل فقاعات الهواء تحت إدراج mesh.When 3 / شرائح موجودة في لوحة 6 - جيدا ، ومكان 6 - جيدا مرة أخرى في حاضنة لوحة. احتضان شرائح الحاضنة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة 1 ~.
  6. شرائح Transfect باستخدام بندقية الجينات (بيو راد هيليوس). يمكن القيام بذلك على الفور بعد تشريح ووضع على شبكة في لوحة 6 - جيدا ، ولكن نحن احتضان عادة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية لتحقيق الاستقرار في شرائح ثم transfect الخلايا. بروتوكولات مفصلة لصنع [كدنا] "الرصاص" ، وباستخدام بندقية الجينات ، راجع الحكام. 17-22.
    1. تحميل البلاستيكية "cartidges" تحتوي على "الرصاص". (ونشير هنا إلى جزيئات الذهب [كدنا] المغلفة والرصاص ، وهكذا ، ترد في العديد من الرصاصات "خرطوشة" من البلاستيك). مغادرة أول موقف مجاني (لا توجد "خرطوشة"). تحميل كل موقف آخر مع خرطوشة تحتوي على [كدنا] المغلفة بالرصاص. مكان حامل خرطوشة بندقية في الجينات.
    2. واضحة باطلاق مدفع برميل مع عدم وجود خرطوشة.
    3. تقدم برميل واحد مع خرطوشة. إزالة 6 - جيدا لوحة من الحاضنة ومكان تحت غطاء تدفق الصفحي. عقد بندقية فقط فوق أعلى لوحة 6 - جيدا. عقد العمودي. اطلاق النار على 100 رطل ~.
    4. برميل مسبقا ، واضحة ، وتكرار. طلقة واحدة لكل شريحة.
    5. بعد اطلاق النار ، وعودة 6 لوحات جيدة مع شرائح / لإدراج الحاضنة.
  7. شرائح الثقافة (وكيل شبه عقيمة الشروط). يجب أن يتم تنفيذ جميع التلاعبات من شرائح وصفائح 6 - جيدا مع ارتداء القفازات المشبعة EtOH وتحت غطاء تدفق الصفحي ، وبعد تنظيف المنطقة مع EtOH. نحن ثقافة شرائح لفترات زمنية مختلفة (عادة 2-7 أيام) للسماح للانتعاش من إجراء تشريح والحادة لإتاحة الوقت لترنسفكأيشن أن تؤدي إلى البروتين الجديد.
    1. الثقافة ل2-7 أيام (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2) في حاضنة (فورما النموذج العلمي # 3110).
    2. استبدال وسائل الاعلام كل يوم آخر : إضافة وسائل الإعلام الجديدة إلى ثلاثة آبار غير مأهولة ، استبدل في الحاضنة لمدة لا تقل عن 1 ساعة. نقل شريحة / غشاء لبئر جديدة مع EtOH - تنظيفها ملقط منحنية. نضحالقديم وسائل الإعلام. عودة إلى حاضنة لوحة.

3. سجل من الخلايا الهرمية في شرائح

وهو خارج نطاق هذا البروتوكول لتوفير تعليمات مفصلة عن كل تقنيات التسجيل الخلية. نحن تقديم معلومات عن كيفية نقل شرائح إلى غرفة تسجيل وتقديم تفاصيل عن تسجيل لدينا مجموعة المتابعة ، وخصوصا تنتمي إلى تحديد الخلايا transfected للتسجيل.

  1. انسحبنا من أقطاب الزجاج GC150TF - 10 هارفارد باستخدام P - 87 سوتر مجتذب الأفقي. و2-6 أقطاب MΩ في حل خارج الخلية. تمتلئ مع أقطاب الداخلية KMeSO 4 (انظر الجدول 3).
  2. ارتداء القفازات. إزالة 6 - جيدا لوحة من الحاضنة. تحت غطاء تدفق الصفحي ، وإزالة بعناية شريحة واحدة / مع ادخال شبكة EtOH - تنظيفها الملقط ، منحنية. استبدال لوحة 6 - جيدا في حاضنة ونقل الشريحة ليتم تسجيلها في المنطقة من التسجيل. في حالتنا هذه في مختبر مختلفة. نحمل إدراج / شريحة في تغطية صحن بيتري 35 ملم من البلاستيك. بعد هذه الخطوة ، والقفازات لا تحتاج أن ترتديه (لا توجد امكانية تلويث الثقافات أو الحاضنة).
  3. قطع غشاء مع مشرط # 11. خفض حدة التوتر التي قدمتها ضد ملقط أو مرنة قضيب معدني. (قد يكون من الضروري الانتهاء من التخفيضات النهائية مع مقص). استخدام الملقط ، نقل شريحة مع شبكة تعلق على غرفة تسجيل على مرحلة مجهر أوليمبوس WI BX50 تستقيم.
  4. علينا استخدام مكبر للصوت آلات أكسون Multiclamp 700B والبروتوكولات في الحصول على البيانات PClamp 10. يتم التحكم الكهربائي مع المتلاعبين موقف العائد على حقوق المساهمين وسوتر - 200 PC - 200 وحدة تحكم. نستخدم BX - 50WI أوليمبوس المجهر تستقيم مع IR - DIC البصريات لتصور العصبونات الهرمية في طبقات الثاني / الثالث أو الخامس ونحن نستخدم واحد IR - حساسة الكاميرا (أوليمبوس OLY - 150 أو DAGE MTI) ورصد ProVideo 1201B لتصور الخلايا في شريحة. واستحم في شرائح carbogenated الاصطناعي السائل النخاعي (aCSF : الجدول 3) ألقيت في 2-3 مل / دقيقة عند 33 ± 1 درجة مئوية.
    عادة ، نجد 10-50 الخلايا transfected في شريحة. تقع الخلايا lookingthrough العدسة باستخدام المجهر وepifluorescence مع فلتر FITC (محمولة على عجلة تصفية في جبل البرج تقع فوق وتحت أهداف العدسة من المجهر). وهذا يسمح لنا بسهولة التبديل بين مدينة دبي للإنترنت ، الأشعة تحت الحمراء وepifluorescence لتحديد نوع من الخلايا ، وهذا هو transfected الخلية (خلية يظهر الأخضر تحت epifluorescence ويحتوي على الرصاص) ، وهذا أمر صحي الخلية (الخلية هو 3 الأبعاد وسطح أملس ، نواة منتفخة لا ، لا تورم الخلية أو منكمشة).
    نستهدف العصبونات الهرمية في طبقات الثاني / الثالث أو الخامس (انظر الشكل 1). ويتم تحديد الخلايا الهرمية التي كتبها وجود تغصن قمي تصاعدي نحو طبقة الأول ، العمود الفقري شجيري عديدة ، وسوما على شكل كمثرى. يتم تحديد كثافة طبقة من الخلايا والموقع النسبي لالحنون. والخلايا transfected عموما على سطح شريحة لا تكون سليمة. على الرغم من أنه من الصعب تصور خلايا عميقة داخل عضوي النمط شريحة من شرائح مع الحادة ، ويمكننا تصور عادة صحية ، والخلايا transfected 2-50 ميكرون تحت سطح الشريحة. فإننا نستخدم أساليب تسجيل خلية كاملة. نحن نقترب من خلية تحت التوجيه البصري ومع الضغط الايجابي في المشبك الجهد. يتم الحصول على الأختام مع الشفط لطيف (باستخدام حقنة 1 مل) تحت المشبك الجهد. عند بلوغ ختم GΩ ، يتم تطبيق شفط إضافية لكسر في الخلية. ثم نقوم التسجيلات في أي المشبك الجهد الحالي أو.
    في نهاية التسجيل ، نتحقق من أن الخلية سجلت الأخضر ، ويحتوي على رصاصة ، وتستجيب للضغط واضح سلبية أو إيجابية. للسيطرة على التباين بين شرائح وطبقات الخلية ، والعمر في وقت الجراحة ، والوقت في الثقافة ، ونحن لدينا تسجيلات الزوج دائما من الخلايا transfected مع تسجيلات من خلايا مكافحة untransfected من الطبقة نفسها ، ويقع ب 50 ميكرون من الخلية transfected.

4. ممثل النتائج :

1A الرقم يدل على شريحة مستعدة تماما يجلس على غشاء لإدراجها في لوحة 6 - جيدا للزراعة. هذا يشمل شريحة القشرة الحركية والحسية الجسدية من الفئران P10 الجرو. والحنون هو الحق من هذا الرقم ، مع المادة البيضاء والمخطط إلى اليسار. 1B الرقم يدل على شريحة / الغشاء في البئر ، منغمسين في 1.1 مل الإعلام الثقافة ~. هدفنا للثقافة عضوي النمط هو الإبقاء على نمط الصفحي الطبيعي للقشرة ، ومنع تجفيف السطح خلال الثقافة ، وتنتج في نهاية المطاف إلى نسبة عالية من الخلايا الحية في الشريحة بعد عدة أيام في الثقافة التي يمكن تسجيلها من (خلايا منكمشة أو لا ، الحد الأدنى من تورم نواة الخلية متورمة ، ومظهر لامع والأبعاد الثلاثة للخلايا في مدينة دبي للإنترنت IR - البصريات). ويبين الشكل 1C صور الأشعة تحت الحمراء ومدينة دبي للإنترنت epifluorescence من طبقة الخلايا العصبية الهرمية الثالث في شريحة من القشرة الحسية الجسدية عضوي النمط بعد 3 أيام فيثقافة (P10 من الحيوان). 1D الرقم هو صورة epifluorescence شريحة مختلفة ، تظهر العديد من خلايا طبقة transfected الخامس مع [كدنا] لGFP (الخلايا الخضراء).

الشكل 2 يبين آثار الحالية ممثلة في وتسجيلات الجهد المشبك من خلية الخامس بعد طبقة هرمية ثقافة شريحة عضوي النمط لمدة 3 أيام (P10 الحيوانية). 2A الرقم يدل على إمكانات العمل تجاوزت الولايات المتحدة (CNN). ويبين الشكل 2B اطلاق المتكررة ردا على 2 ثانية و 400 حقن السلطة الفلسطينية الحالية مستمرة. هذه الآثار تدل الخصائص الكهربية العادية للطبقة العادية التشويك الخامس الخلايا العصبية (انظر أيضا الجدول 1). 1C الرقم هو تسجيل الجهد المشبك من طبقة الخلايا العصبية الهرمية الخامس في وجود سم الأسماك الرباعية الأسنان ميكرومتر 1 (TTX) لعرقلة الجهد بوابات نا + التيارات. آثار من عائلة التيارات استجابة إلى 500 مللي الخطوات الجهد من المحتمل عقد -70 بالسيارات إلى إمكانات مختلفة بين -90 و +70 بالسيارات بالسيارات (في 10 بالسيارات بين الخطوات).

الشكل 1
الشكل 1. عضوي النمط ثقافة شريحة ألف. شريحة من الفئران من القشرة الحسية الفئران P10 على إدراج Millicell شبكة التصفية. الحنون هو الأمر الصحيح ، بيضاء عميقة والمخطط إلى اليسار. خط الوسط هو في الحافة العلوية. باء ثلاثة شريحة وشبكات إدراج الغارقة في 1 ~ مل الإعلام الثقافة ووضعها في الآبار غير متجاورة من 6 جيدا لوحة (نفس الحيوان كما في ألف). جيم IR - DIC (العلوي) وepifluoresent (أقل) صور من طبقة الخلايا الهرمية الثالث القشرة المخية الحديثة في الثقافة عضوي النمط (P10 الحيوانات ، و 3 أيام في الثقافة). علما "رصاصة" مرئية في صورة مدينة دبي للإنترنت (الكرة السوداء). دال صورة نيون العديد من طبقة الخلايا العصبية الخامس بعد ترنسفكأيشن biolistic [كدنا] مع لGFP.

الشكل 2
الشكل 2. تسجيلات من خلايا القشرة المخية الحديثة في الثقافة الهرمية شريحة عضوي النمط ألف. إمكانات العمل في طبقة الخلايا الهرمية الثالث (P10 من الحيوانات ، وبعد 3 أيام في الثقافة) استجابة لحقن suprathreshold مللي 10 الحالي. باء اطلاق النار المتكرر من مختلف طبقة الخلايا العصبية الهرمية الخامس (P10 الفئران ، 3 أيام في الثقافة) ردا على 2 ثانية ، وحقن 400 السلطة الفلسطينية الحالية. كانت هذه الخلية العصبية العادية التشويك. جيم الجهد - المشبك سجل من مختلف الخلايا العصبية طبقة هرمية الخامس (P10 الفئران ، 3 أيام في الثقافة). كان 1 TTX ميكرومتر الحالية لعرقلة الجهد بوابات نا + الحالي. في الخارج ، K + التيارات استجابة لعائلة مكونة من 500 مللي الخطوات الجهد من المحتمل عقد -70 بالسيارات (البروتوكول في اليمين). تم تصحيح الفولتية ل+10 بالسيارات المحتملة تقاطع السائلة. وكان وصول المقاومة ~ 9 MΩ. كان يعمل أي تعويض عن المقاومة سلسلة السعة أو الغشاء.

الجدول 1. الخواص الكهربائية مماثلة من السيطرة مقابل GFP - transfected خلايا هرمية (شرائح من الفئران P10 ؛ شريحة عضوي النمط : 3-4 أيام في المختبر). يعني + الخطأ المعياري للمتوسط ​​(عدد الخلايا). RMP = غشاء المحتملة يستريح ، RN = المقاومة المدخلات ، أ ب = العمل المحتملين ؛ الجهد = Vth عتبة AP ؛ الأب العرض AP = بنصف السعة.

علاج الشرطة العسكرية الملكية (السيارات) آر (MΩ) AP السعة Vth (السيارات) الأب (مللي ثانية)
مراقبة -72 ± 1 (21) 119 ± 17 (11) 84 ± 2 (24) -45 ± 1 (21) 1.7 ± 0.1 (19)
GFP فقط -77 ± 1 (9) 123 ± 7 (5) 87 ± 2 (24) -45 ± 2 (9) 2.1 ± 0.2 (7)

الجدول 2. وسائل الإعلام التجارية ، وهذه وسائل الاعلام يتم شراؤها واستخدامها معدلة (مؤلفاتهم تتوفر على الخط من الشركة المصنعة).

1 اغسل وسائل الإعلام : MEM (GIBCO # 12360)
وسائل الإعلام الثقافة : 20 مل HMEM 1 (Lonza Biowhittaker) + 10 مل HBSS1 (Gibco ، 24020-117) + 10 مل serum1 الحصان (SH # Hyclone 30074.03)

الجدول 3. حلول (تركيزات في مم).

قطع الحل : 125 كلوريد الصوديوم ، 3 بوكل ، 2 CaCl 2 ، 2 2 MgCl ، 1.25 ناه 2 ص 4 و 26 NaHCO 3 و 20 الجلوكوز (7.4 درجة الحموضة ، 310 MOsm / L).
الاصطناعي الدماغي aCSF الموائع (تسجيل خارجي) : 125 كلوريد الصوديوم ، 3 بوكل ، 2 CaCl 2 ، 2 2 MgCl ، 1.25 ناه 2 ص 4 و 26 NaHCO 3 و 20 الجلوكوز (7.4 درجة الحموضة ، 310 MOsm / L).
تسجيل الداخلية (الجاري المشبك) : 130.5 KMeSO4 ، 10 بوكل ، 7.5 كلوريد الصوديوم ، 2 MgCl 2 ، 10 HEPES ، 2 ATP ، GTP 0.2 ، 0.1 EGTA (الرقم الهيدروجيني 7.2 ، 285-295 mOsm / L).
تسجيل الداخلية (الجهد المشبك) : 55 KMeSO 4 ، 55 KOH ، 2 MgCl 2 و 20 HEPES ، 6 فوسفات الكرياتين ، 4 ATP ، 0.5 GTP ، 10 BAPTA ، 0.1 leupeptin (الرقم الهيدروجيني 7.2 ، 285-295 mOsm / L).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد تم دراسة الأدوار الوظيفية للتعبير والجهد بوابات قنوات البوتاسيوم في الخلايا العصبية المخية الحديثة هرمي من الفئران (4 ، 9-11). بسبب عدم وجود وكلاء الدوائية محددة لهذه القنوات ، ونحن نستخدم منهج التعبير الجيني لمعالجة القناة (1،14،15،17-19). نحن نستخدم استعدادا الثقافة عضوي النمط (2،3 ؛ 5-8 ؛ 12،13،15-22). معدلة من نهج Stoppini وآخرون (16) ، من أجل الحفاظ على التشكل الخلية ونمط الصفحي من القشرة. نحن عزل شرائح القشرة المخية الحديثة الحادة في الأيام التالية للولادة 17/06 ، والحفاظ على الثقافة في لشرائح 2-7 أيام. وهذا يسمح لنا لدراسة الخلايا العصبية سن مماثلة لتلك التي في عملنا مع شرائح الحادة ، ويقلل من تطور مثير للاتصالات مندفعا في شريحة. نسجل من العصبونات الهرمية عيانا في طبقات الثاني / الثالث أو الخامس الإضاءة باستخدام الأشعة تحت الحمراء (IR) وعلى النقيض التدخل التفاضلية المجهري (DIC) مع كل خلية في المشبك التصحيح الحالي أو المشبك الجهد. يستخدم Biolistic (الجينات البندقية) ترنسفكأيشن من نوع البرية أو متحولة قناة البوتاسيوم الحمض النووي لمعالجة التعبير عن قنوات للدراسة وظيفتها (1،14،15،17). بواسطة ترنسفكأيشن بالتعاون مع لGFP [كدنا] ، يتم التعرف عليها بسهولة في الخلايا تحت المجهر transfected epifluorescence. قارنا تسجيلات من الخلايا إلى الخلايا العصبية transfected ، untransfected المجاورة في نفس الطبقة من الشريحة نفسها (1،17).

أيا من الإجراءات المشمولة هنا هي صعبة ، ولكن الاهتمام إلى بعض التفاصيل يمكن أن تحسن كثيرا من النتائج. في أيدينا ، هو بقاء الخلية على أفضل وجه عندما مصنوعة من شرائح الثقافات من الحيوانات P8 - P10 ~. فمن المهم للحفاظ على ظروف شبه معقمة خلال تشريح وزراعة شرائح. لمنع التلوث الجرثومي ، ونحن الأوتوكلاف الصكوك وتنظيف المنطقة الجراحية للأشعة فوق البنفسجية وEtOH حلول التصفية ، والقفازات ملابس وقفازات تغيير بين الدماغ وإزالة شرائح القرارات. الآثار المترتبة على التلوث الجرثومي تشمل الفقراء الجدوى الأنسجة وضرورة تطهير حاضنات. كما هو الحال مع جميع شرائح الدماغ ، وتحسين السلامة عن طريق تقليل الوقت بين التضحية وتشريح الحيوان. ينبغي أن توضع في المخ وينبغي أن يتم تشريح الدماغ مع المغمورة في الطين الجليد الباردة من الحل القطع. شريحة بسرعة بطيئة ، مع انخفاض الاهتزاز الأفقي السعة النصل.

مشكلة محتملة أخرى هو تجفيف شرائح أثناء وجوده في الحاضنة. يمكن التقليل من التجفيف من خلال إعداد الشرائح التي هي صغيرة : يقتصر على القشرة من الاهتمام وقطعة صغيرة من المخطط (لأغراض التوجه). شرائح كبيرة تميل إلى أن تجف في حاضنة وانها أكثر صعوبة للحصول على ظروف التسجيل مستقرة مع شرائح كبيرة. تقطع شرائح عند 250-300 ميكرون سميكة. نجد أن أرق الشرائح (نفضل 250 ميكرون) في أقل نتيجة التجفيف. عند نقل شرائح من حل لتقطيع الحاضنة ، نغسل شرائح عدة مرات ، الأولى في وسائل الإعلام ثم اغسلي والثقافة في وسائل الإعلام. ومن المهم لإزالة السوائل الزائدة بعد نقلها إلى غشاء (للسماح لشريحة نعلق على شبكة). لشرائح سميكة (على سبيل المثال ، 300 ميكرون) ، قطرة واحدة من الثقافة وسائل الإعلام الخطى على أعلى شريحة (بينما هو جالس على الغشاء) يساعد على منع جفاف. هذا الإجراء يبدو أن رئيس الحركة من وسائل الإعلام رطبة إلى السطح العلوي للشريحة. استبدال وسائل الإعلام الأخرى الثقافة كل يوم كما يمنع جفاف ويعزز قدرتها على البقاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر ومايومي Sakuraba Foehring ريبيكا لتقديم المساعدة التقنية العالقة. بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نشكر الدكاترة. رودريغو اندرادي للمساعدة في تنفيذ عضوي النمط ثقافة شريحة والبروتوكولات ترنسفكأيشن biolistic والدكتور جين Nerbonne لتزويدنا يبني لترنسفكأيشن [كدنا]. وأيد هذا العمل عن طريق منح المعاهد الوطنية للصحة : من NS044163 NINDS (لإطار التعاون الإقليمي).

Materials

Surgery / transfection / culture:

  1. Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
  2. Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
    • Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
    • Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
    • disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
      • 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
      • Tefzel Tubing: #165-2441
  3. Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766).

Media:

  1. Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
  2. HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  3. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  4. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  5. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
  6. Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
  7. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)

Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.

Recording:

  1. Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
  2. Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
  3. Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  4. PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  5. lectrode position is controlled with Sutter R–-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
  6. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
  7. IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North R–ske Avenue, Michigan City, IN 46360).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).
  2. Buonomano, D. V. Timing of neural responses in cortical organotypic slices. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).
  3. Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex. Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).
  4. Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons. Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).
  5. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
  6. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).
  7. Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
  8. Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue. Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).
  9. Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones. J Physiol. 571, 371-389 (2006).
  10. Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).
  11. Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons. J Physiol. 581, 941-960 (2007).
  12. Johnson, H. A., Buonomano, D. V. A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes. Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).
  13. Johnson, H. A., Buonomano, D. V. Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices. J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).
  14. Malin, S. A., Nerbonne, J. M. Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons. J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).
  15. O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
  16. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  17. Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons. J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).
  18. Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons. J Neurochem. 75, 882-885 (2000).
  19. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
  20. O'Brien, J. A., Lummis, S. C. Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun. Nat Proc. 1, 977-981 (2006).
  21. Joshi, P., Dunaevsky, A. Gene gun transfection of hippocampal neurons. J Vis Exp. , (2006).
  22. Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 52 ، عضوي النمط ، اللحاء الجديد ، الحسية الجسدية ، الخلية الهرمية ، وإعداد شريحة ، ترنسفكأيشن biolistic
تسجيل خلية كاملة من إعداد عضوي النمط شريحة من القشرة المخية الحديثة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Foehring, R. C., Guan, D., Toleman,… More

Foehring, R. C., Guan, D., Toleman, T., Cantrell, A. R. Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex. J. Vis. Exp. (52), e2600, doi:10.3791/2600 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter