Summary
이것은 피라미드 뉴런에서 전기 레코딩을 만드는 목적 organotypic 문화 neocortical 슬라이스 준비를 준비하고 유지하는 프로토콜입니다.
Abstract
우리는 쥐 네크로 텍스의 피라미드 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널의 표현과 기능적 역할을 공부했습니다. 때문에이 채널에 대한 특정 약리 대리인의 부족, 우리는 채널 표현을 조작하는 유전자 접근 방식을 촬영했습니다. 우리는 세포 형태학 및 피질의 판상 패턴을 유지하기 위해 organotypic 문화 준비 (16)를 사용합니다. 우리는 일반적으로 출생 후의 일 8-10에서 급성 neocortical 조각을 분리하고 3~7일에 대한 문화의 슬라이스를 유지합니다. 이것은 우리가 급성 슬라이스와 함께 우리의 일을 사람들에게 비슷한 나이에 신경을 공부 수 있으며 통에 풍부한 흥분성의 연결의 개발을 최소화합니다. 우리는 전류 또는 전압 클램프의 전체 세포 패치 클램프와 함께 적외선 조명 (IR -)와 차동 간섭 대비 현미경 (DIC)를 사용하여 레이어 II / III 또는 V에서 시각 식별 피라미드 뉴런에서 기록합니다. 우리는 그들의 기능을 연구하기 위해 채널의 표현을 조작하는 야생 형식이나 돌연변이 칼륨 채널의 DNA biolistic (진 총) transfection을 사용합니다. transfected 세포는 쉽게 녹색 형광 단백질 (GFP)의 cDNA와 함께 공동 transfection 후 epifluorescence 현미경으로 식별됩니다. 우리는 동일한 슬라이스에서 동일한 레이어에 인접해 untransfected 뉴런에 transfected 세포의 음반을 비교합니다.
Protocol
1. 칼자국의 하루 전에 준비
우리는 수술 악기 압력솥 사전 깔끔히의 하루 솔루션을 준비하는보다 효율적입니다 찾습니다.
- 압력솥 악기. (수술과 깔끔히가 반 무균 조건 하에서 수행됩니다.) 개별적 압력솥 종이에 싼 다음과 같은 패키지를 압력솥 :
- 수술 패키지 주걱, # 22 메스 블레이드 핸들, 가위, 집게
- 깔끔히 패키지 : 3 단자 (블레이드 잡고 손잡이와 2 개의 목욕탕 - 확보 단자) 및 블레이드 경비 (기계에서 면도날 보유 : 캠덴 Vibroslice # MA572)를 (가 냉동실에 넣어되기 때문에), 개별적으로 포장 습관 (금속 챔버했다 슬라 이서 (하나는 반복 autoclaving을 견딜 수 없을 것이다 제조 업체의 플렉시 글라스), hemostat, 가위, 집게에 대한 표본 목욕).
- 유리 패키지 두 개의 50 ML 비커 한 25 ML의 비커
- 나누어지는 말 혈청 (Hyclone 기증자 에콰인 # SH 30074 : Thermoscientic). 나누어지는 ~ 15 ML 원뿔 튜브에 말 혈청 11 ML. (10mL 혈청이 필요합니다. 거품이 혈청을 해동하면, 당신이 필요한 10 ML을 대기음하는 11 ML 필요 형성하기 때문에). 저장소가 -20 ° C의 냉동고에 혈청 aliquoted.
- 나누어지는 미디어. 미디어 병이 열린 후, 그들은 ~ 4 주 (산도의 변화로 인한)에 대해서만 안정됩니다. 자른 신선한 미디어와 함께 더 나은 생존.
- 우리는 상업적으로 사용 가능한 미디어 (500 ML 병에서 구입한), 플러스 말 혈청의 세 가지 유형을 사용합니다. 미디어는 다음과 같습니다 HMEM (Lonza Biowhittaker 최소 필수 미디어 플러스 HBSS와 HEPES, 아니 글루타민 : 카탈로그 # 12 - 137F), HBSS (GIBCO 행크스가 생리 # 24020-117를 버퍼) 및 멤 (GIBCO 최소한의 필수적인 매체, # 12360 - 038). 표 2를 참조하십시오.
- 미디어 (HMEM, HBSS, 그리고 멤)의 세 가지 유형 각각에 대해, 나누어지는 ~ 네 50 ML 원뿔 튜브의 각으로 미디어의 500 ML 병 50 ML. aliquoting 후 Parafilm 모든 튜브. 냉장고에 보관 멤 및 저장 HMEM 및 실온에서 HBSS.
- 문화 미디어는 말 묘약, HMEM 및 HBSS (아래 참조, 표 2)의 혼합물로 구성되어 있습니다. 멤는 세척 미디어로 사용됩니다.
- (표 3) 솔루션을 절단합니다. NaCl 125, KCl 3, 아니 2 PO 4 1.25, NaHCO 3 26, 2 MM CaCl 2, 2 MM MgCl 2, 20 MM 포도당 : 절단 솔루션은 (MM)를 구성되어있다. 우리는 일반적으로 250 ML을 (용적 플라스크에 볼륨을 가지고)합니다. osmolality을 확인 (~ 310되어야합니다)와 PH (7.2-7.3).
후속 단계 (# 2와 # 3) 깔끔히 당일 수행됩니다.
2. 외과, 칼자국, 그리고 Organotypic 문화
다른 모든 절차 대 별도의 위치에 수술을하는 것이 중요합니다. 우리는 두뇌의 제거를위한 수술을 진공 (펌) 후드를 사용합니다. 층류 후드는 그러한 깔끔히과 조각과 솔루션의 조작으로 세미 - 무균 조건 하에서 수행 절차에 사용됩니다.
- 솔루션을 준비합니다. (해결책이 나중 단계에서 필터링하므로 이러한 절차는 무균 조건 하에서 수행 필요가 없다.).
- 절단 솔루션 (표 3)을 준비합니다. 95 % 혼합 O 최소한 20 분 (산도를 안정화 모든 소금이 솔루션에 있는지 확인) 2 / 5% CO 2와 버블 솔루션입니다. 1 ㎜ Pyruvic의 산성 (대사 억제제) and0.6 MM 아스코 브 (항산화)를 추가합니다.
- 말 혈청 해동 한 나누어지는 (11 ML).
- (EtOH 장갑을 포화, 모든 절차 장갑을 착용) 층류 후드를 준비합니다. 이 섹션에서는, 우리는 작업 지역 깨끗하고, 세미 무균 작업 공간을 제공하기 위해 준비합니다. 우리는 또한 그들을 소독하기 위해 솔루션을 필터링합니다.
- 층류 후드 내에서 작업 공간을 소독하기 ~ 1 시간 동안 자외선을 사용하여 (우리가 깔끔히 사용 theCampden Vibroslice을 커버하므로 자외선은 플라스틱 부품을 손상시킬 수 아래 참조). (EtOH가 손상됩니다 슬라이의 플라스틱 손잡이 제외) 70% EtOH 모든 표면을 청소하십시오. 층류 후드 아래에 또한 일반적으로 현재 95% O 2 / 5% CO 2 및 100 O 2에 연결된 pipetter과 pipets, EtOH 병, 접착제 및 튜빙 있습니다.
- 층류 흐름 후드 아래에있는 다음 장소 :
- Autoclaved 깔끔히 패키지
- 250 ML 커팅 솔루션
- Millipore 익스프레스 플러스 필터 : 250 ML [0.2 μm의 필터 (# SC6PU02RE) 절단 솔루션 필터] :
- 문화 미디어 구성 요소 :
- 20 ML HMEM
- 10 ML HBSS
- 10 ML 말 혈청
- 유리 패키지 autoclaved 비커
- 멤 세척 미디어 50 ML
- Pipetter (드루먼드pipet - 에이드)
- 세븐 플라스틱 전송 pipettes (피셔 # 13-711-20). 솔루션과 미디어 버블링 위해, 이들은 조각 및 솔루션뿐만 아니라 가스 솔루션을위한 도관 역할을하는 (95% O 2 / 5% CO 2 O 2)를 전송하는 데 사용됩니다.
- Cyanoacrylate 접착제
- 면도날이나 가위 (플라스틱자를 위해).
- 무균 # 22 메스 블레이드
- Millicell의 세포 배양 삽입 (0.4 μm의 30 μm의 직경, # PICM 03,050) 각 6 - 잘 플레이트 3 인서트
- 6 - 잘 문화 플레이트 (S) (코닝 : 코스타 # 3516)
- 250 ML Millipore 필터 (위 참조)를 사용하여 준비 250 ML 커팅 솔루션을 필터링합니다.
50 ML의 비커에 솔루션을 절단의 나누어지는 40 ML. 솔루션 및 냉동실에 절단 솔루션을 나머지 210 ML (-20 ° C)를 절단의 40 ML의 나누어지는를 놓습니다. 목표는 ~ 4 ° C 두개골 (비커 40 ML)에서 제거 후 두뇌를 수신 및 절단 (210 ML)에 대한 눈녹은 혼합물 이러한 솔루션을 사용하는 것입니다. - -20 ° C 냉장고에 넣어 금속 깔끔히 챔버 (압력솥 종이로 덮여). 이것은 깔끔히 동안 절단 솔루션 및 뇌 추위를 유지하는 데 도움이됩니다.
- 문화 미디어를 준비하고 웰스 (거품 문화 미디어 마세요 - 그것이 거품 것입니다)에 넣어.
- 50 ML 플라스틱 원심 분리기 튜브 40 ML 문화 미디어 준비 :
- 20 ML HMEM + 10 ML의 HBSS + 말 혈청 10 ML의 나누어지는 (표 2)를 혼합
- 50 ML Millipore steriflip 0.22 μm의 필터 (# SCGP00525)를 사용하여 필터 문화 미디어 (소독)을.
- 6 잘 판 3 대각선 간격 웰스 (코스타 # 3516 6 웰 문화 클러스터 코닝)에 플레이스 1.1 ML 문화 미디어. 37에 플레이스 6 - 잘 플레이트 / 문화 미디어 적어도 한 시간 동안 ° C 배양기.
- 50 ML 플라스틱 원심 분리기 튜브 40 ML 문화 미디어 준비 :
- 멸균 가위 또는 면도날로 전송 pipets의 4 (조각 전송에 사용) 단축. 컷 튜브 끝을는 버블링 솔루션을위한 가스를 해산하기 위해 더 이상 수정하지 않고 사용됩니다. 이러한 튜브는 95 % O 2 / 5% CO 2 또는 백퍼센트 솔루션 O 2의 탱크에서 라인을 연결합니다.
- 필터 와시 미디어 (50 ML) 50 ML Millipore steriflip 0.22 μm의 필터 (# SCGP00525)를 사용. 냉장고에 와시 미디어를 놓습니다.
- 수술 준비. 솔루션은 수술 후 뇌 (진공 후드)을 수락하고 깔끔히과 문화를위한 준비 (층류 후드) 빠른 수 있도록 준비를해야합니다. 우리는 진공 후드 아래에있는 수술을 수행합니다. 수술이 떨어져 반 멸균 층류 후드에서 머리카락과 체액을 유지하기 위해 별도의 영역에서 수행하는 것이 중요합니다.
- 미디어 솔루션을 준비합니다.
- 냉동고 40 ML 커팅 솔루션 50 ML의 비커를 제거하고 두개골에서 제거 후 두뇌를받을 진공 후드 아래에 넣어. 25 ML의 비커에이 차가운 절단 솔루션 ~ 10 ML 하거라. 이 층류 후드 두뇌를 전송하는 데 사용됩니다.
- 냉동실에서 210 ML 커팅 솔루션을 제거하고 (깔끔히 및 슬라이스 수집) 층류 후드 넣어.
- 냉동실에서 금속 깔끔히 챔버를 제거하고 층류 후드 아래에 넣어.
- 버블 두 95% O 5분의 2 %의 CO 2 (솔루션에 튜브를 연결하는 플라스틱 절단 전송 pipettes를 사용)와 솔루션을 절단.
- 진공 후드 아래에 다음과 같은 항목 (30 ML 커팅 솔루션은 이미 95% O 2 / 5% CO 2와 현재와 버블링입니다) 장소 :
- 25 ML의 비커를 autoclaved
- Autoclaved 수술 도구, 장갑, 집게
- (솔루션에 튜브를 연결하는 절단 플라스틱 전송 피펫의 끝을 사용) 100 % O 2 냉장고 거품에서 미디어를 씻어 제거합니다.
- 미디어 솔루션을 준비합니다.
- 수술 (진공 흐름 후드 아래에 수행). 이 단계는 깔끔히 이후에 대한 두뇌를 제거하기 위해 필요합니다. 동물을 희생하고 차가운, 산소 절단 솔루션에 머리를 배치 사이의 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 뇌로가는 충격을 최소화하는 것도 중요하다. 모든 절차는 동물 케어 및 사용위원회, 테네시 대학, 보건 과학 센터의 승인되었습니다.
- 우리는 P6 - P17 (우리가 P8 - P10를 선호)에서, 스프 라그 - 돌리 쥐를 사용합니다. 적용 2-4 L 플라스틱 컨테이너에 플레이스 쥐. 마취 들어, ~ 1 ML isofluorane는 (마취는 동물을 접촉하지 않도록) 플라스틱 메쉬 아래에있는 거즈의 일부에 적용됩니다. 동물 areflexive 때까지 isoflurane과 쥐를 마취. EtOH 장갑을 포화.
- 쥐가 anesthetized 후, 큰 메스로 동물을 참살하고, 두뇌를 제거합니다. 에 머리를 넣어감기의 30 ML를 포함하는 비커 (~ 4 ° C) ~ 30 초에 대한 커팅 솔루션입니다. 조심스럽게 머리가 층류 후드에 머리카락이나 혈액의 양도를 최소화 25 ML의 비커에 전송할 수 있습니다.
- 변경 장갑 (EtOH로 포화).
- 층류 후드에 차가운 커팅 솔루션에 전송 두뇌 (25 ML의 비커).
- 뇌를 슬라이스와 문화에 대한 준비를합니다. 이 단계에서, 우리는 동양 두뇌는 불필요한 뇌 조직을 제거하고 뇌 조각을 잘라 수집합니다. 우리는 다음 조각 씻어 메쉬 삽입의 각 슬라이스에 배치, 6 - 글쎄 문화 접시에있는 메쉬 삽입을 배치하고, 문화 인큐베이터에 접시를 (슬라이스)를 전송할 수 있습니다.
- 각 반구에서 하나 - -. 오리엔트 및 블록 두뇌 (소뇌와 전두엽 기둥을 제거, 이것은 두 조각의 동시 절단을 허용 부분 중순 sagital 컷 ~ 전두엽 피질 엔드에서 0.5 방법을했지만 여전히위한 꼬리 끝에 함께 두 hemsipheres 유지 무대에 접착제로 안정적인 기반). 접착제는 cyanoacrylate와 함께 무대에 머리를 차단했습니다. 전두엽 피질 위 frontoparietal의 피질의 코로나 조각 컷과 함께 플레이스 뇌. 로 슬라이스의 크기를 제한하는 데 필요한 추가 메스 삭감하십시오.
- 살균 금속 깔끔히 챔버 (진동 조직 슬라이에 첨부되어있는)로 두뇌와 무대 장소와 커팅 솔루션 버블링, 얼음 추위와 함께 목욕을 입력합니다. 95% O 2 / 5% CO 2 50 ML의 비커 (에 조각을 수집하기 위해)와 거품에 남아있는 절단 솔루션 ~ 30 ML 하거라.
- 진동 조직 슬라 이서 (세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, 미국 캠덴 Vibroslice # MA572)를 250-300 μm의 조각을 잘라. 30 ML 커팅 솔루션을 포함 비커에 플레이스 슬라이스. 당신은 문화 (일반적으로 3-6)하고자하는 조각의 개수, 플러스 몇 가지 추가를 수집합니다.
- 35mm 플라스틱 페트리 접시에 넣어 ~ 2 ML 와시 미디어 : 조각 씻으십시오. 커팅 솔루션에서 씻으 미디어와 플라스틱 페트리 접시에 모든 조각 전송합니다. 신선한 와시 미디어 때마다을 사용하여 슬라이스에게 3 번 씻으십시오. , 조각 전송 미디어를 추가하고, 폐기물 솔루션을 대기음 별도의 전송 pipettes를 사용하십시오.
- 문화 미디어 (; 새로운 전송 피펫 다른 35mm 플라스틱 페트리 접시에)에 조각 전송합니다. 메쉬 삽입을위한 포장에서 상판을 제거하지만, 포장에 삽입 두십시오.
- 삽입 (그림 1A)의 중간에 위치 조각 : 문화 미디어에서 메쉬 삽입 (cuttransfer 피펫과)로 전송 슬라이스. 문화 미디어의 작은 비트 슬라이스와 함께 올 것이다. 손상 전송 피펫을 사용하여 바로 삽입에 대한 슬라이스를 배치 후 여분의 문화 미디어를 제거합니다. (이 biolistic transfection을 용이하게하고 쉽게 나중에 기록에 대한 슬라이스를 제거합니다)를 삽입 중심의 슬라이스 위치를보십시오.
- 6 잘 플레이트 문화 미디어의 메쉬 삽입 / 슬라이스 (그림 1B) 플레이스. mesh.When 세 삽입 / 슬라이스 아래에 공기 거품의 형성을 방지하기 위해주의 6 자 판, 장소 인큐베이터에서 6 - 웰 플레이트 뒤쪽에 있습니다. ~ 1 시간 동안 37 ° C 배양기에서 조각 품어.
- 진 건을 사용하여 Transfect 슬라이스 (바이오 래드는 헬리 우스). 이것은 6 - 잘 판에 깔끔히 및 메쉬에 배치 후 즉시 할 수 있습니다, 그러나 우리는 일반적으로 37에서 1 시간 동안 품어 ° C의 조각 안정화 후 세포를 transfect 수 있습니다. cDNA "총알"을 만들고 유전자 총을 사용에 대한 자세한 프로토콜, 심판을 참조하십시오. 17-22.
- "총알"을 포함하는 플라스틱 "cartidges"을로드합니다. (우리는 글머리 기호로 cDNA - 코팅 금 입자를 참조하십시오. 따라서, 많은 총알이 플라스틱 "카트리지"에 포함되어 있습니다.). 첫 번째 위치 무료 (아니오 "카트리지") 둡니다. 카트리지 cDNA - 코팅 총알을 포함하는과 다른 모든 위치를로드합니다. 유전자 총에 넣어 카트리지 홀더.
- 없이 카트리지와 배럴을 발사하여 지우기 총.
- 카트리지와 함께 한 통을 사전. 층류 후드 아래의 보육과 장소에서 6 잘 플레이트를 제거합니다. 단지 6 - 잘 접시의 맨 위에 총을 들고. 수직 만요. ~ 100 PSI에 쏴.
- 사전 배럴, 분명히 반복한다. 한 조각 당 쐈어.
- 촬영 후, 인큐베이터에 슬라이스 / 삽입과 함께 6 자 번호판을 반환합니다.
- 문화 슬라이스 (세미 - 무균 조건 하에서). 조각, 6 - 잘 접시의 모든 조작은 EtOH로 영역을 청소 후 EtOH과 층류 후드 아래에 포화 장갑을 착용하여야한다. 우리 문화가 다양한 기간 (일반적으로 2-7일)의 조각은 급성 깔끔히 절차에서 회복을 허용하고 새로운 단백질로 이어질 transfection 시간을 허용합니다.
- 2-7일을위한 문화 (37 ° C 5 % CO 2) 보육의 (견적 과학 모델 # 3110).
- 매일 미디어를 교체 : 최소 1 시간 동안 인큐베이터에서 교체, 세 빈 우물에 새로운 미디어를 추가합니다. EtOH - 청소 곡선 포셉 새로운 잘하는 슬라이스 / 멤브레인 이동합니다. 기음올드 미디어. 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다.
3. 조각의 피라미드 세포의 기록
그것은 전체 세포 녹음 기술에 대한 자세한 지침을 제공하기 위해이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 우리는 녹화 실로 조각을 전송 및 녹음의 세부 정보를 제공하는 방법에 대한 정보를 제공 관련된 녹음에 대한 transfected 세포를 식별하기 위해 특히, 셋업.
- 우리는 셔터 P - 87 수평 풀러를 사용하는 하버드 GC150TF - 10 유리에서 전극을 가져옵니다. 전극은 세포 솔루션 MΩ 2-6아르. 전극은 KMeSO 4 내부 (표 3 참조)로 가득합니다.
- 장갑을 착용한다. 인큐베이터에서 6 - 잘 플레이트를 제거합니다. 층류 후드에서 신중하게 EtOH - 청소, 곡선 포셉 한 슬라이스 / 메쉬 삽입을 제거합니다. 인큐베이터에서 6 - 잘 플레이트를 교체하고 녹음 영역에서 기록하는 슬라이스를 전송합니다. 우리의 경우 이것은 다른 실험실에 있습니다. 우리는 대상 35mm 플라스틱 페트리 접시에 삽입 / 슬라이스를 수행합니다. 이 단계 후에, 장갑 (문화 또는 배양기를 오염없이 가능성) 착용 필요가 없습니다.
- # 11 메스와 멤브레인 버려야. 포셉 또는 유연한 금속 막대에서 제공하는 긴장에 대한 잘라. (이것은 가위로 최종 인하를 완료해야 할 수 있습니다.) 포셉를 사용하여, 올림푸스 BX50 WI 똑바로 현미경의 무대에서 기록 챔버에 연결된 메쉬와 슬라이스를 전송합니다.
- 우리는 PClamp 10 액슨 악기 Multiclamp 700B 증폭기 및 데이터 수집 프로토콜을 사용합니다. 전극 위치는 셔터 교전 - 200 manipulators와 PC - 200 컨트롤러와 제어됩니다. 우리는 시각화에 대한 하나의 IR에 민감한 카메라 (올림푸스 OLY - 150 또는 DAGE - MTI) 및 ProVideo 1201B 모니터를 사용하여 레이어 II / III 또는 V.의 피라미드 뉴런을 시각화하기 위해 IR - DIC 광학과 올림푸스 BX - 50WI 똑바로 현미경을 사용하여 슬라이스에있는 세포. 33 ± 1 ° C.에 2-3 ML / 분 제공 : 조각은 인공 뇌척수 (표 3 aCSF)를 carbogenated 목욕 아르
일반적으로, 우리는 슬라이스마다 10-50 transfected 세포를 찾으십시오. 세포 lookingthrough 현미경의 접안 렌즈를하고 FITC 필터 (목표 상기와 현미경의 접안 렌즈 아래에있는 포탑 탑재에 필터 휠을 장착)와 epifluorescence을 사용하여 위치하고 있습니다. 이것은 우리가 쉽게 휴대가 (세포 epifluorescence 아래에 녹색 표시와 총알을 포함) transfected 즉, 셀 유형을 결정하기 위해 IR - DIC와 epifluorescence 전환할 수 있으며, 세포는 (세포가 3 차원이며 부드러운 표면을 가지고 건강입니다 , 핵 부풀어 오르지도 않은, 셀) 부었거나 주름진하지 않습니다.
우리는 레이어 II / III 또는 V의 피라미드 뉴런을 (그림 1 참조) 대상. 피라미드 세포 계층을 향해 난, 많은 돌기 쪽이, 그리고 배 모양의 소마 오름차순 혀끝의 dendrite의 존재에 의해 식별됩니다. 레이어는 피아에 비해 세포 밀도와 위치에 의해 결정됩니다. 슬라이스의 표면에 일반적으로 transfected 세포가 건강하지 않습니다. 그것이 급성 슬라이스보다 organotypic 슬라이스 내의 깊은 세포를 시각화하는 것이 더 어려울 수 있지만, 우리는 일반적으로 슬라이스의 표면 아래에 20-50 μm의에서 건강 transfected 세포를 시각화 수 있습니다. 우리는 표준 셀 전체를 기록 방법을 사용합니다. 우리는 시각적인지도 아래와 전압 클램프에 긍정적인 압력으로 전지에 접근한다. 물개는 전압 클램프 아래에 부드러운 흡입 (1 ML의 주사기를 사용)를 취득하고 있습니다. GΩ의 인감 달성되면, 추가적인 흡입은 세포에 침입에 적용됩니다. 우리는 다음 중 전류 또는 전압 클램프의 레코딩을 수행합니다.
녹음의 끝에서 우리가 기록된 세포가 녹색으로되어 있는지 확인합니다, 총알을 포함하고, 가시 부정적 또는 긍정적인 압력에 응답합니다. 슬라이스, 휴대 레이어, 수술 당시 연령, 문화 시간 사이의 편차에 대한 제어하기 위해, 우리는 항상 같은 레이어에서 untransfected 제어 세포에서 레코딩과 transfected 세포의 녹음 쌍을와 transfected 세포의 50 μm의와 함께 위치하고 있습니다.
4. 대표 결과 :
그림 1A는 culturing을위한 6 자 플레이트에 삽입을위한 멤브레인에 앉아 심하게 준비 슬라이스를 보여줍니다. 이 슬라이스는 펍 P10 랫에서 모터와 somatosensory 피질을 포함합니다. 피아는 왼쪽에있는 흰색 물질과 striatum과 그림의 오른쪽에 있습니다. 그림 1B는 ~ 1.1 ML 문화 미디어에 포장되어 슬라이스 / 우물에 멤브레인를 보여줍니다. organotypic 문화 우리의 목표는 피질의 정상적인 판상 패턴을 유지하는 것입니다, 문화 중에 건조 표면을 방지하고, 궁극적에서 기록할 수 문화 며칠 후 슬라이스에 살고 세포의 높은 비율을 생산하는 (세포 또는 주름진하지 부풀어, 최소한 부어 세포 핵, IR - DIC 광학에있는 세포의 반짝하고 입체 모양). 그림 1C는 3 일 후에 somatosensory 피질의 organotypic 통에 레이어 III 피라미드 신경 세포의 IR - DIC와 epifluorescence 이미지를 보여줍니다문화 (P10 동물에서). 그림 1D는 GFP (녹색 세포)의 cDNA와 transfected 여러 계층 V 세포를 보여주는, 다른 슬라이스의 epifluorescence 이미지입니다.
그림 2는 3 일 (P10 동물)에 대한 organotypic 슬라이스 문화 후 레이어 V 피라미드 세포에서 전류 및 전압 - 클램프 녹음을 대표하는 흔적을 보여줍니다. 그림 2A는 overshooting 작업의 가능성 (AP)를 보여줍니다. 그림 2B는 2 S 400 PA 정전류 주사에 대한 응답으로 반복 발사를 보여줍니다. 이러한 흔적은 일반 급상승 레이어 V 신경 세포의 정상적인 electrophysiological 속성을 (표 1 참고)을 나타냅니다. 그림 1C 전압 - 문이 나 + 전류를 차단하는 1 μm의의 테트로도톡신 (TTX)의 존재에있는 레이어 V 피라미드의 신경 세포에서 전압 클램프 녹음입니다. 흔적이 -70 뮤직 비디오의 개최 가능성에서 -90 뮤직 비디오와 70 MV (단계 사이의 10 뮤직 비디오에서) 사이의 다양한 잠재력 500 MS 전압 단계에 대한 응답으로 전류의 가족입니다.
그림 1. Organotypic 슬라이스 문화. A. Millicell 필터 메쉬 삽입에 P10 랫에서 쥐 sensorimotor 피질의 조각. 피아는 오른쪽, 깊은 백색 물질과 왼쪽으로 striatum하는 것입니다. 정중선은 상단 모서리에 있습니다. B. 세 조각과 메쉬 삽입 ~ 1 ML 문화 미디어에 빠져들하고 (A에서와 같은 동물) 6 - 잘 접시의 인접하지 않은 우물에 위치. C. IR - DIC (상단)와 (로우어) organotypic 문화에 레이어 III neocortical 피라미드 세포 (P10 동물, 문화의 3 일간)의 이미지를 epifluoresent. DIC 이미지 (검은 영역)에 표시 "총알"을 참고. GFP에 대한 cDNA와 biolistic transfection 후 여러 층의 뉴런의 V D. 형광 이미지.
그림 2. organotypic 슬라이스 문화에 neocortical 피라미드 세포에서 녹음. A. suprathreshold 10 MS 전류 주입에 대한 응답으로 레이어 III 피라미드 세포의 동작 가능성 (P10 동물에서, 문화, 3 일 후에). 2 S 400 PA 전류 주입에 대한 응답으로 다른, 레이어 V 피라미드 신경 세포 (P10 밀고, 문화의 3 일간)에서 B. 반복 발사. 이것은 일반적인 신경 세포 급상승했다. 다른 레이어 V 피라미드 신경 세포 (P10 밀고, 문화의 3 일간)에서 C. 전압 클램프 기록합니다. 1 μm의의 TTX 전압 - 문이 나 + 전류를 차단하는 제시했다. 외부, K + -70 MV (프로토콜 오른쪽)의 개최 가능성에서 500 MS 전압 단계의 가족에 대한 응답으로 전류. 전압은 10 MV 액체 연결 가능성에 대한 해결되었습니다. 액세스 저항 MΩ 9 ~했습니다. 직렬 저항이나 막 커패시턴스에 대한 보상은 채용되지 않았습니다.
표 1. 제어 대 GFP - transfected 피라미드 세포 (; : 체외에서 3~4일 organotypic 슬라이스 P10 랫에서 조각)의 비슷한 전기적 특성. 평균 + 평균의 표준 오차를 (세포의 숫자). RMP = 쉬고 막 잠재력, RN = 입력 저항, AP = 액션 가능성, AP에 대한 Vth = 전압 임계값, 이분의 일 진폭에서 HW = AP 폭.
| 치료 | RMP (MV) | RN (MΩ) | AP 진폭 | Vth (MV) | HW (MS) |
| 제어 | -72 ± 1 (21) | 119 ± 17 (11) | 84 ± 2 (24) | -45 ± 1 (21) | 1.7 ± 0.1 (19) |
| 단 GFP | -77 ± 1 (9) | 123 ± 7 (5) | 87 ± 2 (24) | -45 ± 2 (9) | 2.1 ± 0.2 (7) |
표 2. 상업 미디어. 이러한 미디어는 (그들의 작곡은 제조 업체에서 온라인 가능) 수정되지 않은 구입하는 데 사용됩니다.
1 와시 미디어 : 멤 (GIBCO # 12360)
문화 미디어 : 20 ML HMEM 1 (Lonza Biowhittaker) + 10 ML HBSS1 (Gibco, 24020-117) + 10 ML 호스 serum1 (Hyclone # SH 30074.03)
표 3. 솔루션 (㎜의 농도).
125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1.25 아니 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 20, 포도당 (산도 7.4, 310 MOsm / L) 솔루션을 커팅.
인공 중추 신경계 aCSF (외부 녹음) : 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1.25 아니 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 20, 포도당 (산도 7.4, 310 MOsm / L).
내부 녹음 (전류 클램프) : 130.5 KMeSO4, 10 KCl, 7.5 NaCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 ATP, GTP 0.2, 0.1 EGTA (산도 7.2, 285-295 mOsm / L).
내부 녹음 (전압 클램프) : 55 KMeSO 4, 55 코, 2 MgCl 2, 20 HEPES, 6 크레아틴 인산, 4 ATP, 0.5 GTP, 10 BAPTA, 0.1 류펩틴 (산도 7.2, 285-295 mOsm / L).
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Discussion
우리는 쥐를 네크로 텍스 (4, 9-11)에서 피라미드 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널의 표현과 기능적 역할을 공부했습니다. 때문에이 채널에 대한 특정 약리 대리인의 부족, 우리는 채널 표현 (1,14,15,17-19)를 조작을위한 유전자 접근 방법을 사용합니다. 세포 형태학 및 피질의 판상 패턴을 유지하기 위해 Stoppini 외 (16)의 접근에서 수정. 우리는 organotypic 문화 준비 (12,13,15-22,, 5-8 2,3) 활용. 우리는 6-17 출생 후의 일에서 급성 neocortical 조각을 분리하고 2~7일에 대한 문화의 슬라이스를 유지합니다. 이것은 우리가 급성 조각과 함께 작품에 비슷한 세 뉴런을 연구 수 있으며 통에 풍부한 흥분성의 연결의 개발을 최소화합니다. 우리는 적외선 조명 (IR -)과 전류 또는 전압 클램프의 전체 세포 패치 클램프 차등 간섭 대비 현미경 (DIC)를 사용하여 레이어 II / III 또는 V에서 시각 식별 피라미드 뉴런에서 기록합니다. 야생 입력하거나 돌연변이 칼륨 채널의 DNA Biolistic (유전자 총을) transfection들은 기능 (1,14,15,17)를 연구하기 위해 채널의 표현을 조작하는 데 사용됩니다. GFP에 대한 cDNA와 함께 공동 transfection으로 transfected 세포는 쉽게 epifluorescence 현미경 아래에서 확인할 수 있습니다. 우리는 동일한 슬라이스 (1,17)에서 동일한 레이어에 인접해 untransfected 뉴런에 transfected 세포의 음반을 비교합니다.
여기서 다루지 절차 중 누구도 어려운없는, 그러나 크게 결과를 향상시킬 수있는 몇 가지 세부 사항에주의. 우리 손에, 세포 생존 능력은 문화가 ~ P8 - P10 동물에서 슬라이스로 만들어진 때 가장 좋습니다. 깔끔히과 조각의 culturing 동안 반 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 박테리아 오염을 방지하기 위해, 우리는 악기를 압력솥과 자외선 및 EtOH, 필터 솔루션, 착용 장갑, 그리고 두뇌의 제거 및 제작 조각 사이의 변경 장갑으로 외과 영역을 청소하십시오. 세균 오염의 결과는 가난한 조직 생존과 incubators을 오염을 제거하다하는 필요성을 포함합니다. 모든 두뇌 슬라이스와 마찬가지로 생존은 동물의 희생 사이의 시간을 최소화하고 깔끔히에 의해 향상됩니다. 두뇌가 배치되어야하며 깔끔히는 절단 솔루션의 얼음 차가운 슬러리에 빠져들 두뇌로 할 수 있습니다. 블레이드의 낮은 진폭 수평 진동과 느린 속도로 슬라이스.
또 다른 잠재적인 문제는 인큐베이터에있는 동안 조각 밖으로 건조합니다. 관심과 striatum의 작은 조각 (오리 엔테이션 목적)의 피질로 제한 : 건조는 작은 조각을 준비하여 최소화하실 수 있습니다. 대형 조각은 인큐베이터에서 건조하는 경향이 있으며 대형 조각과 함께 안정적인 촬영 조건을 얻기 어렵습니다. 슬라이스는 250-300 μm의 두께로 절단됩니다. 우리가 찾은 얇은 조각 (우리가 250 μm의를 선호) 덜 건조의 결과. 인큐베이터로 절단 솔루션에서 조각을 전송할 때, 우리는 문화 미디어 다음 씻으 미디어에 처음 조각 여러 번 씻어합니다. 멤브레인 (슬라이스가 메쉬에 첨부할 수 있도록)으로 환승 후 과잉 액체를 제거하는 것이 중요합니다. 들어 두꺼운 슬라이스 (예, 300 μm의), 미디어의 조각 위에 진행 문화의 한 방울이 (가 막에 앉아있는 동안) 건조를 방지하는 데 도움이됩니다. 이 절차는 조각의 상단 표면에 촉촉한 미디어의 움직임을 주요 나타납니다. 매일 문화 미디어 교체하면 건조를 방지하고 생존을 촉진합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 뛰어난 기술 지원을 마유미 Sakuraba과 레베카 Foehring 감사하고 싶습니다. 또한, 우리는 DRS 감사하고 싶습니다. transfection에 대한 cDNA 구성으로 우리를 제공할 organotypic 슬라이스 문화와 biolistic transfection 프로토콜 및 박사 진 Nerbonne 구현에 도움을 로드리고 안드레 이드. NINDS (RCF)를에서 NS044163 :이 작품은 NIH 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
Surgery / transfection / culture:
Media:
Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132. Recording:
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References
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