Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

Summary

Dies ist ein Protokoll zu erstellen und Aufrechterhaltung eines Neokortex Scheibe Vorbereitung in organotypischen Kultur zum Zwecke der Herstellung elektrischer Aufnahmen von pyramidalen Neuronen.

Abstract

Wir haben die Untersuchung der Expression und funktionelle Rolle von spannungsabhängigen Kaliumkanälen in pyramidalen Neuronen von Ratten Neocortex. Wegen des Fehlens von spezifischen pharmakologischen Wirkstoffen für diese Kanäle, haben wir einen genetischen Ansatz zur Manipulation Kanal Ausdruck übernommen. Wir verwenden ein organotypischen Kultur Vorbereitung (16), um Zellmorphologie und der laminaren Muster der Hirnrinde zu halten. Wir in der Regel zu isolieren akuten neokortikalen Scheiben an postnatalen Tag 8-10 und halten die Scheiben in der Kultur für 3-7 Tage. Dies erlaubt uns, Neuronen in einem ähnlichen Alter wie in unserer Arbeit mit akuter Scheiben Studie und minimiert die Entwicklung von üppigen exzitatorischen Verbindungen in die Scheibe. Wir erfassen von visuell identifizierten Pyramidenneuronen in den Schichten II / III oder V mit Infrarot-Beleuchtung (IR-) und Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (DIC) mit ganzen Zelle Patch-Clamp-in Strom-oder Spannungs-Klemme. Wir verwenden biolistischen (Gene gun) Transfektion von Wildtyp-oder mutierte Kaliumkanal DNA, um die Expression der Kanäle, um ihre Funktion zu untersuchen manipulieren. Die transfizierten Zellen werden leicht durch Epifluoreszenzmikroskopie nach Co-Transfektion mit cDNA für das grün fluoreszierende Protein (GFP) identifiziert. Wir vergleichen Aufnahmen von transfizierten Zellen zu benachbarten, nicht transfizierten Neuronen in der gleichen Schicht aus dem gleichen Stück.

Protocol

1. Vorbereitungen vor dem Tag der Slicing

Wir finden es ist effizienter, die chirurgischen Instrumente Autoklaven und bereiten Lösungen vor dem Tag des Schneidens.

1. Autoclave Instrumente. (Die Operation und Schneiden sind unter semi-sterilen Bedingungen durchgeführt wird). Autoclave die folgenden Pakete, die einzeln in Papier eingewickelt Autoklaven:
   • Chirurgie-Paket: Spachtel, Nr. 22 Skalpell Griff, Scheren, Pinzetten
   • Slicing-Paket: 3 Knöpfen (Blade-Holding-Regler und 2 Bäder Sicherung Drehregler) und Messerschutz (hält Rasierklinge aus Hobel: Campden Vibroslice, # MA572), einzeln verpackt (weil es in Gefrierfach gelegt werden) custom made ​​Metall Kammer ( Probe Bad) für Hobel (die des Herstellers Plexiglas wird man nicht widerstehen wiederholtes Autoklavieren), hemostat, Scheren, Pinzetten.
   • Glaswaren Paket: zwei 50-ml-Becher und ein 25 mL Becherglas
2. Aliquot Pferdeserum (Hyclone Spender equine # SH 30074: Thermoscientic). Aliquot ~ 11 ml Pferdeserum in 15 ml konische Röhrchen. (10 mL Serum benötigt wird. Da Blasen bilden, wenn das Serum aufgetaut ist, können Sie 11 mL, aus denen die erforderlichen 10 mL absaugen zu müssen). Shop aliquotiert Serum in einem -20 ° C Gefrierschrank.
3. Aliquot Medien. Nachdem die Medien Flaschen geöffnet sind, sind sie nur für ~ 4 Wochen (aufgrund der pH-Änderungen) stabil. Die Scheiben überleben besser mit frischen Medien.
   • Wir verwenden drei Arten von kommerziell verfügbaren Medien (gekauft in 500 ml Flaschen), plus Pferdeserum. Die Medien sind: HMEM (Lonza Biowhittaker Minimal Essential Media plus HBSS und HEPES, ohne Glutamin: Catalog # 12-137f), HBSS (GIBCO Hanks Salzlösung, # 24020-117) und MEM (GIBCO minimal essential medium, # 12360 - 038). Siehe Tabelle 2.
   • Für jede der drei Arten von Medien (HMEM, HBSS und MEM), aliquoten ~ 50 ml aus einem 500 ml-Flasche von Medien in jedem der vier 50 ml konische Röhrchen. Parafilm alle Rohre nach Aliquotierung. Shop MEM in den Kühlschrank, und bewahren Sie HMEM und HBSS bei Raumtemperatur.
   • Die Kulturmedien besteht aus einer Mischung aus Pferdeserum, HMEM und HBSS (siehe unten, Tabelle 2). MEM ist als Wasch-Medien verwendet.
4. Machen Cutting Solution (Tabelle 3). NaCl 125, KCl 3, NaH ₂ PO ₄ 1,25, NaHCO ₃ 26, 2 mM CaCl _2, 2 mM MgCl ₂ und 20 mM Glucose: The Cutting Solution ist der (in mm). Wir machen typischerweise 250 mL (bringen, um die Lautstärke in Messkolben). Überprüfen Sie Osmolalität (sollte ~ 310 sein) und pH (7,2-7,3).

Nachfolgende Schritte (# 2 und # 3) sind am Tag der Schneiden durchgeführt.

2. Chirurgie, Slicing und organotypischen Kultur

Es ist wichtig, die Operation an einem anderen Ort im Vergleich zu allen anderen Verfahren durchzuführen. Wir verwenden ein Vakuum (Rauch) Haube für die Operation zur Entfernung des Gehirns. Ein Laminar-Flow-Haube ist für Verfahren unter semi-sterilen Bedingungen, wie das Aufschneiden und Manipulationen der Scheiben und Lösungen durchgeführt werden.

1. Bereiten Lösungen. (Diese Verfahren müssen nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, da die Lösungen in einem späteren Schritt gefiltert werden.).
   1. Bereiten Cutting Solution (Tabelle 3). Bubble-Lösung mit einer Mischung aus 95% O ₂ / 5% CO ₂ für mindestens 20 Minuten (zur pH-Stabilisierung und sicherzustellen, dass alle Salze sind in Lösung). Add 1 mM Brenztraubensäure (metabolic-Inhibitor) and0.6 mM Ascorbat (Antioxidans).
   2. Thaw 1 ALIQUOT von Pferdeserum (11 mL).
2. Bereiten Laminarströmungshaube (Handschuhe für alle Verfahren, sättigen Handschuhe mit EtOH). In diesem Abschnitt stellen wir die Arbeit in einen reinen, semi-sterile Arbeit Raum zu geben. Wir werden auch Filter die Lösungen, um sie zu sterilisieren.
   1. Verwenden Sie UV-Licht für ca. 1 Stunde, um den Arbeitsplatz innerhalb der Laminarströmungshaube sterilisieren (UV-Licht wird Kunststoffteile beschädigt, so dass wir theCampden Vibroslice verwenden wir für das Schneiden decken, siehe unten). Reinigen Sie alle Oberflächen mit 70% EtOH (außer Knöpfen der Allesschneider: EtOH beschädigen). Auch typischerweise unter der Sterilbank werden die Pipette und Pipetten, EtOH Flasche, Leim und Schläuche angeschlossen bis 95% O ₂ / 5% CO ₂ und 100 O _2.
   2. Platzieren Sie den folgenden unter Laminar-Flow-Haube:
      • Autoklaviert Slicing-Paket
      • 250 mL Cutting-Lösung
      • Millipore Express Plus-Filter: 250 ml [0,2 um-Filter (# SC6PU02RE) zu Cutting Lösung filter]:
      • Kultur Media Components:
        • 20 mL HMEM
        • 10 mL HBSS
        • 10 mL Pferdeserum
      • Glaswaren-Paket: Das autoklaviert Becher
      • 50 ml MEM waschen Medien
      • Pipetten (Drummondpipet-aid)
      • Sieben Kunststoff Transferpipetten (Fisher # 13-711-20). Diese werden verwendet, um Scheiben und Lösungen, sowie als Leitung für Gas-Lösungen dienen (O _2, 95% O ₂ / 5% CO ₂₎ Transfer für sprudelnde Lösungen und Medien.
      • Sekundenkleber
      • Rasierklinge oder einer Schere (für Kunststoff-cut).
      • Sterile Nr. 22 Skalpell
      • Millicell Zellkultureinsätzen (0,4 mu m, 30 Mikrometer Durchmesser, # PICM 03050) 3 Einsätze für je 6-well-Platte
      • 6-well-Kulturplatte (s) (Corning: Costar Nr. 3516)
   3. Filtern Sie die vorbereiteten 250 mL Cutting-Lösung mit einem 250 mL Millipore-Filter (siehe oben).
      Aliquot von 40 mL Cutting-Lösung in einen 50 ml-Becherglas werden. Legen Sie die 40 mL Aliquot Cutting-Lösung und 210 mL verbleibenden Cutting Solution in Gefrierschrank (-20 ° C). Das Ziel ist es, diese Lösungen als matschigen Mischung Einsatz bei ~ 4 ° C für die Aufnahme des Gehirns nach der Entnahme aus dem Schädel (40 mL im Becherglas) und für das Schneiden (210 mL).
   4. Legen Metall schneiden Kammer (bedeckt mit Autoklav-Papier) in -20 ° C Gefrierschrank. Dies hilft, die Cutting-Lösung und Gehirn kalt beim Schneiden zu halten.
   5. Bereiten Kultur, Medien und in Vertiefungen (nicht bubble Kultur, Medien - es wird Schaum).
      • Bereiten Sie 40 mL Kultur, Medien in 50 mL Kunststoff-Zentrifugenröhrchen:
        • Mix 20 mL HMEM + 10 ml HBSS + 10 mL Aliquot Pferdeserum (Tabelle 2)
        • Filter Culture Media (zu sterilisieren) mit 50 ml Millipore Steriflip 0,22 um Filter (# SCGP00525).
      • Legen Sie 1,1 ml Kultur Medien in 3 diagonal angeordnet Vertiefungen einer 6-Well-Platte (Corning: Costar Nr. 3516 6 gut Kultur-Cluster). Legen Sie 6-Well-Platte / Kultur Medien in 37 ° C Inkubator für mindestens eine Stunde.
   6. Mit einer sterilen Schere oder Rasierklinge, verkürzen 4 des Transfer Pipetten (verwenden Sie für die Übertragung von Scheiben). Der Schnitt Rohrenden sind ohne weitere Modifikation an Gasen für sprudelnde Lösungen zerstreuen verwendet. Diese Rohre verbinden die Linien aus den Tanks von 95% O ₂ / 5% CO ₂ oder 100% O ₂ Lösungen.
   7. Filter waschen Medien (50 ml) mit 50 ml Millipore Steriflip 0,22 um Filter (# SCGP00525). Ort Wash Medien im Kühlschrank.
3. OP-Vorbereitung. Lösungen müssen bereit sein, das Gehirn nach der Operation (Vakuum Haube) zu akzeptieren und ermöglichen eine schnelle Schneiden und Vorbereitung für Kultur (Laminarströmungshaube). Wir führen die Operationen unter einem Vakuum Haube. Es ist wichtig, dass die Operation in einem separaten Bereich durchgeführt werden, um Haare und Körperflüssigkeiten weg von der semi-sterile Laminarströmungshaube halten.
   1. Bereiten Medien und Lösungen.
      • Entfernen Sie die 50 mL Becherglas mit 40 mL Cutting-Lösung aus dem Gefrierschrank und stellte unter Vakuum Haube des Gehirns nach der Entnahme aus Schädels erhalten. Gießen Sie ca. 10 mL dieser kalten Cutting-Lösung in einem 25 mL Becherglas. Dies wird verwendet, um Gehirn zu Laminarströmungshaube transportieren.
      • Nehmen Sie 210 ml Cutting-Lösung aus dem Gefrierschrank und stellte in Laminarströmungshaube (zum Schneiden und Slice-Sammlung).
      • Entfernen Metall schneiden Kammer aus dem Gefrierschrank und stellte unter Laminar-Flow-Haube.
      • Blase sowohl Schneid-Lösungen mit 95% O ₂ / 5% CO ₂ (Verwendung geschnittener Kunststoff Transferpipetten dem Schlauch zur Lösung connect).
   2. Legen Sie die folgenden Punkte unter der Absaughaube (30 mL Cutting-Lösung ist bereits vorhanden und sprudelnden mit 95% O ₂ / 5% CO _2):
      • autoklaviert 25 mL Becherglas
      • Autoklaviert chirurgische Instrumente, Handschuhe, Pinzette
   3. Entfernen Wash Medien aus dem Kühlschrank und Blase mit 100% O ₂ (Einsatz Ende geschnittener Kunststoff Transferpipette dem Schlauch zur Lösung connect).
4. Die Operation (durchgeführt unter Vakuum Abzugshaube). Dieser Schritt ist erforderlich, um das Gehirn für die spätere Schneiden zu entfernen. Es ist wichtig, die Zeit zwischen opfern das Tier und Platzierung des Gehirns in kaltes, sauerstoffreiches Cutting-Lösung zu minimieren. Es ist auch wichtig, um Verletzungen des Gehirns zu minimieren. Alle Verfahren wurden von der Animal Care und Verwenden Committee, University of Tennessee, Health Science Center genehmigt.
   1. Wir verwenden Sprague-Dawley-Ratten, von P6-P17 (wir bevorzugen P8-P10). Legen Sie Ratte in abgedeckten 2-4 l-Kunststoff-Behälter. Für Anästhesie, ist ~ 1 mL Isofluoran ein Stück Gaze unter einem Kunststoffgitter angebracht wird (so dass Betäubungsmittel nicht in Kontakt mit Tieren). Anesthetize Ratte mit Isofluran, bis das Tier areflexive. Tränken Sie Handschuhe mit EtOH.
   2. Nach Ratte ist betäubt, enthaupten das Tier mit großen Skalpell, und entfernen Gehirn. Put Gehirn in dieBecherglas mit 30 ml kaltem (ca. 4 ° C) Cutting-Lösung für ~ 30 sek. Sorgfältig Transfer Gehirn zu 25 mL Becherglas um den Transfer von Haaren oder Blut Laminarströmungshaube minimieren.
   3. Wechseln Sie die Handschuhe (sättigen mit EtOH).
   4. Transfer Gehirn in kalten Cutting-Lösung (25 ml Becher), um Laminarströmungshaube.
5. Scheiben des Gehirns und die Vorbereitungen für Kultur. In diesem Schritt entfernen orientieren wir das Gehirn, nicht benötigte Hirngewebe, und schneidet und sammelt Hirnschnitten. Wir haben dann waschen Sie die Scheiben schneiden, jede Scheibe auf einem Mesh-Einsatz, legen Sie die Mesh-Einsätze in 6-well-Platten, und übertragen Sie die Platten (mit Scheiben) in den Inkubator für die Kultur.
   1. Orient und Block Gehirn (entfernen Kleinhirn und frontalen Pol, Teillieferungen Mitte sagittalen Schnitt ~ halbem Weg zwischen frontalen Kortex Ende Dieser ermöglicht die simultane Schneiden von zwei Scheiben -. Einer aus jeder Hemisphäre - aber noch immer sowohl hemsipheres zusammen am kaudalen Ende für eine stabile Basis zu kleben, um Stufe). Kleber blockiert Gehirn auf der Bühne mit Sekundenkleber. Legen Gehirn mit frontalen Kortex zerschnitten und koronalen Scheiben frontoparietal Kortex. Nehmen Sie zusätzliche Skalpell schneidet wie notwendig, um Größe der Scheibe zu beschränken.
   2. Legen Sie die Bühne mit dem Gehirn in die sterilisierten Metall schneiden Kammer (das ist die schwingende Gewebe Slicer befestigt) und füllen Bad mit eiskaltem, sprudelnde Cutting Solution. Gießen Sie ca. 30 mL der verbleibenden Cutting-Lösung in ein 50 mL Becherglas (in Scheiben in zu sammeln) und Blase mit 95% O ₂ / 5% CO _2.
   3. Cut 250-300 um Scheiben mit einem vibrierenden Gewebe Allesschneider (Campden Vibroslice # MA572: World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA). Legen Sie Scheiben in das Becherglas, dass 30 mL Cutting-Lösung enthält. Sammeln Sie die Anzahl der Slices Sie wollen Kultur (typischerweise 3-6), plus ein paar Extra.
   4. Wash Slices: Place ~ 2 mL Wash Medien in einem 35 mm Kunststoff-Petrischale. Übertragen Sie alle Scheiben aus dem Cutting-Lösung, die Kunststoff-Petrischale mit Wash Media. Wash Scheiben 3 mal mit frischen Wash Medien jeder Zeit. Verwenden Sie getrennte Transferpipetten auf Scheiben übertragen, fügen Sie Medien, und saugen Abfall-Lösungen.
   5. Transfer-Scheiben auf Nährmedien (in einem anderen 35 mm Kunststoff-Petrischale, neue Transferpipette). Entfernen Sie die Spitzen aus der Verpackung für die Mesh-Einsätze, aber lassen Sie die Einsätze in der Verpackung.
   6. Transfer-Slices aus Kulturmedien zu Mesh-Einsätze (mit cuttransfer Pipette): Position Scheiben in der Mitte des Einsatzes (Abbildung 1A). Ein kleines bisschen Kultur, Medien wird kommen zusammen mit der Scheibe. Mit einer intakten Transferpipette, entfernen Sie das überschüssige Kultur Medien unmittelbar nach dem Absenden Scheibe nach unten auf die Einlage. Versuchen Sie, Scheibe in der Mitte der Insert-Position (dies erleichtert biolistischen Transfektion und macht es einfacher, die Scheibe für eine spätere Aufnahme zu entfernen).
   7. Legen Sie Netzeinsatz / Scheibe in Nährmedien in 6-Well-Platte (Abbildung 1B). Seien Sie vorsichtig, um die Bildung von Luftblasen unter der mesh.When 3 Einsätze / Scheiben zu verhindern werden in der 6-Well-Platte, Platz 6-Loch-Platte zurück in Inkubator. Inkubieren Scheiben in 37 ° C Inkubator für ~ 1 Stunde.
6. Transfizieren Scheiben mit Gene Gun (Bio-Rad Helios). Diese können sofort nach dem Schneiden und Platzierung auf Netz in 6-Well-Platte durchgeführt werden, aber wir in der Regel für 1 Stunde bei 37 ° C, um die Scheiben zu stabilisieren und dann schleusen die Zellen. Für detaillierte Protokolle für die Herstellung cDNA "Kugeln" und mit der Gene Gun, siehe Refs. 17-22.
   1. Laden Kunststoff "Kartuschen", die "Kugeln". (Wir verweisen auf cDNA-beschichtete Goldpartikel als Aufzählungszeichen. So viele Kugeln in einer Kunststoff-"Patrone" enthalten sind.). Verlassen Sie die erste Position (kein "Cartridge"). Legen Sie jeden zweiten Position mit Kartusche, die cDNA-beschichtete Kugeln. Legen Sie Patronenhalter in Gen-Kanone.
   2. Klare Pistole durch Brennen Fass ohne Patrone.
   3. Advance-Barrel auf eine mit Kassette. Entfernen 6-Well-Platte von Inkubator und unter der Sterilbank. Halten Pistole knapp oberhalb der oberen 6-Well-Platte. Halten senkrecht. Schießt auf ~ 100 psi.
   4. Advance-Fass, klar, zu wiederholen. Ein Schuss pro Scheibe.
   5. Nach der Aufnahme zurück 6-well-Platten mit Scheiben / Beilagen zu Inkubator.
7. Kultur Scheiben (unter semi-sterilen Bedingungen). Alle Manipulationen der Scheiben und 6-Well-Platten sollten durchgeführt Tragen von Handschuhen mit EtOH und unter der Sterilbank gesättigt, nach der Reinigung mit EtOH werden. Wir Kultur die Scheiben für verschiedene Zeiträume (in der Regel 2-7 Tage), um eine Wiederherstellung aus der akuten Slicing Verfahren und zu Zeit für die Transfektion zu neuen Proteins führen können.
   1. Kultur für 2-7 Tage (37 ° C, 5% CO ₂₎ in Inkubator (Forma Scientific Modell # 3110).
   2. Ersetzen Medien jeden zweiten Tag: Add new media die drei unbesetzten Brunnen, ersetzen in Inkubator für mindestens 1 Stunde. Bewegen Slice / Membran auf neue gut mit EtOH gereinigt gebogenen Pinzette. Aspirierenalten Medien. Zurück Platte Inkubator.

3. Rekord von Pyramidenzellen in Scheiben

Es würde den Rahmen dieses Protokolls, um detaillierte Anweisungen zur ganzen Zelle Aufnahmetechniken bieten. Wir bieten Informationen über die Scheiben, um die Aufnahme Kammer übertragen und liefert detaillierte Angaben über unsere Recording-, vor allem bezieht sich auf die Identifizierung transfizierten Zellen für die Aufnahme.

1. Wir ziehen Elektroden aus Harvard GC150TF-10 Glas mit einem Sutter P-87 horizontalen Puller. Die Elektroden sind MOhm in der extrazellulären Lösung 2-6. Die Elektroden sind mit einem KMeSO ₄ interne (siehe Tabelle 3) gefüllt.
2. Handschuhe tragen. Entfernen 6-Well-Platte aus Inkubator. Unter der Sterilbank, entfernen Sie vorsichtig eine Scheibe / Netzeinsatz mit EtOH gereinigt, gebogene Pinzette. Ersetzen Sie 6-Well-Platte im Brutschrank und übertragen Sie die Scheibe aus, um die Aufnahme aufgezeichnet werden. In unserem Fall ist dies in einem anderen Labor. Wir tragen die insert / Scheibe in einer überdachten 35 mm Kunststoff-Petrischale. Nach diesem Schritt müssen Handschuhe nicht getragen werden (keine Möglichkeit einer Kontamination Kulturen oder Inkubator).
3. Cut entfernt Membran mit Nr. 11 Skalpell. Cut gegen Zug mit einer Pinzette oder flexible Metall-bar versorgt. (Es kann notwendig sein, um die endgültige schneidet mit einer Schere Finish). Mit einer Pinzette, übertragen Sie die Scheibe mit aufgesetzten Netztaschen, um die Aufnahme Kammer auf der Bühne eines Olympus BX50 WI aufrechten Mikroskop.
4. Wir verwenden ein Axon Instruments Multiclamp 700B Verstärker und Datenerfassung Protokolle in PClamp 10. Elektrodenposition mit Sutter ROE-200 Manipulatoren und PC-200-Controller gesteuert. Wir verwenden eine Olympus BX-50WI aufrechten Mikroskop mit IR-DIC Optik Pyramidenneuronen in den Schichten II / III oder V. Wir verwenden einen einzigen IR-empfindliche Kamera (Olympus OLY-150 oder DAGE-MTI) und ProVideo 1201B Monitor zu visualisieren visualisieren die Zellen in der Scheibe. Bei 2-3 ml / min bei 33 ± 1 ° C geliefert: Scheiben sind in carbogenated künstlichen Liquor (Tabelle 3 aCSF) gebadet
   In der Regel finden wir 10-50 transfizierten Zellen pro Scheibe. Die Zellen werden durch lookingthrough das Mikroskop-Okular und mit Epifluoreszenz mit einem FITC-Filter (montiert auf einem Filterrad in einem Turm montiert über die Ziele und unter dem Okular des Mikroskops befindet) entfernt. Dies ermöglicht uns, schnell zwischen IR-DIC und Epifluoreszenz Schalter Zelltyp zu bestimmen, dass die Zelle transfiziert wird (Zelle erscheint grün unter Epifluoreszenz und enthält eine Kugel), und dass die Zelle gesund ist (Zelle ist 3-dimensional und hat glatte Oberfläche , Kern nicht geschwollen, Zelle nicht geschwollen oder geschrumpft).
   Wir haben das Ziel Pyramidenneuronen in den Schichten II / III oder V (siehe Abbildung 1). Pyramidenzellen werden durch die Anwesenheit eines Dendriten aufsteigender Richtung Schicht I, zahlreiche dendritische Dornen, und birnenförmig soma identifiziert. Schicht wird durch die Zelldichte und die Lage relativ zu den pia bestimmt. Generell transfizierten Zellen auf der Oberfläche der Scheibe wird nicht gesund sein. Obwohl es schwieriger ist es, Zellen tief in organotypischen Slice als mit akuter Scheiben visualisieren wir in der Regel visualisieren können gesunde, transfizierten Zellen 20 bis 50 mu m unterhalb der Scheibe Oberfläche. Wir verwenden Standard-Ganzzell Erfassungsmethoden. Wir nähern uns der Zelle unter Sichtkontrolle und mit Überdruck in Voltage-Clamp. Die Dichtungen sind mit sanften Sog (mit 1 ml-Spritze) unter Voltage-Clamp erworben. Nach Erreichen eines GOhm Dichtung, ist eine zusätzliche Absaugen angewendet, um in die Zelle zu brechen. Wir führen Sie dann Aufnahmen entweder Strom-oder Spannungs-Klemme.
   Am Ende der Aufnahme, wir überprüfen, ob die aufgenommenen Zelle grün ist, enthält eine Kugel, und sichtlich reagiert auf positive oder negative Druck. Zur Kontrolle für die Variation zwischen den Schichten, Zellschichten, Alter zum Zeitpunkt der Operation und die Zeit in der Kultur sind wir immer zwei unserer Aufnahmen von transfizierten Zellen mit Aufnahmen von transfizierten Kontrollzellen aus der gleichen Schicht und liegt mit 50 um der transfizierten Zelle.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1A zeigt eine akut vorbereitet Scheibe sitzt auf der Membran zum Einsetzen in eine 6-Well-Platte für die Kultivierung. Diese Scheibe enthält Motor und somatosensorischen Kortex von einem P10 Jungtier. Die Pia ist auf der rechten Seite der Figur, mit der weißen Substanz und Striatum auf der linken Seite. Abbildung 1B zeigt die Scheibe / Membran in den Brunnen, in ~ 1,1 mL Kultur, Medien eingetaucht. Unser Ziel für die organotypischen Kultur ist es, die normale laminare Muster der Hirnrinde zu behalten, zu verhindern Antrocknen während der Kultur, und letztlich zu einem hohen Anteil an lebenden Zellen in der Schicht nach mehreren Tagen in der Kultur, die sich aus aufgenommen werden können, zu produzieren (Zellen nicht geschrumpft oder geschwollen, minimal geschwollene Zellkerne, glänzend und dreidimensionale Darstellung von Zellen in IR-DIC-Optik). Abbildung 1C zeigt IR-DIC und Epifluoreszenz Bilder einer Schicht III pyramidalen Neuronen in einem organotypischen Scheibe somatosensorischen Kortex nach 3 Tagen inKultur (von P10 Tier). 1D ist ein Epifluoreszenz Bild von einem anderen Stück, zeigen mehrere Schicht V-Zellen mit cDNA für GFP (grüne Zellen) transfiziert.

Abbildung 2 zeigt repräsentative Spuren in Strom-und Spannungs-Clamp-Aufnahmen aus einer Schicht V Pyramidenzellen nach organotypischen Kultur für 3 Tage (P10 Tier). 2A zeigt eine Überschreitung Aktionspotential (AP). 2B zeigt repetitiven Entladungen in Reaktion auf ein 2 s, 400 pA Konstantstrom Injektion. Diese Spuren normaler elektrophysiologischen Eigenschaften eines regelmäßigen spiking Schicht V Neuron (siehe auch Tabelle 1). 1C ist ein Voltage-Clamp-Aufnahme aus einer Schicht V pyramidalen Neuronen in Gegenwart von 1 uM Tetrodotoxin (TTX), um spannungsgesteuerte Na ^+-Ströme zu blockieren. Die Spuren sind eine Familie von Strömungen in Reaktion auf 500 ms Spannung Schritte aus einem Betrieb Potential von -70 mV auf verschiedene Potentiale zwischen -90 mV und +70 mV (bei 10 mV zwischen den Schritten).

Abbildung 1. Organotypischen Kultur. A. Slice of Ratte sensomotorischen Kortex von P10 Ratte auf Millicell Filter Netzeinsatz. Pia ist auf der rechten Seite, Marklager und Striatum auf der linken Seite. Die Mittellinie ist am oberen Rand. B. Drei Scheiben schneiden und Mesh-Einsätze in ~ 1 mL Kultur, Medien untergetaucht und in benachbarte Vertiefungen der 6-well-Platte (dasselbe Tier wie in A). C. IR-DIC (oben) und epifluoresent (untere) Bilder der Schicht III neokortikalen Pyramidenzellen in organotypischen Kultur (P10 Tier, 3 Tagen in Kultur). Note "bullet" sichtbar in DIC-Bild (schwarze Kugel). D. Fluoreszenzbild von mehreren Schicht V Neuronen nach biolistischen Transfektion mit cDNA für GFP.

Abbildung 2. Aufnahmen vom Neokortex Pyramidenzellen in organotypischen Kultur. A. Aktionspotential in Schicht III Pyramidenzellen (von P10 Tier, nach 3 Tagen in Kultur) als Antwort auf überschwellige 10 ms Stromeinspeisung. B. Repetitive Feuern aus einer anderen Schicht V pyramidalen Neuronen (P10 Ratte, 3 Tage in Kultur) in Reaktion auf ein 2 s, 400 pA Stromeinspeisung. Dies war eine regelmäßige spiking Neurons. C. Voltage-Clamp-Datensatz aus einer anderen Schicht V pyramidalen Neuronen (P10 Ratte, 3 Tage in Kultur). 1 uM TTX war anwesend, um spannungsgesteuerte Na ^+-Strom zu blockieren. Outward, K ^+-Ströme in Reaktion auf eine Familie von 500 ms Spannung Schritte aus einem Betrieb Potential von -70 mV (Protokoll rechts). Spannungen wurden für eine +10 mV Flüssigkeitsverbindung Potenzial korrigiert. Zugang Widerstand ~ 9 MOhm. Keine Entschädigung für Vorwiderstand oder Membran Kapazität eingesetzt wurde.

Tabelle 1. Ähnliche elektrischen Eigenschaften von Kontrolle vs GFP-transfizierten Pyramidenzellen (Scheiben von p10 Ratte; organotypischen: 3-4 Tage in vitro). Mittelwert + Standardfehler des Mittelwerts (Anzahl der Zellen). RMP = Ruhemembranpotential, Rn = Eingangswiderstand, AP = Aktionspotential; Vth = Spannungsschwelle für AP; HW = AP Halbwertsbreite Amplitude.

Behandlung	RMP (mV)	Rn (MQ)	AP Amplitude	Vth (mV)	HW (ms)
Kontrolle	-72 ± 1 (21)	119 ± 17 (11)	84 ± 2 (24)	-45 ± 1 (21)	1,7 ± 0,1 (19)
GFP nur	-77 ± 1 (9)	123 ± 7 (5)	87 ± 2 (24)	-45 ± 2 (9)	2,1 ± 0,2 (7)

Tabelle 2. Commercial Media. Diese Medien sind gekauft und unverändert verwendet (Ihre Kompositionen sind on-line vom Hersteller).

^1. Waschen Media: MEM (GIBCO # 12360)
Kultur, Medien: 20 mL HMEM ¹ (Lonza Biowhittaker), + 10 mL HBSS1 (Gibco, 24020-117) + 10 ml Pferd serum1 (Hyclone # SH 30.074,03)

Tabelle 3. Solutions (Konzentrationen in mM).

Cutting-Lösung: 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl _{2, 2} MgCl 2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 20 Glukose (pH 7,4, 310 mOsm / L).
Künstliche Liquor aCSF (externe Aufzeichnung): 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl _{2, 2} MgCl 2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 20 Glukose (pH 7,4, 310 mOsm / L).
Internal Recording (Current-Clamp): 130,5 KMeSO4, 10 KCl, 7,5 NaCl, 2 MgCl _2, 10 HEPES, 2 ATP, 0,2 GTP, 0,1 EGTA (pH 7,2, 285-295 mOsm / L).
Internal Recording (Voltage-Clamp): 55 KMeSO _4, 55 KOH, ₂ MgCl 2, 20 HEPES, 6 Kreatinphosphat, 4 ATP, 0,5 GTP, 10 BAPTA, 0,1 Leupeptin (pH 7,2, 285-295 mOsm / L).

Discussion

Wir haben die Untersuchung der Expression und funktionelle Rolle von spannungsabhängigen Kaliumkanälen in pyramidalen Neuronen von Ratten Neokortex (4, 9-11). Wegen des Fehlens von spezifischen pharmakologischen Wirkstoffen für diese Kanäle, verwenden wir einen genetischen Ansatz zur Manipulation Kanal Ausdruck (1,14,15,17-19). Wir verwenden eine organotypischen Kultur Vorbereitung (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Aus dem Ansatz der Stoppini et al (16) modifiziert, um Zellmorphologie und der laminaren Muster der Hirnrinde zu halten. Wir isolieren akuten neokortikalen Scheiben am postnatalen Tag 6-17 und pflegen die Scheiben in der Kultur für 2-7 Tage. Dies erlaubt uns, ähnlich wie im Alter von Neuronen zu den in unserer Arbeit mit akuter Scheiben Studie und minimiert die Entwicklung von üppigen exzitatorischen Verbindungen in die Scheibe. Wir erfassen von visuell identifiziert Pyramidenneuronen in den Schichten II / III oder V mit Infrarot-Beleuchtung (IR-) und Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (DIC) mit ganzen Zelle Patch-Clamp-in Strom-oder Spannungs-Klemme. Biolistic (Gene gun) Transfektion von Wildtyp-oder mutierte Kaliumkanal DNA verwendet wird, um die Expression der Kanäle zu manipulieren, um ihre Funktion (1,14,15,17) zu studieren. Durch Co-Transfektion mit cDNA für GFP, werden die transfizierten Zellen leicht unter Epifluoreszenzmikroskopie identifiziert. Wir vergleichen Aufnahmen von transfizierten Zellen zu benachbarten, nicht transfizierten Neuronen in der gleichen Schicht aus dem gleichen Stück (1,17).

Keines der Verfahren abgedeckt sind hier jedoch schwierig, ein paar Details Aufmerksamkeit erheblich verbessern kann die Ergebnisse. In unseren Händen, ist die Lebensfähigkeit der Zellen am besten, wenn Kulturen aus Scheiben von ~ P8-P10 Tieren vorgenommen werden. Es ist wichtig, semi-sterile Bedingungen beim Schneiden und Kultivierung von Scheiben zu erhalten. Um zu verhindern, bakterielle Kontamination, Autoklaven wir die Instrumente und reinigen Sie den OP-Bereich mit UV-Licht und EtOH-, Filter-Lösungen, Handschuhe, und die Handschuhe wechseln, zwischen der Entnahme des Gehirns und macht Scheiben schneiden. Die Folgen einer bakteriellen Kontamination sind schlechte Gewebe Lebensfähigkeit und die Notwendigkeit, die Inkubatoren zu dekontaminieren. Wie bei allen Hirnschnitten, ist die Lebensfähigkeit durch Minimierung der Zeit zwischen Opfer des Tieres und das Schneiden verbessert. Das Gehirn sollten so aufgestellt und Schneiden sollte mit dem Gehirn in einen eiskalten Schlamm des Cutting-Lösung getaucht erfolgen. Scheiben mit langsamer Geschwindigkeit, mit geringer Amplitude horizontale Schwingung der Klinge.

Ein weiteres mögliches Problem ist ein Austrocknen der Scheiben, während in den Inkubator. Beschränkt auf die Hirnrinde von Interesse und ein kleines Stück Striatum (zur Orientierung): Die Trocknung kann durch die Vorbereitung Scheiben, die klein sind, minimiert werden. Große Scheiben neigen zum Austrocknen in den Brutkasten, und es ist schwieriger, stabile Aufnahmebedingungen mit großen Scheiben zu erhalten. Scheiben sind bei 250-300 um dick geschnitten. Wir finden, dass dünnere Schichten (wir bevorzugen 250 pm) führen zu weniger Trocknung. Bei der Übertragung von Scheiben aus dem Schneiden-Lösung in den Inkubator, waschen wir Scheiben mehrmals, zuerst in Wash Medien und dann in Kultur, Medien. Es ist wichtig, um überschüssige Flüssigkeit nach Übertragung auf die Membran (damit Scheibe auf das Netz legen) zu entfernen. Für dickere Scheiben schneiden (zB 300 Mikrometer), einen einzigen Tropfen Kultur Medien auf der Scheibe ging (während es auf der Membran sitzt) hilft zu verhindern, Trocknen. Dieses Verfahren scheint die Bewegung der feuchten Medien auf die Oberseite der Scheibe Primzahl. Austausch der Kultur Medien jeden zweiten Tag auch verhindert das Austrocknen und fördert die Lebensfähigkeit.

Materials

Surgery / transfection / culture: Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413) disposable supplies for Helios from Bio-Rad: 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264 Tefzel Tubing: #165-2441 Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766). Media: Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321) HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525) Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132. Recording: Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949 Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 lectrode position is controlled with Sutter R–-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North R–ske Avenue, Michigan City, IN 46360).