Hele Cell Opnemen van een organotypische Slice Voorbereiding van de neocortex

Summary

Dit is een protocol voor te bereiden en een neocorticale slice voorbereiding handhaven organotypische cultuur voor het maken van elektrische opnames van piramidale neuronen.

Abstract

We hebben het bestuderen van de expressie en functionele rol van voltage-gated kalium kanalen in piramidale neuronen van de rat neocortex. Vanwege het gebrek aan specifieke farmacologische middelen voor deze kanalen, hebben we een genetische benadering voor het manipuleren van kanaal expressie. We maken gebruik van een organotypische cultuur voorbereiding (16) om cel morfologie en de laminaire patroon van de cortex te behouden. We meestal isoleren acute neocorticale plakken op postnatale dagen 8-10 en onderhouden van de plakjes in de cultuur voor 3-7 dagen. Dit laat ons toe om neuronen studeren op dezelfde leeftijd met die in ons werk met acute plakjes en minimaliseert de ontwikkeling van uitbundige prikkelende verbindingen in de slice. We opnemen van visueel-geïdentificeerde piramidale neuronen in lagen II / III of V met behulp van infrarood verlichting (IR-) en differentieel interferentie contrast microscopie (DIC) met whole cell patch clamp in de huidige-of spanning-klem. Wij gebruiken biolistische (Gene gun) transfectie van wild type of mutant kaliumkanaal DNA om expressie van de kanalen om hun functie studie te manipuleren. De getransfecteerde cellen zijn gemakkelijk te herkennen aan epifluorescentie microscopie na co-transfectie met cDNA voor groen fluorescerend eiwit (GFP). We vergelijken opnames van getransfecteerde cellen naar aangrenzende, ongetransfecteerde neuronen in dezelfde laag van dezelfde slice.

Protocol

1. De voorbereidingen voor de Dag van Slicing

Wij vinden het efficiënter is om de chirurgische instrumenten autoclaaf en oplossingen voor te bereiden voor de dag van in plakken snijden.

1. Autoclave instrumenten. (De operatie en het snijden worden uitgevoerd onder semi-steriele omstandigheden). Autoclaaf de volgende pakketten, individueel verpakt in een autoclaaf papier:
   • Chirurgie pakket: spatel, # 22 scalpel hanteren, schaar, pincet
   • Slicing pakket: 3 knoppen (blade-holding knop en twee bad-beveiliging van knoppen) en de beschermkap (bezit scheermesje uit slicer: Campden Vibroslice, # MA572), individueel verpakt (omdat het zal worden gebracht in de diepvries) op maat gemaakte metalen kamer ( specimen bad) voor slicer (van de fabrikant plexiglas zal men niet herhaald autoclaveren weerstaan), hemostat, schaar, pincet.
   • Glaswerk pakket: twee 50 ml bekers en een 25 ml beker
2. Aliquot paard serum (Hyclone donor equine # 30074 SH: Thermoscientic). Aliquot ~ 11 ml van het paard serum in 15 ml conische buizen. (10 ml serum nodig is. Omdat belletjes vormen wanneer het serum is ontdooid, kunt u 11 mL van waaruit u de vereiste 10 ml aspireren nodig hebben). Bewaar hoeveelheden verdeeld serum in een -20 ° C vriezer.
3. Aliquot media. Nadat de media flessen worden geopend, ze zijn alleen stabiel ~ 4 weken (als gevolg van pH-veranderingen). De plakjes overleven beter met verse media.
   • We maken gebruik van drie soorten van commercieel beschikbare media (gekocht in 500 ml flesjes), plus paard serum. De media zijn: HMEM (Lonza Biowhittaker Minimal Essential Media plus HBSS en HEPES, geen glutamine: Catalog # 12-137f), HBSS (GIBCO Hanks gebufferde zoutoplossing, # 24020 tot 117), en MEM (GIBCO minimaal essentieel medium, # 12360 - 038). Zie tabel 2.
   • Voor elk van de drie soorten media (HMEM, HBSS, en MEM), aliquot ~ 50 ml van een 500 ml fles van media in elk van de vier 50 ml conische buizen. Parafilm alle buizen na aliquoting. Bewaar MEM in de koelkast, en bewaar HMEM en HBSS op kamertemperatuur.
   • De cultuur media bestaat uit een mengsel van het paard serum, HMEM en HBSS (zie hieronder, tabel 2). MEM wordt gebruikt als wassen media.
4. Maak Cutting Oplossing (tabel 3). The Cutting Solution bestaat uit (in mm): NaCl 125, KCl 3, NaH ₂ PO ₄ 1.25, NaHCO ₃ 26, 2 mM CaCl _{2, 2} mM MgCl _2, en 20 mM glucose. We maken doorgaans 250 ml (aan tot de streep in maatkolf). Controleer osmolaliteit (moet zijn ~ 310) en pH (7,2 tot 7,3).

Daaropvolgende stappen (# 2 en # 3) worden uitgevoerd op de dag van het snijden.

2. Chirurgie, snijden, en organotypische Cultuur

Het is belangrijk om de operatie uit te voeren op een aparte locatie ten opzichte van alle andere procedures. We maken gebruik van een vacuüm (damp) kap voor de operatie voor het verwijderen van de hersenen. Een laminaire stroming kap wordt gebruikt voor de procedures uitgevoerd onder semi-steriele omstandigheden, zoals het in plakken snijden en manipulaties van de plakjes en oplossingen.

1. Bereid oplossingen. (Deze procedures niet te worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden als de oplossingen worden gefilterd in een latere stap.).
   1. Bereid Cutting Oplossing (tabel 3). Bubble de oplossing met een mengsel van 95% O ₂ / 5% CO ₂ voor ten minste 20 minuten (om de pH te stabiliseren en te zorgen dat alle zouten in oplossing). Voeg 1 mM pyrodruivenzuur (metabole remmer) and0.6 mM ascorbaat (antioxidant).
   2. Dooi een fractie van een paard serum (11 ml).
2. Bereid laminaire stroming kap (draag handschoenen voor alle procedures, verzadigen handschoenen met EtOH). In dit gedeelte, bereiden we het werkgebied om een ​​schone, semi-steriele werkruimte te bieden. We zullen ook filteren van de oplossingen om ze te steriliseren.
   1. Gebruik UV-licht voor ~ 1 uur om de werkruimte te steriliseren binnen de laminaire stroming kap (UV-licht leidt tot beschadiging van plastic onderdelen, zodat we dekken theCampden Vibroslice die we gebruiken voor het snijden, zie hieronder). Reinig alle oppervlakken met 70% EtOH (met uitzondering van plastic knoppen van de snijmachine: EtOH zal beschadigen). Ook typisch aanwezig onder de laminaire stroming kap zijn de pipetter en pipetten, EtOH fles, lijm, en slangen verbonden met 95% O ₂ / 5% CO ₂ en O ₂ 100.
   2. Plaats de volgende onder laminaire stroming kap:
      • Geautoclaveerd slicing-pakket
      • 250 ml Snijden Solution
      • Millipore Express Plus filter: 250 ml [0,2 um filter (# SC6PU02RE) om Cutting Oplossing filter]:
      • Cultuur Media Componenten:
        • 20 ml HMEM
        • 10 ml HBSS
        • 10 ml horse serum
      • Glaswerk pakket: De geautoclaveerd bekertjes
      • 50 ml MEM wassen media
      • Pipetter (Drummondpipet-aid)
      • Zeven plastic overdracht pipetten (Fisher # 13-711-20). Deze worden gebruikt om slices en oplossingen, maar ook om te dienen als kanaal voor gas-oplossingen (O _2; 95% O ₂ / 5% CO ₂₎ transfer voor borrelen oplossingen en media.
      • Cyanoacrylaat lijm
      • Scheermesje of schaar (van kunststof gesneden).
      • Steriel # 22 scalpel
      • Millicell celcultuur inserts (0,4 micrometer, een diameter van 30 urn, # PICM 03.050) 3 inzetstukken voor elke 6-well plaat
      • 6-well cultuur plaat (s) (Corning: Costar # 3516)
   3. Filter de voorbereide 250 mL snijden oplossing met behulp van een 250 ml Millipore filter (zie hierboven).
      Aliquot 40 mL van Cutting oplossing in een 50 mL bekerglas. Plaats de 40 ml van Cutting Solution en 210 ml resterende Cutting Solution in de diepvries (-20 ° C). Het doel is om deze oplossingen te gebruiken als een modderige mengsel bij ~ 4 ° C voor het ontvangen van de hersenen na verwijdering van de schedel (40 ml in beker) en voor het snijden van (210 ml).
   4. Plaats metaal snijden kamer (bedekt met autoclaaf papier) in de -20 ° C vriezer. Dit helpt om de Cutting Solution en de hersenen koud te houden tijdens het snijden.
   5. Bereid Cultuur Media en in putten (niet bubble Cultuur Media - het zal schuim).
      • Bereid 40 ml Cultuur Media in 50 ml plastic centrifugebuis:
        • Meng 20 ml HMEM + 10 ml HBSS + 10 ml van paard serum (tabel 2)
        • Filter Cultuur Media (te steriliseren) met behulp van 50 ml Millipore steriflip 0,22 uM filter (# SCGP00525).
      • Plaats 1,1 mL Cultuur Media in 3 diagonaal verdeeld wells van een 6-wells plaat (Corning: Costar # 3516 6 goed cultuur cluster). Plaats 6-wells plaat / Cultuur Media in 37 ° C incubator voor ten minste een uur.
   6. Met een steriele schaar of scheermesje, verkorten 4 van de overdracht pipetten (gebruik voor het overzetten van plakjes). De cut buiseinden worden gebruikt zonder verdere wijziging van gassen borrelen oplossingen verspreiden. Deze buizen verbinden de lijnen uit de tanks van 95% O ₂ / 5% CO ₂ of 100% O ₂ tot en met oplossingen.
   7. Filter Wash Media (50 ml) met behulp van 50 ml Millipore steriflip 0,22 uM filter (# SCGP00525). Plaats Was Media in de koelkast.
3. Voorbereiding op een operatie. Oplossingen moeten klaar zijn om de hersenen na de operatie (vacuüm kap) te aanvaarden en om snel snijden en de voorbereiding voor cultuur (laminaire flow kap). Wij voeren de operatie onder een vacuüm kap. Het is belangrijk dat de operatie worden uitgevoerd in een aparte ruimte voor haar en lichaamsvocht weg te houden van de semi-steriele laminaire flow kap.
   1. Bereid media en oplossingen.
      • Verwijder de 50 ml bekerglas met 40 ml Cutting Solution uit de vriezer en zet onder vacuüm motorkap van de hersenen ontvangen na verwijdering van de schedel. Giet ~ 10 ml van deze koude Cutting oplossing in een 25 mL bekerglas. Deze zal worden gebruikt om de hersenen vervoer naar laminaire flow kap.
      • Verwijder de 210 mL Cutting Solution uit de vriezer en zet in laminaire flow kap (voor het snijden en snijd collectie).
      • Verwijder de metalen snijden kamer uit de vriezer en onder een laminaire flow kap.
      • Bubble zowel snij-oplossingen met 95% O ₂ / 5% CO ₂ (gebruik knippen plastic overdracht pipetten om slang aan te sluiten om de oplossing).
   2. Zet de volgende items onder de motorkap vacuüm (30 ml Cutting oplossing is al aanwezig en borrelen met 95% O ₂ / 5% CO _2):
      • geautoclaveerd 25 ml beker
      • Geautoclaveerd chirurgische instrumenten, handschoenen, tangen
   3. Verwijderen Was Media uit koelkast en bel met 100% O ₂ (gebruik het einde van de snede plastic transferpipet om slang aan te sluiten om de oplossing).
4. De operatie (uitgevoerd onder vacuüm stroom afzuigkap). Deze stap is nodig om de hersenen te verwijderen voor de volgende snijden. Het is belangrijk om het minimaliseren van de tijd tussen het dier te offeren en het plaatsen van de hersenen in koude, zuurstofrijke Cutting Solution. Het is ook belangrijk om trauma te minimaliseren naar de hersenen. Alle procedures werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite, de Universiteit van Tennessee, Health Science Center.
   1. We maken gebruik van Sprague-Dawley ratten, van de P6-P17 (geven we de voorkeur P8-P10). Plaats rat in afgedekte 2-4 L plastic container. Voor anesthesie, is ~ 1 mL isofluorane aangebracht op een gaasje gelegen onder een plastic gaas (zodat verdoving niet dier contact). Verdoven rat met isofluraan totdat het dier is areflexive. Verzadig handschoenen met EtOH.
   2. Na de rat is verdoofd, onthoofden het dier met grote scalpel en verwijder de hersenen. Leg de hersenen in debekerglas met 30 ml koud (~ 4 ° C) Cutting Oplossing voor ~ 30 sec. Zorgvuldig hersenen over te dragen aan 25 mL bekerglas om de overdracht van haar of bloed om laminaire flow kap minimaliseren.
   3. Verandering handschoenen (verzadigen met EtOH).
   4. Overdracht hersenen in koude Cutting Solution (25 ml bekerglas) om laminaire flow kap.
5. Snijd de hersenen en voor te bereiden op de cultuur. In deze stap, we oriënteren de hersenen, verwijder onnodige hersenweefsel, en knip en het verzamelen van de hersenen plakjes. Vervolgens hebben we wassen de plakjes, leg elk plakje op een Zeef, plaatst u de mesh inserts in 6-putjes, en de overdracht van de platen (met plakjes) om de broedplaats voor cultuur.
   1. Orient en blokkeren hersenen (cerebellum te verwijderen en frontale pool, maken een gedeeltelijke mid-sagittale cut ~ half weg van frontale cortex einde Dit maakt gelijktijdige snijden van twee plakjes -. Een van elke halfrond - maar nog steeds beide hemsipheres samen aan het caudale einde voor een stabiele basis te lijmen naar fase). Lijm geblokkeerd brein op het podium met cyanoacrylaat. Plaats hersenen met frontale cortex en gesneden plakjes van coronale frontoparietal cortex. Het doen van aanvullende scalpel snijdt zo nodig op maat van de slice te beperken.
   2. Leg het podium met de hersenen in de gesteriliseerde metaal snijden kamer (die is bevestigd aan de vibrerende weefsel snijmachine) en vul bad met ijskoud, borrelende Cutting Solution. Giet ~ 30 ml van de resterende Cutting oplossing in een 50 mL bekerglas (te verzamelen in plakjes) en bel met 95% O ₂ / 5% CO _2.
   3. Snijd 250 tot 300 micrometer plakken met een vibrerende tissue slicer (Campden Vibroslice # MA572: World precisie-instrumenten, Sarasota, FL, USA). Leg plakjes in de beker die 30 ml Cutting Solution bevat. Verzamel het aantal segmenten dat u wilt cultuur (meestal 3-6), plus een paar extra.
   4. Was Slices: Plaats ~ 2 ml Wash Media in een 35 mm plastic petrischaal. Breng alle segmenten van de Cutting Oplossing voor de plastic petrischaal met Wash Media. Was de plakjes 3 keer, met verse Was Media per keer. Gebruik aparte overdracht pipetten te plakken overdracht, media toe te voegen en afval oplossingen aspireren.
   5. Overdracht plakjes Cultuur Media (in een andere 35 mm plastic petrischaal; nieuwe transfer pipet). Haal de toppen uit de verpakking voor de mesh inserts, maar laat de inserts in de verpakking.
   6. Transfer Van Slices Cultuur Media tot mesh inserts (met cuttransfer pipet): Plaats plakjes in het midden van de insert (Figuur 1A). Een klein stukje van Cultuur Media zal samen komen met de slice. Met behulp van een intact transferpipet, verwijder de overtollige Cultuur Media onmiddellijk na het plaatsen van slice naar beneden op de in te voegen. Probeer slice positie in het centrum van voegen (dit vergemakkelijkt biolistische transfectie en maakt het makkelijker te verwijderen van de slice voor latere opname).
   7. Plaats Zeef / slice in Cultuur Media in 6-wells plaat (Figuur 1B). Wees voorzichtig om de vorming van luchtbellen te voorkomen onder de mesh.When 3 inserts / plakjes worden in de 6-well plaat, plaats 6-well plaat terug in de incubator. Incubeer plakjes in 37 ° C incubator voor ~ 1 uur.
6. Transfecteren plakjes met behulp van Gene Gun (Bio-Rad Helios). Dit kan direct worden gedaan na het snijden en de plaatsing op de mesh in 6-well plaat, maar we meestal Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C om de schijfjes te stabiliseren en vervolgens te transfecteren de cellen. Voor gedetailleerde protocollen voor het maken van cDNA "kogels" en het gebruik van de Gene Gun, zie ref. 17-22.
   1. Load plastic "cartridges" die "kogels". (We verwijzen naar cDNA-gecoate gouddeeltjes als kogels. Dus veel kogels zijn opgenomen in een plastic "cartridge".). Laat de eerste positie (geen "cartridge"). Laad elke andere positie met patroon met cDNA-gecoate kogels. Plaats de cartridge houder in gen pistool.
   2. Duidelijke pistool door middel van verhitting vat zonder cartridge.
   3. Advance vat om een ​​met cartridge. Verwijder de 6-well plaat uit incubator en plaats onder de laminaire stroming kap. Houd het pistool net boven de bovenkant van 6-well plaat. Houden verticaal. Schiet op ~ 100 psi.
   4. Advance vat, helder, te herhalen. Een schot per stuk.
   5. Na de opname, terug 6-well platen met plakjes / inserts te incubator.
7. Cultuur plakken (onder semi-steriele omstandigheden). Alle manipulaties van de plakjes en 6-well platen dient te worden uitgevoerd met handschoenen aan verzadigd met EtOH en onder de laminaire stroming kap, na het reinigen gebied met EtOH. We cultuur van de schijfjes voor verschillende perioden (over het algemeen 2-7 dagen) om herstel van de acute snijden procedure mogelijk te maken en tijd te geven voor transfectie leiden tot nieuwe eiwitten.
   1. Cultuur voor 2-7 dagen (37 ° C, 5% CO ₂₎ in de incubator (Forma Scientific model # 3110).
   2. Vervang de media om de andere dag: Voeg nieuwe media aan de drie onbezette putten, te vervangen in incubator voor minstens 1 uur. Bewegen slice / membraan nieuwe goed met EtOH-gereinigd gebogen pincet. Aspirerenoude media. Keer terug plaat incubator.

3. Opnemen vanaf piramidale cellen in Slices

Het valt buiten het bestek van dit protocol om gedetailleerde instructies te geven over whole cell opnametechnieken. Wij bieden informatie over hoe u plakjes over te dragen aan de opname kamer en bijzonderheden van onze opname set-up, vooral betrekking heeft op getransfecteerde cellen te identificeren voor de opname.

1. Trekken we elektroden van Harvard GC150TF-10 glas met behulp van een Sutter P-87 horizontaal trekker. Elektroden zijn MΩ 2-6 in de extracellulaire oplossing. Elektroden zijn gevuld met een KMeSO _vier interne (zie tabel 3).
2. Draag handschoenen. Verwijder de 6-well plaat van incubator. Onder de laminaire stroming kap, verwijder voorzichtig een slice / Zeef met EtOH-gereinigd, gebogen tang. Vervang de 6-wells plaat in de broedstoof en breng de plak op te nemen van de opname gebied. In ons geval is dat in een ander laboratorium. Wij dragen de insert / slice in een overdekte 35 mm plastic petrischaal. Na deze stap, handschoenen hoeft niet te worden gedragen (geen mogelijkheid van besmetting van culturen of incubator).
3. Weggesneden membraan met # 11 scalpel. Bezuiniging op de spanning geleverd door een tang of flexibele metalen staaf. (Het kan nodig zijn om de finale snijdt met een schaar finish). Met behulp van een tang, de overdracht van de plak met aangehechte gaas om de opname kamer op het toneel van een Olympus BX50 WI rechtop microscoop.
4. We maken gebruik van een Axon Instruments Multiclamp 700B versterker en data-acquisitie protocollen in PClamp 10. Elektrodepositie wordt geregeld met Sutter ROE-200 manipulatoren en PC-200 controller. We maken gebruik van een Olympus BX-50WI rechtop microscoop met IR-DIC optiek om piramidale neuronen in lagen II / III of V. We maken gebruik van een IR-gevoelige camera (Olympus OLY-150 of dage-MTI) en ProVideo 1201B monitor visualiseren visualiseren de cellen in de slice. Slices baden in carbogenated kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF: tabel 3) afgeleverd op 2-3 ml / min bij 33 ± 1 ° C.
   Normaal gesproken vinden we 10 tot 50 getransfecteerde cellen per stuk. Cellen zich bevinden door lookingthrough de microscoop oculair en het gebruik van epifluorescentie met een FITC-filter (gemonteerd op een filter wiel in een torentje berg boven de doelstellingen en onder het oculair van de microscoop). Dit stelt ons in staat om gemakkelijk schakelen tussen IR-DIC en epifluorescentie naar cel type te bepalen, dat de cel wordt getransfecteerd (cel verschijnt groen onder epifluorescentie en bevat een kogel), en dat de cel gezond is (cel is 3-dimensionaal en heeft een glad oppervlak , kern niet gezwollen, cel niet gezwollen of gekrompen).
   We richten ons op piramidale neuronen in lagen II / III of V (zie figuur 1). Piramidale cellen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van een apicale dendriet oplopend naar laag I, tal van dendritische spines, en peervormige soma. Laag wordt bepaald door de cel-dichtheid en de locatie ten opzichte van de pia. Over het algemeen getransfecteerde cellen op het oppervlak van het plakje zal niet gezond zijn. Hoewel het moeilijker is om te visualiseren cellen diep in organotypische slice dan met acute plakjes, wij over het algemeen kunnen visualiseren gezonde, getransfecteerde cellen 20 tot 50 micrometer onder de plak oppervlak. We maken gebruik van standaard whole cell opname methoden. We benaderen de cel onder visuele begeleiding en met een positieve druk in de voltage-clamp. Afdichtingen zijn verworven met zachte zuigkracht (met gebruik van 1 ml spuit) onder spanning-klem. Bij het bereiken van een GΩ seal, wordt extra zuigkracht toegepast te breken in de cel. We voer opnamen in een stroom-of spanning-klem.
   Aan het einde van de opname, we controleren of de geregistreerde cel groen is, bevat een kogel, en zichtbaar reageert op negatieve of positieve druk. Om te controleren voor variatie tussen plakjes, cellagen, de leeftijd ten tijde van de operatie, en de tijd in cultuur, hebben we altijd onze paar opnamen van getransfecteerde cellen met opnamen van ongetransfecteerde controle cellen uit dezelfde laag en bevindt zich met 50 urn van de getransfecteerde cel.

4. Representatieve resultaten:

Figuur 1a toont een acuut voorbereid slice zit op het membraan voor het inbrengen in een 6-wells plaat voor het kweken. Dit schijfje bevat motor en somatosensorische cortex van een P10 rat pup. De pia is aan de rechterkant van de figuur, met een witte stof en striatum naar links. Figuur 1B toont de slice / membraan in de put, ondergedompeld in ~ 1,1 ml Cultuur Media. Ons doel voor de organotypische cultuur te behouden het normale patroon van de laminaire cortex, te voorkomen dat het oppervlak drogen tijdens de cultuur, en uiteindelijk tot een groot deel van de levende cellen in de slice te produceren na een aantal dagen in de cultuur die kan worden opgenomen van (cellen niet of gekrompen gezwollen, minimale gezwollen celkernen, glanzend en drie dimensionale weergave van cellen in IR-DIC optica). Figuur 1C toont IR-DIC en epifluorescentie beelden van een laag III piramidale neuronen in een organotypische plakje somatosensorische cortex na 3 dagen incultuur (vanaf P10 dier). Figuur 1D is een epifluorescentie beeld van een ander stuk, waarin een aantal laag V cellen getransfecteerd met cDNA voor GFP (groen cellen).

Figuur 2 toont vertegenwoordiger van sporen in de huidige-en de voltage-clamp opnamen van een laag V piramidale cel na organotypische slice cultuur voor 3 dagen (P10 dier). Figuur 2A toont een overschrijding actiepotentiaal (AP). Figuur 2B toont repeterende schieten in reactie op een 2 s, 400 pA constante stroom injectie. Deze sporen geven aan normaal elektrofysiologische eigenschappen van een gewone spiking laag V neuron (zie ook tabel 1). Figuur 1C is een voltage-clamp opname van een laag V piramidale neuronen in de aanwezigheid van 1 uM tetrodotoxine (TTX) naar voltage-gated Na stromen ⁺ blokkeren. De sporen zijn een familie van stromingen in de reactie op de 500 ms spanning stappen van een bedrijf potentieel van -70 mV aan verschillende potentialen tussen -90 en +70 mV mV (bij 10 mV tussen de stappen).

Figuur 1. Organotypische slice cultuur. A. Slice of rat sensomotorische cortex van de rat op P10 Millicell filtergaas te voegen. Pia is de juiste, diepe witte stof en striatum naar links. De middellijn is aan de bovenrand. B. Drie slice en mesh inserts ondergedompeld in ~ 1 ml cultuur Media en geplaatst in niet-aangrenzende putten van 6-well plaat (hetzelfde dier als in A). C. IR-DIC (bovenste) en (onder) beelden van laag III neocorticale piramidale cel in organotypische cultuur (P10 dier, drie dagen in cultuur) epifluoresent. Note "bullet" zichtbaar is in DIC beeld (zwarte bol). D. Fluorescerende beeld van de verschillende lagen V neuronen na biolistische transfectie met cDNA voor GFP.

Figuur 2. Opnames van neocorticale piramidale cellen in organotypische slice cultuur. A. Actiepotentiaal in laag III piramidale cellen (vanaf P10 dier, na 3 dagen in cultuur) in reactie op suprathreshold 10 ms huidige injectie. B. Repetitieve afvuren van een andere, laag V piramidale neuron (P10 rat, 3 dagen in de cultuur) in reactie op een 2 s, 400 pA stroom injectie. Dit was een regelmatige spiking neuron. C. Voltage clamp-opnemen van een andere laag V piramidale neuron (P10 rat, 3 dagen in cultuur). 1 uM TTX was aanwezig om spanningsafhankelijke Na ⁺ huidige blok. Naar buiten, K ⁺ stromen naar aanleiding van een familie van 500 ms spanning stappen van een bedrijf potentieel van -70 mV (protocol rechts). Spanningen waren gecorrigeerd voor een +10 mV vloeistof knooppunt potentieel. Toegang tot verzet was ~ 9 MΩ. Geen compensatie voor serieweerstand of membraan capaciteit werd gebruikt.

Tabel 1. Soortgelijke elektrische eigenschappen van controle versus GFP-getransfecteerde piramidale cellen (segmenten van p10 rat; organotypische slice: 3-4 dagen in vitro). Gemiddelde + standaard error van het gemiddelde (aantal cellen). RMP = rust membraanpotentiaal, RN = ingangsweerstand, AP = actiepotentiaal; Ve = spanning drempel voor het AP; HW = AP breedte op halve amplitude.

Behandeling	RMP (mV)	Rn (MΩ)	AP amplitude	Ve (mV)	HW (ms)
Controle	-72 ± 1 (21)	119 ± 17 (11)	84 ± 2 (24)	-45 ± 1 (21)	1,7 ± 0,1 (19)
GFP alleen	-77 ± 1 (9)	123 ± 7 (5)	87 ± 2 (24)	-45 ± 2 (9)	2,1 ± 0,2 (7)

Tabel 2. Commerciële media. Deze media worden aangekocht en gebruikt niet-gemodificeerde (Hun composities zijn on-line beschikbaar van de fabrikant).

¹ Was de Media: MEM (GIBCO # 12360)
Cultuur Media: 20 ml HMEM ¹ (Lonza Biowhittaker), + 10 ml HBSS1 (Gibco, 24.020-117) + 10 ml paard serum1 (Hyclone # SH 30.074,03)

Tabel 3. Solutions (concentraties in mM).

Snijden Oplossing: 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl _{2, 2} MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 20 glucose (pH 7,4, 310 mOsm / L).
Kunstmatige hersenvocht aCSF (externe opname): 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl _{2, 2} MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 20 glucose (pH 7,4, 310 mOsm / L).
Interne opname (current-clamp): 130,5 KMeSO4, 10 KCl, NaCl 7,5, 2 MgCl _2, 10 HEPES, 2 ATP, GTP 0,2, 0,1 EGTA (pH 7,2, 285 tot 295 mOsm / L).
Interne opname (voltage-clamp): 55 KMeSO _4, 55 KOH, 2 MgCl _2, 20 HEPES, 6 creatine fosfaat, 4 ATP, GTP 0,5, 10 BAPTA, 0,1 leupeptin (pH 7,2, 285 tot 295 mOsm / L).

Discussion

We hebben het bestuderen van de expressie en functionele rol van voltage-gated kalium kanalen in piramidale neuronen van de rat neocortex (4, 9-11). Vanwege het gebrek aan specifieke farmacologische middelen voor deze kanalen, gebruiken we een genetische benadering voor het manipuleren van kanaal expressie (1,14,15,17-19). Wij gebruiken een organotypische cultuur voorbereiding (2,3, 5-8, 12,13,15-22). Gewijzigd ten opzichte van de aanpak van Stoppini et al. (16), om de cel morfologie en de laminaire patroon van de cortex te behouden. We isoleren acute neocorticale plakken op postnatale dagen 6-17 en onderhouden van de plakjes in de cultuur voor 2-7 dagen. Dit stelt ons in staat om vergelijkbare leeftijd van neuronen studie die in ons werk met acute plakjes en minimaliseert de ontwikkeling van uitbundige prikkelende verbindingen in de slice. We nemen vanaf visueel geïdentificeerd piramidale neuronen in lagen II / III of V met behulp van infrarood verlichting (IR-) en differentieel interferentie contrast microscopie (DIC) met whole cell patch clamp in de huidige-of spanning-klem. Biolistische (Gene gun) transfectie van wild type of mutant kaliumkanaal DNA wordt gebruikt om de expressie van de kanalen te manipuleren om hun functie (1,14,15,17) te bestuderen. Door co-transfectie met cDNA voor GFP, zijn de getransfecteerde cellen gemakkelijk te herkennen onder epifluorescentie microscopie. We vergelijken opnames van getransfecteerde cellen naar aangrenzende, ongetransfecteerde neuronen in dezelfde laag van dezelfde slice (1,17).

Geen van de procedures hier bedekt moeilijk zijn, maar de aandacht op een paar details kan sterk verbeteren van de resultaten. In onze handen, levensvatbaarheid van de cellen is het beste wanneer culturen zijn gemaakt van segmenten van ~ P8-P10 dieren. Het is belangrijk om semi-steriele omstandigheden te handhaven tijdens het snijden en het kweken van de plakjes. Om te voorkomen dat bacteriële besmetting, we autoclaaf de instrumenten en het reinigen van de chirurgische gebied met UV-licht en EtOH, filter oplossingen, handschoenen, handschoenen en verandering tussen het verwijderen van de hersenen en het maken van plakjes. De gevolgen van bacteriële besmetting zijn: een slechte levensvatbaarheid van het weefsel en de noodzaak om de incubators ontsmetten. Zoals met alle plakjes hersenen, wordt levensvatbaarheid verbeterd door het minimaliseren van de tijd tussen offer van het dier en snijden. De hersenen moeten worden geplaatst en in plakken snijden moet gebeuren met de hersenen ondergedompeld in een ijskoude brij van de Cutting Solution. Snijd bij lage snelheid, met een lage amplitude horizontale trilling van het blad.

Een ander potentieel probleem is uitdroging van plakjes, terwijl in de incubator. Drogen kan worden geminimaliseerd door het bereiden van plakjes die klein: beperkt tot de cortex van belang en een klein stukje striatum (ter oriëntatie). Grote sneden hebben de neiging om uit te drogen in de incubator en is het moeilijker om stabiele omstandigheden van de opname te verkrijgen met grote plakjes. Plakjes worden gesneden op 250-300 um dik. We vinden dat dunnere plakjes (onze voorkeur 250 pm) resulteren in minder drogen. Bij het overbrengen van segmenten van het snijden oplossing voor de couveuse, wassen we plakken een paar keer, eerst in Wash Media en vervolgens in cultuur Media. Het is belangrijk om overtollige vloeistof te verwijderen na overdracht aan het membraan (om slice te hechten aan de mesh). Voor dikkere plakken (bijvoorbeeld 300 m), een enkele druppel van Cultuur Media tempo op de top van de slice (terwijl hij zit op het membraan) helpt te voorkomen dat het drogen. Deze procedure lijkt de beweging van vochtige media priemgetal met de bovenkant van het segment. Het vervangen van de Cultuur Media om de andere dag ook voorkomt uitdroging en bevordert levensvatbaarheid.

Materials

Surgery / transfection / culture: Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413) disposable supplies for Helios from Bio-Rad: 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264 Tefzel Tubing: #165-2441 Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766). Media: Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321) HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525) Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132. Recording: Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949 Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 lectrode position is controlled with Sutter R–-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North R–ske Avenue, Michigan City, IN 46360).