Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

Summary

Questo è un protocollo di preparare e mantenere una preparazione neocorticale fetta di cultura organotipica allo scopo di effettuare registrazioni elettrica da neuroni piramidali.

Abstract

Abbiamo studiato i ruoli espressione e funzionale di canali del potassio voltaggio-dipendenti in neuroni piramidali dalla neocorteccia del ratto. A causa della mancanza di specifici agenti farmacologici per questi canali, abbiamo adottato un approccio genetico per manipolare l'espressione dei canali. Noi usiamo una preparazione organotipica cultura (16) al fine di mantenere la morfologia cellulare e il modello laminare della corteccia. Noi di solito isolare acuta fette neocorticale a 8-10 giorni dopo la nascita e mantenere le fette in coltura per 3-7 giorni. Questo ci permette di studiare i neuroni ad un'età simile a quella nel nostro lavoro con le fette acuta e riduce al minimo lo sviluppo delle connessioni eccitatorie esuberante nella fetta. Noi registriamo da visivamente identificati neuroni piramidali negli strati II / III o V con illuminazione ad infrarossi (IR) e l'interferenza differenziale microscopia a contrasto (DIC) con il morsetto intera patch di cellule in corrente o tensione-clamp. Noi usiamo biolistic (pistola Gene) trasfezione di tipo selvaggio o del DNA mutante canale del potassio per manipolare l'espressione dei canali per studiare la loro funzione. Le cellule trasfettate sono facilmente identificabili mediante microscopia in epifluorescenza dopo la co-trasfezione con cDNA per la proteina fluorescente verde (GFP). Confrontiamo le registrazioni delle cellule transfettate adiacenti, i neuroni untransfected nello stesso strato dalla stessa porzione.

Protocol

1. I preparativi prima del giorno del Slicing

Troviamo è più efficiente di autoclavare gli strumenti chirurgici e preparare soluzioni prima del giorno di affettamento.

1. Autoclave strumenti. (L'intervento e affettamento avvengono sotto condizioni di semi-sterile). Autoclave i seguenti pacchetti, confezionati singolarmente in carta autoclave:
   • Chirurgia pacchetto: spatola, # 22 manico bisturi, forbici, pinze
   • Pacchetto slicing: 3 manopole (lama tenuta di manopola e 2 bagni di fissaggio manopole) e Protezione del disco (contiene lametta da affettatrice: Campden Vibroslice, # MA572), confezione singola (perché sarà messo in freezer) su misura camera in metallo ( campione vasca da bagno) per affettatrice (plexiglass del produttore non in grado di resistere in autoclave ripetute), emostatico, forbici, pinze.
   • Cristalleria pacchetto: due da 50 bicchieri da 25 ml e coppa mL
2. Aliquota siero di cavallo (Hyclone donatore equina # 30074 SH: Thermoscientic). Aliquota ~ 11 ml di siero di cavallo in provette da 15 ml conica. (10 ml di siero è necessario. Dato che le bolle si formano quando siero è scongelato, hai bisogno di 11 mL da cui partire per aspirare il richiesto 10 ml). Conservare aliquotato siero in un congelatore di -20 ° C.
3. Aliquota media. Dopo le bottiglie media sono aperte, sono solo stabili per ~ 4 settimane (a causa di variazioni di pH). Le fette sopravvivere meglio con mezzi freschi.
   • Usiamo tre tipi di supporti in commercio (acquistato in bottiglie da 500 ml), più siero di cavallo. I media sono: HMEM (Lonza Biowhittaker terreno minimo essenziale, più HBSS e HEPES, non glutammina: Catalogo # 12-137F), HBSS (GIBCO Hanks soluzione salina tamponata, # 24020-117), e MEM (GIBCO terreno minimo indispensabile, # 12360 - 038). Vedere la Tabella 2.
   • Per ciascuno dei tre tipi di media (HMEM, HBSS, e MEM), aliquota ~ 50 ml da una bottiglia da 500 ml di media in ciascuno dei quattro da 50 mL conica. Parafilm tutte le provette dopo aliquoting. Conservare MEM in frigorifero, e memorizzare HMEM e HBSS a temperatura ambiente.
   • La cultura dei media è costituita da una miscela di siero di cavallo, HMEM e HBSS (vedi sotto, tabella 2). MEM viene usato come mezzo di lavaggio.
4. Fai taglio Soluzione (Tabella 3). La soluzione di taglio è composto da (in mM): NaCl 125, KCl 3, NaH ₂ PO ₄ 1,25, NaHCO ₃ 26, 2 mM CaCl _{2, 2} mM MgCl _2, e 20 mM glucosio. Noi di solito fanno 250 mL (portare a volume in matraccio). Controllare osmolalità (dovrebbe essere ~ 310) e pH (7,2-7,3).

I passi successivi (# 2 e # 3) vengono eseguite il giorno del taglio.

2. Chirurgia, tranciatura, e Cultura organotipica

E 'importante eseguire l'intervento in un luogo separato rispetto a tutte le altre procedure. Usiamo un (aspirante) cofano vuoto per l'intervento chirurgico per la rimozione del cervello. Una cappa a flusso laminare è utilizzato per le procedure eseguite in condizioni di semi-sterile, quali l'affettamento e manipolazioni di fette e soluzioni.

1. Preparare soluzioni. (Tali procedure non devono essere eseguite in condizioni sterili, come le soluzioni verranno filtrati in un passaggio successivo.).
   1. Preparare la soluzione di taglio (tabella 3). Bolla la soluzione con una miscela di 95% O ₂ / 5% di CO ₂ per almeno 20 minuti (per stabilizzare il pH e assicurarsi che tutti i sali in soluzione). Aggiungere 1 mM acido piruvico (inibitore metabolico) and0.6 ascorbato mM (antiossidante).
   2. Scongelare 1 aliquota di siero di cavallo (11 ml).
2. Preparare cappa a flusso laminare (indossare guanti per tutte le procedure, saturare guanti con EtOH). In questa sezione, prepariamo l'area di lavoro di fornire un ambiente pulito, semi-sterile spazio di lavoro. Ci sarà anche filtrare le soluzioni per sterilizzarle.
   1. Utilizzano la luce UV per circa 1 ora per sterilizzare lo spazio di lavoro all'interno della cappa a flusso laminare (luce UV danneggia le parti in plastica in modo da coprire theCampden Vibroslice usiamo per affettare, vedi sotto). Pulire tutte le superfici con il 70% EtOH (eccetto manopole di plastica di affettatrice: EtOH si danno). Anche tipicamente presenti sotto la cappa a flusso laminare sono i pipetter e pipette, bottiglie EtOH, colla, e tubi collegati% O 95 ₂ / 5% di CO ₂ e 100 O _2.
   2. Posizionare il seguente sotto il cofano a flusso laminare:
      • Autoclave pacchetto affettare
      • 250 ml soluzione di taglio
      • Millipore Express Plus filtro: 250 ml [0.2 micron filtro (# SC6PU02RE) per filtrare soluzione di taglio]:
      • La cultura media dei componenti:
        • 20 ml HMEM
        • 10 mL HBSS
        • 10 ml di siero di cavallo
      • Vetreria pacchetto: I contenitori sterilizzati in autoclave
      • 50 ml di MEM lavare i media
      • Pipetter (Drummondpipetta-aiuto)
      • Sette pipette di trasferimento di plastica (Fisher # 13-711-20). Questi sono usati per trasferire le fette e soluzioni, oltre che a servire come canale per le soluzioni di gas (O _2, 95% O ₂ / 5% CO ₂₎ per le bolle soluzioni e dei media.
      • Collante cianoacrilato
      • Lama di rasoio o forbici (per tagliare plastica).
      • Sterile lama # 22 bisturi
      • Millicell cellule inserti cultura (0,4 micron, 30 micron di diametro, PICM # 03050) 3 inserti per ogni 6 pozzetti
      • 6-pozzetti cultura (s) (Corning: Costar # 3516)
   3. Filtrare il preparato 250 ml di soluzione di taglio con una da 250 ml filtro Millipore (vedi sopra).
      Aliquota 40 mL di soluzione di taglio in un bicchiere da 50 ml. Posizionare i 40 ml di aliquota di taglio soluzioni e da 210 ml rimanenti soluzione di taglio in freezer (-20 ° C). L'obiettivo è quello di utilizzare queste soluzioni come una miscela fangosa a ~ 4 ° C per ricevere il cervello dopo la rimozione dal cranio (40 ml in bicchiere) e per il taglio (210 ml).
   4. Luogo camera di taglio in metallo (coperto con carta autoclave) in congelatore -20 ° C. Ciò contribuisce a mantenere la soluzione di taglio e fredda cervello durante taglio.
   5. Preparare Media Cultura e mettere in pozzi (Non Media Cultura bolla - sarà schiuma).
      • Preparare 40 mL Media Cultura in tubo da 50 ml per centrifuga di plastica:
        • Miscelare 20 mL HMEM + 10 + 10 mL HBSS aliquota ml di siero di cavallo (Tabella 2)
        • Media Cultura filtro (per sterilizzare) con 50 mL Millipore steriflip 0,22 mM filtro (# SCGP00525).
      • Luogo 1,1 Media Cultura mL in 3 pozzi in diagonale distanziati di un 6-pozzetti (Corning: Costar # 3516 6 grappolo cultura bene). Posto a 6 pozzetti / Cultura Media in incubatore a 37 ° C per almeno un'ora.
   6. Con forbici sterili o lama di rasoio, abbreviare 4 delle pipette di trasferimento (l'uso per il trasferimento fette). Le estremità del tubo tagliato vengono utilizzati senza ulteriori modifiche per disperdere i gas per le soluzioni di bubbling. Questi tubi collegare le linee da serbatoi del 95% O ₂ / 5% di CO ₂ o 100% O ₂ a soluzioni.
   7. Lavare filtro media (50 ml) con 50 mL Millipore steriflip 0,22 mM filtro (# SCGP00525). Luogo supporti Lavare in frigorifero.
3. Preparazione per la chirurgia. Le soluzioni devono essere pronti ad accettare il cervello dopo l'intervento chirurgico (cofano vuoto) e per consentire un rapido taglio e la preparazione per la cultura (cappa a flusso laminare). Noi eseguire l'intervento sotto una cappa vuoto. E 'importante che l'intervento da eseguire in una zona separata per mantenere i fluidi i capelli e il corpo lontano dal semi-sterile cappa a flusso laminare.
   1. Preparare i media e soluzioni.
      • Togliere il becher da 50 ml con 40 ml di soluzione di taglio dal freezer e messo sotto il cofano vuoto di ricevere cervello dopo la rimozione dal cranio. Versare circa 10 ml di questa soluzione di taglio a freddo in un bicchiere da 25 ml. Questo verrà utilizzato per il trasporto di cervello per cappa a flusso laminare.
      • Togliere 210 ml soluzione di taglio da mettere in freezer e cappa a flusso laminare (per il taglio e la raccolta fetta).
      • Rimuovere camera di metallo per affettare dal congelatore e messo sotto cappa a flusso laminare.
      • Bubble entrambe le soluzioni di taglio con% O 95 ₂ / 5% di CO ₂ (usare pipette di plastica tagliata a collegare tubi di soluzione).
   2. Mettere i seguenti elementi sotto il cofano vuoto (30 ml soluzione di taglio è già presente e spumeggiante con il 95% O ₂ / 5% CO _2):
      • autoclave 25 beaker mL
      • Autoclave strumenti chirurgici, guanti, pinze
   3. Rimuovere Lavare Media da frigorifero e bolla con il 100% O ₂ (utilizzo finale delle pipette di plastica tagliata trasferimento per collegare tubi di soluzione).
4. L'intervento chirurgico (effettuato sotto il cofano vuoto di flusso). Questo passaggio è necessario per rimuovere il cervello per la successiva affettare. E 'importante ridurre al minimo il tempo tra sacrificare l'animale e mettendo il cervello a freddo, soluzione ossigenata di taglio. E 'anche importante ridurre al minimo il trauma al cervello. Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato uso, dell'Università del Tennessee Health Science Center.
   1. Noi usiamo ratti Sprague-Dawley, da P6-P17 (noi preferiamo P8-P10). Ratto posto in coperta 2-4 L contenitore di plastica. Per l'anestesia, ~ 1 ml isofluorane viene applicata a un pezzo di garza si trova sotto una maglia di plastica (in modo che non anestetico contatto animale). Anestetizzare ratto con isoflurano fino a quando l'animale è areflexive. Saturare guanti con EtOH.
   2. Dopo ratto è anestetizzato, decapitare l'animale con grandi bisturi, e rimuovere il cervello. Mettere nel cervellobicchiere contenente 30 ml di freddo (~ 4 ° C) Soluzione di taglio per ~ 30 sec. Cura il trasferimento del cervello a 25 mL bicchiere di ridurre al minimo il trasferimento di capelli o sangue al cappuccio a flusso laminare.
   3. Guanti cambiamento (saturare con EtOH).
   4. Cervello trasferimento in soluzione di taglio a freddo (25 beaker mL) a cappa a flusso laminare.
5. Affettare il cervello e prepararsi per la cultura. In questa fase, abbiamo orientare il cervello, rimuovere il tessuto cerebrale non necessari, e tagliare e raccogliere sezioni di cervello. Abbiamo poi lavare le fette, posto ogni fetta su un inserto in rete, collocare il inserti in rete in ben 6 piastre di coltura, e trasferire i piatti (con fette) per l'incubatore per la cultura.
   1. Oriente e cervello blocco (rimuovere cervelletto e polo frontale, rendono parziale metà sagittale ~ tagliato a metà dalla fine corteccia frontale Questo consente il taglio contemporaneo di due fette. - Una per ogni emisfero - ma conserva ancora sia hemsipheres insieme alla fine caudale per un base stabile per incollare allo stadio). Colla bloccato cervello sul palco con cianoacrilato. Cervello posto con corteccia frontale e tagliate le fette coronali della corteccia fronto-parietali. Fare ulteriori tagli bisturi come necessario per limitare la dimensione della slice.
   2. Posizionare il palco con il cervello nella camera di metallo sterilizzato taglio (che è collegato al affettatrice tessuto vibrante) e riempire con bagno freddo ghiaccio, spumeggiante soluzione di taglio. Versare circa 30 ml di soluzione di taglio residuo in un becher da 50 ml (per raccogliere le fette in) e la bolla con il 95% O ₂ / 5% di CO _2.
   3. Tagliate le fette 250-300 micron con una affettatrice tessuto vibrante (Campden Vibroslice # MA572: Strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL, USA). Mettere le fette in coppa che contiene 30 ml di soluzione di taglio. Raccogliere il numero di fette che si desidera cultura (di solito 3-6), più un paio in più.
   4. Lavare Fette: Luogo ~ 2 supporti Lavare mL in un piatto di plastica 35 millimetri Petri. Trasferire tutte le sezioni dalla soluzione di taglio per il piatto di plastica Petri con Media lavaggio. Lavare le fette di 3 volte, utilizzando Media Lavare fresca ogni volta. Utilizzare pipette di trasferimento separato per trasferire le fette, aggiungere contenuti multimediali e soluzioni per aspirare rifiuti.
   5. Trasferimento fette di media cultura (in un altro piatto di plastica 35 millimetri di Petri; pipetta nuovo trasferimento). Rimuovere le cime dalla confezione per gli inserti in rete, ma lasciare gli inserti nella confezione.
   6. Fette trasferimento da Media Cultura di inserti in rete (con cuttransfer pipetta): fette di posizione al centro dell'inserto (Figura 1A). Un po 'piccolo dei terreni di coltura verrà insieme con la fetta. Utilizzando una pipetta trasferire intatto, rimuovere il Media Cultura in eccesso subito dopo aver piazzato fetta verso il basso l'inserto. Cercate di posizione fetta nel centro di inserire (questo facilita la trasfezione biolistic e rende più facile rimuovere la fetta per la registrazione in seguito).
   7. Luogo inserti in mesh / fetta in terreni di coltura in lamiera 6-bene (Figura 1B). Attenzione ad evitare formazione di bolle d'aria sotto la mesh.When 3 inserti / sezioni sono in 6 pozzetti, posto a 6 e piastra posteriore in incubatrice. Incubare fette a 37 ° C incubatore per ~ 1 ora.
6. Fette di trasfezione con Gene Gun (Bio-Rad Helios). Questo può essere fatto subito dopo il taglio e il posizionamento su rete in lamiera 6-bene, tuttavia abbiamo tipicamente incubare per 1 ora a 37 ° C per stabilizzare le fette e poi trasfezione delle cellule. Per i protocolli dettagliati per fare cDNA "proiettili" e usando la pistola Gene, vedi Refs. 17-22.
   1. Carico di plastica "cartidges" contenente "proiettili". (Ci riferiamo a cDNA particelle rivestite d'oro come proiettili. Così, molti proiettili sono contenuti in una plastica "cartuccia".). Lascia la prima posizione libera (no "cartuccia"). Caricare ogni altra posizione con cartuccia contenente cDNA rivestite proiettili. Luogo supporto della cartuccia in armi gene.
   2. Pistola chiaro sparando botte senza cartuccia.
   3. Anticipo barile per uno con cartuccia. Rimuovere 6 pozzetti da incubatore e posto sotto la cappa a flusso laminare. Tenere la pistola appena sopra top di 6-pozzetti. Tenuta in verticale. Spara a ~ 100 psi.
   4. Anticipo botte, chiaro, ripetere. Un colpo per fetta.
   5. Dopo lo scatto, di ritorno da 6 pozzetti con fette / inserti in incubatrice.
7. Fette di cultura (Sotto semi-sterile condizioni). Tutte le manipolazioni delle fette e 6-pozzetti deve essere effettuata indossando guanti saturo di EtOH e sotto la cappa a flusso laminare, dopo la pulizia dell'area con EtOH. Noi la cultura le fette per periodi di tempo diversi (in genere 2-7 giorni) per consentire il recupero dalla procedura acuta affettamento e per dare il tempo per la trasfezione di portare a nuove proteine.
   1. Coltura per 2-7 giorni (37 ° C, 5% CO ₂₎ in incubatore (modello Forma Scientific # 3110).
   2. Sostituire i supporti a giorni alterni: Aggiungere nuovi media ai tre pozzi non occupato, sostituire in incubatore per almeno 1 ora. Spostare fetta / membrana per nuovo pozzo con EtOH puliti pinze curve. Aspirarevecchi media. Ritorna alla piastra incubatrice.

3. Registra da cellule piramidali a Fette

E 'oltre lo scopo di questo protocollo di fornire istruzioni dettagliate sulle tecniche di tutta la registrazione delle cellule. Forniamo informazioni su come trasferire le fette alla camera di registrazione e fornire i dettagli del nostro registrazione set-up, specialmente per quanto riguarda l'identificazione delle cellule transfettate per la registrazione.

1. Tiriamo elettrodi di Harvard GC150TF-10 Sutter vetro con un P-87 estrattore orizzontale. Gli elettrodi sono 2-6 MΩ nella soluzione extracellulare. Gli elettrodi sono riempiti con un KMeSO _{4 nell'abitazione} (cfr. tabella 3).
2. Indossare i guanti. Rimuovere 6 pozzetti da incubatrice. Sotto la cappa a flusso laminare, rimuovere con cura una fetta / maglia inserto con EtOH puliti, pinze curve. Sostituire 6 pozzetti in incubatrice e trasferire la fetta da registrare dal all'area di registrazione. Nel nostro caso questo è in un laboratorio diverso. Noi portiamo l'inserto / sezione in un piatto di plastica coperto 35 millimetri Petri. Dopo questo passo, i guanti non devono essere indossati (senza possibilità di contaminazione delle culture o incubatrice).
3. Tagliare a membrana con # 11 bisturi. Taglio contro la tensione fornita da forcipe o barra di metallo flessibile. (Potrebbe essere necessario per completare i tagli finale con un paio di forbici). Utilizzando pinze, trasferire la fetta con rete collegata alla camera di registrazione sul palco di un microscopio Olympus BX50 WI verticale.
4. Usiamo un amplificatore Axon Instruments 700B Multiclamp e protocolli di acquisizione dati in PClamp 10. Posizione degli elettrodi è controllato con Sutter ROE manipolatori-200 e PC-200. Usiamo un BX-50WI Olympus microscopio in posizione verticale con IR-DIC ottiche per visualizzare neuroni piramidali negli strati II / III o V. Noi utilizziamo un singolo IR sensibile fotocamera (Olympus OLY-150 o DAGE-MTI) e ProVideo monitorare 1201B da visualizzare le cellule nella fetta. Fette sono immersi in carbogenated artificiale liquido cerebrospinale (aCSF: Tabella 3) consegna a 2-3 ml / min a 33 ± 1 ° C.
   Tipicamente, troviamo 10-50 cellule transfettate per fetta. Le cellule si trovano da lookingthrough l'oculare microscopio e con epifluorescenza con un filtro FITC (montato su una ruota portafiltri in un monte torretta trova al di sopra degli obiettivi e sotto l'oculare del microscopio). Questo ci permette di passare facilmente dalla IR-DIC e epifluorescenza per determinare il tipo cellulare, che la cella è transfettate (cella appare verde sotto epifluorescenza e contiene un proiettile), e che la cellula è sana (cella è 3-dimensionale ed ha superficie liscia , nucleo non gonfia, non delle cellule gonfie o rimpicciolito).
   Ci rivolgiamo neuroni piramidali negli strati II / III o V (vedi figura 1). Cellule piramidali sono identificati dalla presenza di un dendrite apicale ascendente verso layer I, numerose spine dendritiche, e pera a forma di soma. Strato è determinato dalla densità cellulare e la posizione rispetto al pia. Generalmente le cellule transfettate sulla superficie della fetta non saranno sani. Anche se è più difficile da visualizzare le cellule in profondità all'interno fetta organotipica che con fette acuta, in genere in grado di visualizzare sane, le cellule transfettate 20-50 micron sotto la superficie della fetta. Utilizziamo standard di tutta metodi di registrazione delle cellule. Ci avviciniamo alla cella sotto la guida visiva e con pressione positiva in voltage-clamp. Le foche sono acquisiti con aspirazione delicata (con siringa da 1 ml) in voltage-clamp. Al raggiungimento di un sigillo GΩ, aspirazione aggiuntiva si applica a rottura alla cella. Abbiamo poi effettuare registrazioni sia in corrente o tensione-clamp.
   Al termine della registrazione, verifichiamo che la cellula registrato è di colore verde, contenente un proiettile, e risponde visibilmente a pressione negativa o positiva. Per controllare per la variazione tra le sezioni, strati di cellule, età al momento della chirurgia, e il tempo nella cultura, abbiamo sempre due le nostre registrazioni delle cellule transfettate con registrazioni a partire da cellule di controllo untransfected dallo strato stesso e si trova con 50 micron della cellula transfettate.

4. Rappresentante dei risultati:

La figura 1A mostra una fetta acutamente preparato seduto sulla membrana per l'inserimento in un 6-pozzetti per la coltura. Questa fetta comprende corteccia motoria e somatosensoriale da un topo P10 cucciolo. Pia si trova a destra della figura, con la materia bianca e striato a sinistra. Figura 1B mostra la fetta / membrana nel pozzo, immersi in ~ 1,1 Media Cultura ml. Il nostro obiettivo per la cultura organotipica è quello di mantenere il normale laminare della corteccia cerebrale, impediscono l'essiccazione superficiale durante cultura, e in ultima analisi, per produrre un'alta percentuale di cellule vive nella fetta dopo diversi giorni di cultura che possono essere registrati da (cellule non rimpicciolito o gonfi, i nuclei delle cellule minimo gonfio, lucido e tre aspetto dimensionale delle cellule in IR-DIC ottica). Figura 1C mostra le immagini IR-DIC e epifluorescenza di una III strato piramidale neurone in una fetta organotipica della corteccia somatosensoriale dopo 3 giornicultura (da animale P10). 1D figura è un'immagine epifluorescenza di una fetta diversa, mostrando diverse cellule V strato transfettate con cDNA per la GFP (celle verdi).

La Figura 2 mostra le tracce di rappresentanza in corrente e tensione-clamp registrazioni da una cella strato V piramidale dopo cultura fetta organotipica per 3 giorni (P10 animale). Figura 2A mostra un potenziale d'azione superamento (AP). Figura 2B mostra scariche ripetitive in risposta ad una s 2, 400 pA iniezione di corrente costante. Queste tracce indicano normale proprietà elettrofisiologiche di un regolare spiking strato V neurone (vedi anche tabella 1). Figura 1C è una tensione-clamp registrazione da un neurone strato V piramidale in presenza di 1 mM tetrodotossina (TTX) per bloccare voltaggio-dipendenti Na ⁺ correnti. Le tracce sono una famiglia di correnti in risposta alla tensione di 500 gradini ms da un potenziale di detenzione di -70 mV a potenziali diversi tra -90 mV e +70 mV (10 mV tra i passaggi).

Figura 1. Fetta di cultura organotipica. A. Fetta di ratto sensomotorio corteccia di ratto su P10 inserire Millicell filtro a rete. Pia si trova a destra, la materia bianca profonda e nello striato a sinistra. La linea mediana si trova al bordo superiore. B. Tre inserti in mesh fetta e immersi in ~ 1 Media Cultura mL e collocati in pozzi adiacenti di 6-pozzetti (stesso animale come in A). C. IR-DIC (superiore) e epifluoresent (inferiore) immagini di cellule strato III neocorticale piramidale nella cultura organotipica (P10 animale, 3 giorni di cultura). Nota "proiettile" visibile nell'immagine DIC (sfera nera). D. immagine fluorescente di neuroni diversi strati V dopo biolistic trasfezione con cDNA per GFP.

Figura 2. Registrazioni da neocorticale cellule piramidali nella cultura fetta organotipica. A. Potenziale d'azione nella cella strato III piramidale (da animale P10, dopo 3 giorni di cultura) in risposta alla suprathreshold 10 ms di iniezione di corrente. B. sparando ripetitivo da un altro strato V neuroni piramidali (P10 ratto, 3 giorni di cultura) in risposta ad una s 2, 400 pA iniezione di corrente. Si trattava di un neurone normale spiking. C. Tensione-clamp registrare da un altro strato di neuroni piramidali V (P10 ratto, 3 giorni di cultura). 1 TTX mM era presente per bloccare voltaggio-dipendenti Na ⁺ corrente. Verso l'esterno, K ⁺ correnti in risposta ad una famiglia di 500 gradini di tensione ms da un potenziale di detenzione di -70 mV (protocollo a destra). Tensioni sono stati corretti per un potenziale di 10 mV giunzione liquida. Resistenza accesso è stato ~ 9 MW. Nessun indennizzo per la resistenza serie o capacità di membrana è stato impiegato.

Tabella 1. Simili proprietà elettriche di controllo vs cellule piramidali GFP-transfettate (fette da ratto p10; organotipica fetta: 3-4 giorni in vitro). Media + errore standard della media (numero di cellule). RMP = potenziale di membrana a riposo, Rn = resistenza di ingresso, AP = potenziale d'azione; V = soglia di tensione per AP, AP HW = larghezza a metà ampiezza.

Trattamento	RMP (mV)	Rn (MΩ)	AP ampiezza	V (mV)	HW (ms)
Controllo	-72 ± 1 (21)	119 ± 17 (11)	84 ± 2 (24)	-45 ± 1 (21)	1,7 ± 0,1 (19)
GFP solo	-77 ± 1 (9)	123 ± 7 (5)	87 ± 2 (24)	-45 ± 2 (9)	2,1 ± 0,2 (7)

Tabella 2. I media commerciali. Questi terreni sono acquistati e utilizzati senza modifiche (Le loro composizioni sono disponibili on-line dal produttore).

¹ Lavare Media: MEM (GIBCO # 12360)
Media Cultura: 20 ml HMEM ¹ (Lonza Biowhittaker), + 10 ml HBSS1 (Gibco, 24020-117) + 10 ml cavallo serum1 (Hyclone # SH 30.074,03)

Tabella 3. Le soluzioni (concentrazioni in mm).

Soluzione di taglio: 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl _{2, 2} MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 20 glucosio (pH 7.4, 310 mOsm / L).
ACSF fluido cerebrospinale artificiale (registrazione esterno): 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl _{2, 2} MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 20 glucosio (pH 7.4, 310 mOsm / L).
Registrazione interna (corrente-clamp): 130,5 KMeSO4, 10 KCl, 7,5 NaCl, 2 MgCl _2, 10 HEPES, 2 ATP, GTP 0,2, 0,1 EGTA (pH 7,2, 285-295 mOsm / L).
Registrazione interna (voltage-clamp): 55 KMeSO _4, 55 KOH, 2 MgCl _2, 20 HEPES, 6 creatina fosfato, 4 ATP, 0,5 GTP, 10 Bapta, 0,1 leupeptina (pH 7,2, 285-295 mOsm / L).

Discussion

Abbiamo studiato i ruoli espressione e funzionale di canali del potassio voltaggio-dipendenti in neuroni piramidali da ratto neocorteccia (4, 9-11). A causa della mancanza di specifici agenti farmacologici per questi canali, usiamo un approccio genetico per manipolare l'espressione canale (1,14,15,17-19). Utilizziamo una preparazione organotipica cultura (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modificata da un approccio di Stoppini et al (16), al fine di mantenere la morfologia cellulare e il modello laminare della corteccia. Isoliamo acuta fette neocorticale al giorno dopo la nascita 6-17 e mantenere le fette in coltura per 2-7 giorni. Questo ci permette di studiare simili a quelli di età compresa tra i neuroni nel nostro lavoro con le fette acuta e riduce al minimo lo sviluppo delle connessioni eccitatorie esuberante nella fetta. Noi registriamo da visivamente identificato neuroni piramidali negli strati II / III o V con illuminazione ad infrarossi (IR) e l'interferenza differenziale microscopia a contrasto (DIC) con il morsetto intera patch di cellule in corrente o tensione-clamp. Biolistic (gene gun) trasfezione di wild-type o mutante del DNA dei canali del potassio è usato per manipolare l'espressione dei canali di studiare la loro funzione (1,14,15,17). Dal co-trasfezione con cDNA per GFP, le cellule trasfettate sono facilmente identificabili al microscopio in epifluorescenza. Confrontiamo le registrazioni delle cellule transfettate adiacenti, i neuroni untransfected nello stesso strato dalla stessa porzione (1,17).

Nessuno dei procedimenti trattati qui sono difficili, ma attenzione ad alcuni dettagli possono migliorare notevolmente i risultati. Nelle nostre mani, la vitalità cellulare è migliore quando le culture sono in fette da ~ P8-P10 animali. E 'importante mantenere semi-sterile condizioni durante l'affettamento e coltura delle fette. Per prevenire la contaminazione batterica, abbiamo gli strumenti in autoclave e pulire l'area chirurgica con la luce UV e EtOH, soluzioni di filtro, indossare guanti e guanti cambio tra la rimozione del cervello e fette di fare. Le conseguenze della contaminazione batterica includono la vitalità dei tessuti poveri e la necessità di decontaminare le incubatrici. Come per tutte le sezioni di cervello, viabilità è migliorata riducendo al minimo il tempo tra il sacrificio dell'animale e affettare. Il cervello deve essere collocato e taglio dovrebbe essere fatto con il cervello immerso in un liquame ghiacciata della soluzione di taglio. Tagliate a bassa velocità, con basse vibrazioni ampiezza orizzontale della lama.

Un altro potenziale problema è l'essiccazione delle fette, mentre in incubatrice. Essiccazione può essere minimizzata preparando slice che sono di piccole dimensioni: limitato alla corteccia di interesse e un piccolo pezzo di corpo striato (a scopo orientativo). Fette di grandi dimensioni tendono ad asciugare in incubatrice ed è più difficile ottenere condizioni di registrazione stabile con fette di grandi dimensioni. Fette sono tagliate a 250-300 micron di spessore. Troviamo che fette sottili (noi preferiamo 250 micron), risultato in meno di asciugatura. Quando si trasferisce fette dalla soluzione di taglio per l'incubatore, laviamo le fette più volte, prima in media Lavare e poi in terreni di coltura. E 'importante rimuovere il liquido in eccesso dopo il trasferimento alla membrana (per permettere fetta di allegare alla mesh). Per i più spesse fette (per esempio, 300 micron), una sola goccia di cultura media ritmo in cima alla fetta (mentre è seduto sulla membrana) aiuta a prevenire l'essiccazione. Questa procedura sembra il primo movimento di carta umida sulla superficie superiore della fetta. Sostituzione della Media Cultura a giorni alterni impedisce anche di essiccazione e promuove la vitalità.

Materials

Surgery / transfection / culture: Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413) disposable supplies for Helios from Bio-Rad: 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264 Tefzel Tubing: #165-2441 Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766). Media: Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321) HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525) Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132. Recording: Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949 Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 lectrode position is controlled with Sutter R–-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North R–ske Avenue, Michigan City, IN 46360).