Summary
这是一个协议，准备和保持器官的文化一个新皮层锥体神经元的电气录音的目的的片准备。
Abstract
我们一直在研究大鼠大脑皮层锥体神经元电压门控钾通道的表达和功能的作用。由于缺乏这些渠道的具体药理代理商，我们已经采取了遗传学的方法操纵的渠道表达。我们使用一个器官的文化准备（16），以维持细胞的形态和皮质层模式。我们通常会在产后8-10天隔离急性新皮层切片，并保持3-7天文化片。这使我们能够在我们与急性切片的工作的一个年龄相仿的研究神经元和最大限度地减少了旺盛切片中的兴奋连接的发展。我们从视觉识别的锥体神经元层的II / III或V使用红外线照射（红外）和微分干涉对比显微镜（DIC）在电流或电压钳全细胞膜片钳记录。我们使用基因枪的野生型或突变的钾离子通道的DNA（基因枪）转来操纵表达的渠道，研究其功能。 epifluorescence显微镜与绿色荧光蛋白（GFP）基因共转染后的转染细胞很容易识别。我们比较对相邻的未转染的神经元，在同一层的同一片转染细胞的录音。
Protocol
1。一天的切片前的准备工作
我们发现这是更有效的反应釜的手术器械和准备的解决方案前一天的切片。
- 高压灭菌仪器。 （半无菌条件下进行的手术和切片）。高压灭菌器下面的包，分别在高压灭菌纸包裹：
- 手术包：铲，22号手术刀刀片手柄，剪刀，镊子
- 切片包装：3旋钮（刀片控股旋钮和2浴，确保旋钮）和刀片护罩（可容纳从切片机刀片：坎普登Vibroslice，＃MA572），单独包装（因为这将是冰箱）定制金属腔（标本浴）切片机（有机玻璃制造商的人会经不起反复高压灭菌），止血钳，剪刀，镊子。
- 玻璃包：两个50毫升的烧杯和一个25 mL烧杯中
- 分装马血清（Hyclone公司捐助马＃SH 30074：Thermoscientic）。马血清分装〜11毫升到15毫升锥形管。 （10毫升血清是需要的，因为泡沫会形成解冻血清时，你需要从中吸出所需的10毫升11毫升）。商店分装血清在-20 ° C冰箱。
- 分装的媒体。媒体瓶打开后，他们只〜4周（因pH值的变化）稳定。切片与新媒体生存得更好。
- 我们使用三种类型市售的媒体（500毫升瓶购买），加上马血清。媒体：HMEM（龙沙Biowhittaker最小必要的媒体加上的HBSS和HEPES，没有谷氨酰胺：目录＃12 - 137F），HBSS（GIBCO公司汉克斯缓冲液，＃24020-117），和MEM（GIBCO公司最小的必不可少的媒介，＃12360 - 038）。见表2。
- 对于每一个媒体（HMEM，HBSS中，和MEM）三种类型，分装〜50毫升到每4个50 mL锥形管媒体的500毫升瓶装。封口膜管后aliquoting。商店纪念在冰箱，和HMEM商店，在室温下的HBSS。
- 文化传媒由马血清，HMEM的HBSS（见下文表2）的混合物。纪念用作洗媒体。
- 使切削液（见表3）。切削液（毫米）：125氯化钠，氯化钾3的NaH 2 MgCl 2的 2毫米，2毫米氯化钙2 PO 4 1.25，碳酸氢钠3月 26日，和20毫米的葡萄糖组成。我们通常250毫升（带来容量瓶量）。检查渗透压（应该是〜310）和pH值（7.2-7.3）。
后续的步骤进行一天的切片（＃2和＃3）。
2。手术，切片，和器官型培养
重要的是要进行手术，在与所有其他程序的一个单独的位置。我们用手术切除脑真空（油烟）罩。层流罩是用于半无菌条件下，如切片和切片和解决方案的操作，执行的程序。
- 准备的解决方案。 （这些程序不需要在无菌条件下进行过滤的解决方案将在稍后的步骤。）
- 准备切削液（见表3）。 Ø至少20分钟（以稳定pH值，并确保所有的盐溶液中）的2 / 5％的CO 2与95％的混合的泡沫的解决方案。添加1毫米丙酮酸（代谢抑制剂）and0.6毫米抗坏血酸（抗氧化剂）。
- 解冻1整除马血清（11毫升）。
- 准备层流罩（戴手套的所有程序，饱和乙醇手套）。在本节中，我们准备的工作区提供一个清洁，半无菌的工作空间。我们也将过滤的解决方案，进行消毒。
- 使用紫外灯消毒工作空间内的层流罩（UV光会损坏塑料部件，所以我们盖theCampden Vibroslice我们使用切片〜1小时，见下文）。所有表面清洁，用70％乙醇（切片塑料旋钮除外：酒精会损害）。层流罩下通常也存在pipetter和吸管，酒精瓶，胶水，和油管连接到95％O 2 / 5％的CO 2和100 O 2的 。
- 层流罩下放置以下内容：
- 蒸压分片包
- 250毫升的裁剪解决方案
- Millipore公司明示加过滤器：250毫升[0.2微米的过滤器（＃SC6PU02RE）过滤切削液]：
- 文化传媒组件：
- 20毫升HMEM
- 10毫升的HBSS
- 马血清10毫升
- 玻璃包：高压灭菌烧杯
- 50毫升的MEM洗媒体
- Pipetter（德拉蒙德吸管的援助）
- 七个塑料转移移液器（费舍尔＃13-711-20）。这些都是用来传输片和解决方案，以及作为管道燃气解决方案（O，95％O 2 / 5％的CO 2）冒泡的解决方案和媒体。
- 氰基丙烯酸酯胶
- 刀片或剪刀（切胶）。
- ＃22无菌手术刀刀片
- Millicell小细胞培养插入（0.4微米，直径为30微米，＃PICM 03050）3每6孔板中插入
- 6孔培养板（S）（康宁：中光学＃3516）
- 筛选准备250毫升的裁剪解决方案，使用250毫升的微孔过滤器（见上文）。
分装40毫升到50 mL烧杯中切割解决方案。切削液和切削液210毫升，其余的在冰箱（-20℃）放置40毫升等分。我们的目标是作为一个泥泞的混合物中使用这些解决方案〜4 ° C，用于接收从头骨（40毫升烧杯）取出后，大脑和切割（210毫升）。 - 把金属切片室（包括高压灭菌纸），在-20 ° C冰箱。这有助于保持在切片过程中的切削液和脑冷。
- 准备文化传媒和投入井（不要泡沫文化传媒 - 它将泡沫）。
- 准备于50 mL塑料离心管40毫升培养基：
- 混合20毫升HMEM ± 10毫升的HBSS +马血清10毫升等分（见表2）
- 过滤文化传媒（消毒），使用50毫升微孔steriflip 0.22微米过滤器（＃SCGP00525）。
- 放入3对角线分布的6孔板井（康宁：中光学＃3516 6以及文化集群）1.1毫升文化传媒。放置6孔板/文化媒体于37 ° C培养箱中至少有一个小时。
- 准备于50 mL塑料离心管40毫升培养基：
- 用无菌剪刀或刀片，缩短转移吸管（使用传输片）4。切管两端使用没有进一步修改的冒泡的解决方案，以驱散气体。这些管连接线，从坦克的95％O 2 / 5％CO 2或100％O 2的解决方案。
- 过滤洗涤媒体（50毫升），使用50毫升微孔steriflip 0.22微米过滤器（＃SCGP00525）。放置在冰箱中洗净媒体。
- 手术的准备工作。解决方案必须准备接受手术后的大脑（真空罩），并允许快速切片和文化的准备（层流罩）。我们执行一个真空罩下的手术。重要的是，手术是在一个单独的区域进行，保持头发和体液中，远离半无菌层流罩。
- 准备媒体和解决方案。
- 用40 mL裁剪解决方案，从冰箱中取出50 mL烧杯中，真空罩下，以接收从头骨取出后脑部。倒入〜这个寒冷的切削液10 mL 25 mL烧杯中中。这将用于运输大脑层流罩。
- 从冰箱中取出210毫升裁剪解决方案，并把层流罩（切片和切片收集）。
- 从冰箱中取出金属切片室，层流罩下。
- 泡泡都削减95％O 2 / 5％的CO 2（使用切胶转移的吸液管连接管来解决）的解决方案。
- 将真空罩下的下列项目（30毫升的裁剪解决方案已经存在，并与95％O 2 / 5％的CO 2的冒泡）：
- 蒸压25 mL烧杯
- 蒸压手术器械，手套，镊子
- 删除100％O 2的清洗冰箱和泡沫的介质（使用切割塑料移液管，连接管来解决） 。
- 准备媒体和解决方案。
- 手术（真空流罩下进行）。这一步是需要消除大脑随后切片。重要的是要尽量减少牺牲的动物，放置在冷，切削液含氧大脑之间的时间。同样重要的是，以尽量减少大脑的创伤。所有的程序获得批准的动物护理和使用委员会，田纳西大学健康科学中心。
- 我们使用Sprague - Dawley大鼠，从P6 - P17（P8 - P10）。将大鼠成覆盖2-4 L塑料容器。麻醉，〜1毫升isofluorane应用到位于一个塑料网下一块纱布（麻醉剂，使不接触动物）。麻醉与异氟醚的老鼠，直到动物areflexive。与乙醇饱和手套。
- 大鼠麻醉后，杀头大手术刀的动物，并移除大脑。放入大脑烧杯中含有30毫升的冷（〜4℃）〜30秒的切削液。小心脑转移到25 mL烧杯中，层流罩，以尽量减少头发或血液转移到。
- 更改手套（饱和乙醇）。
- 在寒冷的切削液（25 mL烧杯中）转移大脑层流罩。
- 大脑切片和文化准备。在这一步，我们东方的大脑，删除不必要的脑组织，剪切和收集大脑切片。我们然后洗净切片，每个切片上插入一个网状的地方，放置在6孔培养板的网格插入，转让文化的板（片）的孵化器。
- 东方和阻止脑（去除小脑和额极，使部分中期矢状切〜中途额叶皮层结束，这使得同时切割两片 - 从每个半球 - 但仍保留在尾鳍端两个hemsipheres一起为稳定的基础胶水阶段）。在舞台上与氰基丙烯酸酯胶堵塞大脑。将大脑额叶皮层和削减额顶皮质的冠状切片。请需要额外的手术刀切割片的大小限制。
- 广场与大脑的阶段消毒金属切片室（这是连接到组织切片机，振动）和填补与冰冷的浴缸，冒泡裁剪解决方案。 95％O 2 / 5％的CO 2〜30毫升剩余的切削液倒入50 mL烧杯中（收集切片）和泡沫。
- 250-300微米片切割与振动组织切片机（坎普登Vibroslice＃MA572：世界精密仪器，萨拉索塔，佛罗里达州，美国）。到包含切削液30毫升的烧杯放置切片。收集您希望文化（通常3-6）的片数，再加上一些额外的。
- 快讯：洗净地方〜2毫升洗净媒体35毫米的塑料培养皿中。将所有切片从切削液洗净媒体的Petri塑料菜。洗片3次，每次使用新鲜洗净媒体。使用单独的传输移液器转移切片，添加媒体，和吸废物的解决方案。
- 传输切片文化传媒（在不同的35毫米的塑料培养皿中，新的移液管）。删除从网格插入包装的顶部，但留在包装中插入。
- 片从文化传媒传输网状插入（用cuttransfer吸管）：在中间插入（图1A）的位置切片。一个小一点文化传媒将与切片一起。使用一个完整的移液管，取出后立即放在片插入多余的文化传媒。尝试定位片（这有利于基因枪转染，可以更容易地删除以后录音片）插入中心。
- 在6孔板放置网状插入/片（图1B）文化传媒。小心下mesh.When 3插入/片，以防止气泡的形成，在6孔板，6以及孵化器板回。在37 °彗星孵化器孵育片〜1小时。
- 转染切片，用基因枪（Bio - Rad公司太阳神）。后立即切片和安置在6孔板上网状这是可以做到的，但是我们通常孵育1小时，在37 ° C至稳定的切片，然后转染的细胞。 cDNA的“子弹”，并利用基因枪的详细协议，见参考文献。 17-22。
- 装入塑料“cartidges”，载“子弹”。 （指涂金粒子作为子弹的cDNA，因此，许多子弹在一个塑料的“墨盒”所载）。保留了第一的位置“自由（没有”盒“）。装入每个墨盒包含的cDNA涂层子弹的其他位置。放置在基因枪盒支架。
- 明确枪射击不带墨盒的每桶。
- 提前至每桶与墨盒。层流罩下，从孵化器和地方取出6孔板。保持略高于6孔板顶部枪。保持垂直。射击〜100 PSI。
- 提前桶，明确，重复。每片一杆。
- 拍摄后，返回片/插入到孵化器的6孔板。
- 文化切片（半无菌条件下）。片和6孔板所有的操作，应戴手套饱和乙醇和层流罩下，用酒精清洗后的面积，。我们的文化不同时期（一般为2-7天）切片，以便从急性切片过程的恢复，并允许导致新的蛋白质的转染时间。
- 文化为2-7天（37 ° C，5％的CO 2）在孵化器（备考的科学模型＃3110）。
- 隔日更换介质：添加新媒体的三个无人居住的井，在至少1个小时的孵化器取代。移动新井片/膜与乙醇清洗弯钳。吸旧媒体。返回板孵化器。
3。锥体细胞记录片
超出本协议的范围，它是全细胞记录技术，提供详细的指示。我们提供的信息如何转移切片到录音室，并提供我们录音的细节设置，尤其是当涉及到确定录制的转染细胞。
- 我们拉哈佛GC150TF - 10使用一个萨特的P - 87水平拉拔的玻璃电极。 2-6MΩ的细胞外液中的电极。电极都充满了一个KMeSO 4个内部（见表3）。
- 戴手套。从孵化器中删除6孔板。层流罩下，小心地取出乙醇清洗，弯钳插入片/网。在孵化器替换6孔板和转让的记录片，从录音面积。在我们的例子中，这是在不同的实验室。我们进行一个覆盖35毫米的塑料培养皿中的插入/片。这一步后，手套，不穿（没有污染的文化或孵化器的可能性）。
- ＃11手术刀切去膜。切对产钳或灵活的金属棒供应紧张。 （这可能是必要的，以完成最终削减用剪刀）。使用镊子，转让附有网片奥林巴斯BX50 WI直立显微镜舞台上的录音室。
- 我们使用Axon仪器Multiclamp 700B 10 PClamp放大器和数据采集协议。萨特净资产收益率- 200操控和PC - 200控制器控制电极位置。我们用的IR - DIC的光学奥林巴斯BX - 50WI直立显微镜可视化层的II / III或V锥体神经元，我们用一个单一的红外感光摄像头（奥林巴斯OLY - 150或DAGE - MTI）和丕1201B显示器的可视化切片中的细胞。片沐浴在carbogenated人工脑脊液（ACSF：表3）在2-3 mL / min的交付在33 ± 1 ° C。
通常情况下，我们发现每片10-50转染细胞。细胞位于lookingthrough显微镜目镜和使用与FITC标记的过滤器（安装在低于上述目标，在显微镜的目镜位于炮塔装载滤光轮）epifluorescence。这使我们之间的IR - DIC和epifluorescence轻松切换，以确定细胞类型，细胞是转（细胞出现绿色，下epifluorescence，并包含一个子弹），而细胞是健康的（细胞是3维和具有光滑的表面，核不肿大，细胞不肿大或萎缩）。
我们的目标层的II / III或V锥体神经元（见图1）。锥体细胞识别心尖朝向层升序我，无数的树突棘，梨形SOMA枝蔓的存在。层是由细胞密度和相对位置的PIA。片表面上一般转染的细胞不会是健康的。虽然它是很难想象比急性切片的细胞内器官切片深，我们一般可以可视化的健康，从20-50微米以下的片表面的转染细胞。我们使用标准的全细胞记录方法。我们的做法视觉引导下，在电压钳正压细胞。密封件是温和的吸力下的电压钳（用1 mL注射器）收购。达到GΩ的印章后，额外的吸力应用打破的细胞。然后，我们执行的录音，无论是电流或电压钳。
在录制结束，我们确认，记录细胞是绿色的，包含一颗子弹，明显的响应，以正面或负面的压力。为了控制切片，细胞层，在手术时的年龄，和文化的时间之间的变化，我们始终对我们的录音转染细胞与未转染对照组细胞从同一层的录音，并与位于转染细胞的50微米。
4。代表性的成果：
图1A显示了敏锐地准备坐成一个培养6孔板片插入膜。这片包括电机和体感皮层从P10大鼠小狗。 PIA是权利的身影，白质和纹状体的左侧。图1b显示了在井片/膜，沉浸在〜1.1毫升文化传媒。我们的器官文化的目标是要保持正常的皮质层模式，防止表面干燥过程中文化，并最终产生几个可以记录从天中文化后的切片中的活细胞的比例高（细胞萎缩或肿，肿最小细胞的细胞核，细胞的三维外观光泽和三个IR - DIC的光学）。图1C一个第三层锥体神经元的器官切片的体感皮层的IR - DIC和epifluorescence图像显示后3天文化（P10动物）。图1D，是一个不同的切片epifluorescence的形象，呈现出几个V层细胞转染GFP（绿色细胞）的cDNA。
图2显示了从V层后3天（P10动物）锥体细胞器官切片文化，在电流和电压钳录音代表性的痕迹。图2A显示了过度反应动作电位（AP）。图2B显示在2秒，400 pA的恒定电流注入重复发射。这些痕迹表明定期扣球V层神经元的正常电生理特性（参见表1）。图1C是一个从V层锥体神经元在1微米河豚毒素（TTX）阻断电压门控Na +电流的存在的电压钳记录。的痕迹，是一个家庭的电流，在500毫秒电压步骤，从保持电位-70 mV的-90 mV和70毫伏（10毫伏之间的步骤）之间的各种潜能。
图1。器官型片文化。 P10 Millicell小滤网插入大鼠大鼠感觉运动皮质切片。 PIA是正确的，深刻的白质和纹状体到左边。中线是在上边缘。 B.三片和网状插入淹没在〜1毫升培养基，置于6孔板不相邻井（一）同一动物。 C.红外DIC（上）和epifluoresent（低）层三新皮层锥体细胞在器官文化（P10动物，3天中文化）的图像。请注意“子弹头”在DIC图像（黑色球体）中可见。 D.几个V层神经元的基因枪转染绿色荧光蛋白的cDNA后的荧光图像。
图2。新皮层锥体细胞在器官切片文化录音答。在第三层的锥体细胞的动作电位（P10动物，后3天中文化），响应阈上10毫秒电流注入。 B.重复发射不同，V层锥体神经元（P10大鼠，在培养3天），2秒，400 pA的电流注入。这是一个普通的扣球神经元。 C.电压钳记录，从不同的V层锥体神经元（P10大鼠，3天中文化）。 1微米的TTX是目前阻断电压门控Na +电流。外K +到500毫秒从-70毫伏（在右边的协议）的控股潜力的电压步骤家庭中的电流。电压为+10 mV的液体交界的潜力得到了纠正。访问阻力〜9MΩ。没有采用串联电阻或膜电容补偿。
表1。类似的电气性能，控制与GFP转染的锥体细胞（;：在体外培养3-4天的P10大鼠的器官切片片）。平均+平均值的标准误差（细胞数）。 RMP =静息膜电位，RN =输入电阻，AP =动作电位;的Vth = AP阈值电压;硬件= AP半振幅宽度。
| 治疗 | RMP（MV） | RN（MΩ） | 美联社幅度 | Vth的（MV） | HW（MS） |
| 控制 | -72 ± 1（21） | 119 ± 17（11） | 84 ± 2（24） | -45 ± 1（21） | 1.7 ± 0.1（19） |
| 绿色荧光蛋白只 | -77 ± 1（9） | 123 ± 7（5） | 87 ± 2（24） | -45 ± 2（9） | 2.1 ± 0.2（7） |
表2。商业媒体，这些媒体购买和使用未修改的（他们的作品是从制造商上线）。
1洗净媒体：MEM（GIBCO公司＃12360）
文化传媒：20毫升HMEM 1（龙沙Biowhittaker），10毫升HBSS1（GIBCO，24020-117）+ 10毫升马serum1（Hyclone公司＃SH 30074.03）
表3。解决方案 （浓度单位为mm）。
切削液：125 3氯化钠，氯化钾，氯化钙2 2 2 MgCl 2的 ，1.25的NaH 2 PO 4，26 20的葡萄糖（310 MOsm / L，pH值7.4，）3，碳酸氢钠。
人工脑脊液学联（外部录音）：125氯化钠氯化钾3 2 2 氯化钙 ，氯化镁，1.25的NaH 2 PO 4，26 20 310 MOsm / L），葡萄糖（pH值7.4，3，碳酸氢钠。
内部录音（电流钳）：130.5 KMeSO4，10，10 HEPES，2个ATP的GTP的0.2，0.1 EGTA（pH值7.2，285-295 mOsm / L）的氯化钾，氯化钠，氯化镁2 2 7.5。
内部录音（电压钳）：55 55 KMeSO 4，氢氧化钾，氯化镁2 2 20 HEPES，肌酸磷酸，三磷酸腺苷，0.5的GTP，10 BAPTA亮肽素，0.1（pH值7.2，285-295 mOsm / L），6。
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Discussion
我们一直在研究在大鼠大脑皮层（4 9-11）锥体神经元电压门控钾通道的表达和功能的作用。由于缺乏这些渠道的具体药理代理商，我们使用一种遗传方法操纵通道表达（1,14,15,17-19）。我们利用一个器官的文化准备（2,3; 5-8; 12,13,15-22）。Stoppini等（16）的方法修改，以维持细胞的形态和皮质层模式。我们在产后6-17天隔离急性新皮层切片，并保持2-7天文化片。这使得我们研究类似岁的神经元在我们与急性切片的工作，最大限度地减少了旺盛切片中的兴奋连接的发展。我们将从视觉识别层的II / III或V锥体在使用红外线照射（红外）和微分干涉相衬显微镜（DIC）的电流或电压钳全细胞膜片钳神经元。基因枪法基因枪转染野生型或突变的钾离子通道的DNA是用来操纵表达的渠道，研究它们的功能（1,14,15,17）。通过共转染绿色荧光蛋白基因，转染细胞epifluorescence显微镜下很容易识别。我们比较相邻的未转染的神经元，在同一层相同的切片（1,17）转染细胞的录音。
这里所涉及的程序没有困难，但注意一些细节，可以大大提高的结果。在我们手中，最好的时候文化是来自片〜P8 - P10动物细胞活力。重要的是要保持半无菌条件下，在切片和切片培养。为了防止细菌污染，高压灭菌器的工具和洁净手术区与紫外线和乙醇，过滤器的解决方案，戴上手套，并去除脑和片之间的更换手套。细菌污染的后果，包括穷人组织的可行性和必要性，以净化孵化器。与所有的大脑切片，生存能力提高，最大限度地减少牺牲的动物之间的时间和切片。应放在大脑切片应与切削液在冰冷浆淹没大脑。切片速度缓慢，低振幅的水平振动的刀片。
另一个潜在的问题是干燥而在孵化器片。干燥，可最大限度地减少编制，小片：限于利益皮层和纹状体的小片（方向）。大型片往往干在孵化器，它更难获得稳定的录音条件，与大型片。在250-300微米厚片被切断。我们发现，更薄的片（250微米），造成不易干燥。片切割解决方案孵化器转移时，我们洗片几次，先洗净媒体，然后在培养基。重要的是要删除多余的液体后，转移到膜（允许片附加到网格）。对于较厚的片（如300微米），单一的文化媒体上的节奏片顶部下降（虽然它是坐在膜）有助于防止干燥。这个过程中出现素片的顶部表面潮湿的媒体运动。隔日更换培养基，还可以防止干燥和推广的可行性。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢真弓樱和丽贝卡Foehring优秀的技术援助。此外，我们要感谢博士。罗德里戈安德拉德在实施为我们提供了转基因构造的器官切片文化和基因枪转染协议的博士和珍妮Nerbonne的援助。这项工作是由美国国立卫生研究院授予：NS044163支持NINDS（RCF）。
Materials
Surgery / transfection / culture:
Media:
Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132. Recording:
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