Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

Published: June 3, 2011 doi: 10.3791/2600
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center

Summary

זהו פרוטוקול להכין ולתחזק הכנה פרוסה neocortical בתרבות organotypic לצורך ביצוע הקלטות חשמל עצב פירמידליים.

Abstract

אנחנו כבר לומדים את הביטוי הפונקציונלי התפקידים של מתח מגודרת ערוצי אשלגן עצב פירמידליים מ הניאוקורטקס חולדה. בגלל חוסר של סוכנים תרופתי ספציפי עבור הערוצים הללו, נקטנו בגישה מניפולציה גנטית לביטוי הערוץ. אנו משתמשים להכנת תרבות organotypic (16) על מנת לשמור על מורפולוגיה של תאים דפוס למינרית של קליפת המוח. אנחנו בדרך כלל לבודד פרוסות neocortical חריפה על 8-10 ימים לאחר הלידה ולשמור את פרוסות בתרבות עבור 3-7 ימים. זה מאפשר לנו ללמוד נוירונים בגיל דומים לאלה של העבודה שלנו עם פרוסות חריפה ממזער את התפתחות הקשרים מעוררים התוסס של הפרוסה. אנו להקליט עצב פירמידליים חזותית מזוהה שכבות II / III או V באמצעות תאורה אינפרא אדום (IR-) הפרעות ההפרש מיקרוסקופיה לעומת זאת (DIC) עם מהדק תיקון כל תא מהדק מתח הנוכחי או. אנו משתמשים transfection biolistic (אקדח ג'ין) של סוג בר או דנ"א מוטנטי ערוץ אשלגן לתפעל הביטוי של ערוצי ללמוד את תפקידם. התאים transfected מזוהים בקלות אחרי transfection בשיתוף עם cDNA עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. אנו משווים הקלטות של תאים transfected אל, נוירונים סמוכים untransfected באותה השכבה של פרוסה אחת.

Protocol

1. הכנות לפני הימים של חיתוך

אנו מוצאים אותה יעילה יותר החיטוי מכשירי ניתוח ולהכין פתרונות לפני יום של חיתוך.

  1. החיטוי מכשירים. (ניתוח חיתוך מבוצעים תחת תנאים סטריליים למחצה). החיטוי את החבילות הבאות, עטוף בנפרד בנייר החיטוי:
    • חבילת כירורגיה: מרית, # 22 ידית להב סכין המנתחים, מספריים, מלקחיים
    • חבילת חיתוך: 3 כפתורים (להב החזקת הידית 2 המרחץ אבטחת ידיות) ו להב השומר (מחזיקה סכין גילוח של מבצעה: Campden Vibroslice, # MA572), עטוף בנפרד (כי זה יהיה לשים במקפיא) בהתאמה אישית קאמרית מתכת ( הדגימה אמבטיה) על מבצעה (פרספקס של יצרן אחד לא תעמוד מעוקר חוזרות ונשנות), hemostat מספריים, מלקחיים.
    • חבילת כלי זכוכית: שתי כוסות 50 מ"ל ואחד כוס 25 מ"ל
  2. סוס Aliquot בסרום (Hyclone התורם סוסים SH # 30074: Thermoscientic). Aliquot ~ 11 מ"ל של סרום סוס לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל. (10 מ"ל סרום נחוץ. בגלל בועות יהוו בסרום כאשר הוא מופשר, אתה צריך 11 מ"ל שממנו ניתן לשאוב מ"ל נדרש 10). חנות aliquoted בסרום מקפיא -20 ° C.
  3. Aliquot התקשורת. לאחר בקבוקי התקשורת נפתחים, הם רק יציב ~ 4 שבועות (עקב שינויים pH). פרוסות לשרוד טוב יותר עם התקשורת טריים.
    • אנו משתמשים בשלושה סוגים של מדיה זמינים מסחרית (לרכוש בקבוקי 500 מ"ל), בתוספת סרום סוס. אמצעי התקשורת הם: HMEM (Lonza מדיה Biowhittaker Essential מינימלי בתוספת HBSS ו HEPES, לא גלוטמין: קטלוג # 12-137F), HBSS (GIBCO הנקס שנאגרו מלוחים, # 24020-117), וכן מזכרות (בינוני GIBCO חיוני מינימלי, # 12360 - 038). ראה טבלה 2.
    • עבור כל אחד משלושת סוגי המדיה (HMEM, HBSS, ו ממ), aliquot ~ 50 מ"ל מתוך בקבוק 500 מ"ל של מדיה לתוך כל אחד של ארבעה צינורות חרוטי 50 מ"ל. Parafilm כל הצינורות לאחר aliquoting. חנות מזכרות במקרר, ואחסן HMEM ו HBSS בטמפרטורת החדר.
    • תרבות התקשורת מורכב מתערובת של סוס בסרום, HMEM ו HBSS (ראה להלן, טבלה 2). ממ משמש לתקשורת לשטוף.
  4. בצע חיתוך פתרון (לוח 3). הפתרון חיתוך מורכב (מ"מ): 125 NaCl, KCl 3, לאא 2 PO 4 1.25, NaHCO 3 26, 2 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ MgCl 2, 20 גלוקוז מ"מ. אנחנו בדרך כלל עושים את 250 מ"ל (להביא נפח בקבוק volumetric). בדוק osmolality (צריך להיות ~ 310) ואת ה-pH (7.2-7.3).

שלבים מאוחרים יותר (# 2 ו # 3) מבוצעים ביום של חיתוך.

2. כירורגיה, חיתוך, תרבות Organotypic

חשוב לבצע את הניתוח במיקום נפרד מול כל הליכים אחרים. אנו משתמשים ברדס (קטר) ואקום לניתוח להסרת המוח. מכסה המנוע זרימה למינרית משמש ההליכים שבוצעו תחת תנאים סטריליים למחצה, כגון חיתוך ומניפולציות של פרוסות ופתרונות.

  1. הכינו פתרונות. (נהלים אלה לא צריך להתבצע בתנאים סטריליים כמו הפתרונות יהיו מסוננים בשלב מאוחר יותר.).
    1. הכן פתרון חיתוך (לוח 3). הפתרון בועות בתערובת של 95% O 2 / 5% CO 2 לפחות 20 דקות (כדי לייצב pH ולוודא מלחים כל פתרון). הוסף 1 mM Pyruvic חומצה (מעכבי מטבולית) and0.6 ascorbate מ"מ (נוגדי חמצון).
    2. 1 הפשירי aliquot של סוס סרום (11 מ"ל).
  2. הכן תזרים ברדס למינרית (ללבוש כפפות על כל הנהלים, להרוות כפפות עם EtOH). בסעיף זה, אנו מכינים את אזור העבודה כדי לספק נקי, חצי סטרילי בחלל העבודה. אנו גם לסנן הפתרונות לעקר אותם.
    1. השתמש אור UV במשך שעה 1 ~ לעקר את שטח העבודה בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית (אור UV תגרום נזק חלקי פלסטיק כדי שנוכל לכסות theCampden Vibroslice אנו משתמשים חיתוך, ראה להלן). יש לנקות את כל המשטחים עם EtOH 70% (למעט ידיות הפלסטיק של מבצעה: EtOH יפגע). כמו כן נוכח בדרך כלל מתחת למכסה המנוע לזרום למינרית הם pipetter ו pipets, בקבוק EtOH, דבק, צינורות מחוברים 95% O 2 / 5% CO 2 ו - 100 O 2.
    2. המקום הבא מתחת למכסה המנוע לזרום למינרית:
      • חבילת חיתוך Autoclaved
      • חיתוך 250 מ"ל פתרון
      • Millipore לבטא בתוספת מסנן: 250 מ"ל [0.2 מיקרומטר מסנן (# SC6PU02RE) לסנן פתרון חיתוך]:
      • תרבות מדיה רכיבים:
        • 20 מ"ל HMEM
        • 10 מ"ל HBSS
        • 10 מ"ל סרום סוס
      • חבילת כלי זכוכית: כוסות autoclaved
      • 50 מ"ל של ממ לשטוף התקשורת
      • Pipetter (דראמונדpipet-סיוע)
      • שבעת העברת pipettes פלסטיק (פישר # 13-711-20). אלה משמשים להעברת פרוסות פתרונות, כמו גם לשמש כצינור עבור פתרונות גז (O 2, 95% O 2 / 5% CO 2) עבור מבעבע פתרונות התקשורת.
      • Cyanoacrylate דבק
      • רייזור להב או מספריים (לחתוך פלסטיק).
      • להב # 22 אזמל סטרילי
      • תרבות Millicell תא מוסיף (0.4 מיקרומטר, בקוטר של 30 מיקרומטר, PICM # 03050) 3 מוסיף לצלחת 6-היטב כל
      • 6 גם תרבות צלחת (ים) (קורנינג: שחקן המשנה # 3516)
    3. סינון חיתוך מוכן 250 מ"ל פתרון באמצעות 250 מ"ל Millipore מסנן (ראה לעיל).
      Aliquot 40 מ"ל של חיתוך הפתרון לתוך מבחנה 50 מ"ל. מניחים את aliquot 40 מ"ל של חיתוך פתרון ו 210 מ"ל הנותרים פתרון חיתוך במקפיא (-20 ° C). המטרה היא להשתמש אלה פתרונות כתערובת עכור ב ~ 4 ° C לקבלת המוח לאחר הסרת מהגולגולת (40 מ"ל בכוס) ו לחיתוך (210 מ"ל).
    4. מקום חיתוך מתכת תא (מכוסה בנייר החיטוי) במקפיא -20 ° C. זה עוזר לשמור על פתרון חיתוך קר המוח במהלך חיתוך.
    5. הכן מדיה התרבות להכניס בארות (אל תרבות מדיה בועה - זה קצף).
      • הכן 40 מ"ל תרבות מדיה צינור פלסטיק 50 מ"ל צנטריפוגה:
        • מערבבים 20 מ"ל HMEM + 10 HBSS מ"ל + 10 מ"ל aliquot בסרום של סוס (טבלה 2)
        • סינון המדיה והתרבות (לעקר) באמצעות 50 מ"ל Millipore steriflip 0.22 מיקרומטר מסנן (# SCGP00525).
      • מקום 1.1 מ"ל לתוך תרבות מדיה 3 בארות באלכסון במרווחים של צלחת 6-באר (קורנינג: שחקן המשנה # 3516 6 אשכול תרבות היטב). 6-הצב גם צלחת / תרבות מדיה לתוך 37 ° C חממה לפחות שעה אחת.
    6. עם מספריים או סכין גילוח סטרילי, לקצר 4 של pipets ההעברה (להשתמש להעברת פרוסות). קצוות הצינור לחתוך משמשים ללא שינוי נוסף לפיזור גזים פתרונות מבעבע. צינורות אלה מתחברים קווי מטנקים של 95% O 2 / 5% CO 2 או 100% O 2 פתרונות.
    7. סנן לשטוף מדיה (50 מ"ל) באמצעות 50 מ"ל Millipore steriflip 0.22 מיקרומטר מסנן (# SCGP00525). המקום מדיה לשטוף במקרר.
  3. הכנה לניתוח. פתרונות חייבים להיות מוכנים לקבל את המוח לאחר הניתוח (מכסה המנוע ואקום) ולאפשר חיתוך מהיר והכנה תרבות (זרימה למינרית מכסה המנוע). אנו מבצעים את הניתוח מתחת למכסה המנוע ואקום. חשוב כי את הניתוח להתבצע באזור נפרד כדי לשמור על הנוזלים שיער הגוף הרחק מכסה חצי סטרילי זרימה למינרית.
    1. הכן התקשורת ופתרונות.
      • הסר את כוס 50 מ"ל עם 40 מ"ל פתרון חיתוך מהמקפיא ולשים מתחת למכסה המנוע ואקום לקבל מוח לאחר הסרת מהגולגולת. יוצקים ~ 10 מ"ל של פתרון זה חיתוך קר בכוס 25 מ"ל. זה ישמש כדי להעביר למוח מכסה המנוע לזרום למינרית.
      • הסר הפתרון חיתוך 210 מ"ל מהמקפיא ולשים מכסה המנוע לזרום למינרית (עבור חיתוך ואיסוף פרוסה).
      • הסר קאמרית מתכת חיתוך מהמקפיא ולשים מתחת למכסה המנוע לזרום למינרית.
      • הבועה הן פתרונות חיתוך עם 95% O 2 / 5% CO 2 (להשתמש פלסטיק לחתוך pipettes להעביר לחבר צינורות לפתרון).
    2. הנח את הפריטים הבאים מתחת למכסה המנוע ואקום (30 מ"ל חיתוך פתרון כבר בהווה מבעבע עם 95% O 2 / 5% CO 2):
      • autoclaved כוס 25 מ"ל
      • מכשירי ניתוח Autoclaved, כפפות, מלקחיים
    3. הסר לשטוף מדיה מהמקרר ואת הבועה עם 100% O 2 (לשימוש סוף פיפטה פלסטיק לחתוך להעביר לחבר צינורות לפתרון).
  4. הניתוח (מבוצע מתחת למכסה המנוע לזרום ואקום). צעד זה נדרש כדי להסיר את המוח בעקבות חיתוך. חשוב לצמצם את הזמן בין הקרבת בעלי חיים למקם את המוח פתרון, קר חיתוך מחומצן. חשוב גם כדי למזער טראומה למוח. כל ההליכים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש, אוניברסיטת טנסי, למדעי הבריאות מרכז.
    1. אנו משתמשים Sprague-Dawley חולדות, מן P6-p17 (אנו מעדיפים P8-P10). המקום חולדה לתוך כיסו מיכל פלסטיק 2-4 L. עבור הרדמה, ~ 1 מ"ל isofluorane מוחל על פיסת גזה נמצא תחת רשת פלסטיק (כך הרדמה לא פנה בעל חיים). הרדימי עכברוש עם isoflurane עד שהחיה היא areflexive. להרוות כפפות עם EtOH.
    2. אחרי עכברוש הוא הרדים, לערוף את החיה עם אזמל גדולים, ולהסיר המוח. מכניסים לתוך המוחכוס המכילה 30 מ"ל של קר (~ 4 ° C) פתרון חיתוך עבור ~ 30 שניות. בזהירות העברת המוח כוס 25 מ"ל כדי למזער העברת שיער או זרימת הדם אל מכסה המנוע למינרית.
    3. שנה כפפות (להרוות עם EtOH).
    4. העברת המוח בפתרון חיתוך קר (25 כוס מ"ל) עד ​​מכסה המנוע זרימה למינרית.
  5. פורסים את המוח להתכונן תרבות. בשלב זה, אנו מכוונים את המוח, הסרת רקמה מיותרת המוח, לחתוך ולאסוף פרוסות המוח. לאחר מכן לשטוף את פרוסות, כל פרוסה על מקום להוסיף רשת, המקום מוסיף רשת ב 6 גם צלחות תרבות, ולהעביר את הצלחות (עם פרוסות) אל האינקובטור לתרבות.
    1. אוריינט והמוח לחסום (להסיר את המוח הקטן ואת מוט חזיתית, לעשות חתך חלקי אמצע sagital ~ חצי דרך מסוף קליפת המוח הקדמית זה מאפשר חיתוך סימולטני של שתי פרוסות -. האונה כל אחד מ - אך עדיין שומרת על שניהם יחד hemsipheres בסוף הזנב עבור בסיס יציב דבק על הבמה). דבק חסום המוח על הבמה עם cyanoacrylate. מקום עם קליפת המוח הקדמית מעלה לחתוך פרוסות העטרה של קליפת frontoparietal. לבצע חתכים אזמל נוספים לפי הצורך כדי להגביל את גודל הפרוסה.
    2. מניחים את הבמה עם המוח לתוך תא עיקור חיתוך מתכת (אשר מחובר מבצעה את הרקמה רוטט) ולמלא אמבטיה עם קרים כקרח, מבעבע פתרון חיתוך. יוצקים ~ 30 מ"ל של פתרונות חיתוך הנותרים לתוך מבחנה 50 מ"ל (כדי לאסוף את פרוסות) ו בועה עם 95% O 2 / 5% CO 2.
    3. חותכים לפרוסות 250-300 מיקרומטר עם מבצעה רקמה רוטטת (Campden Vibroslice # MA572: מכשירים Precision העולם, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב). מניחים פרוסות לתוך כוס המכילה 30 מ"ל חיתוך פתרון. אסוף את מספר פרוסות ברצונך תרבות (בדרך כלל 3-6), פלוס עוד כמה.
    4. לשטוף Slices: ~ מקום 2 לשטוף מדיה מ"ל צלחת פלסטיק 35 מ"מ פטרי. העברת כל הפרוסות מן הפתרון חיתוך כדי בצלחת פטרי מפלסטיק עם Media לשטוף. לשטוף פרוסות 3 פעמים, באמצעות מדיה לשטוף טריים בכל פעם. השתמש pipettes העברת נפרד להעביר פרוסות, להוסיף מדיה, לשאוב פתרונות פסולת.
    5. העברת פרוסות כדי Media תרבות (בתוך צלחת פלסטיק שונים 35 מ"מ פטרי; להעביר פיפטה חדש). הסר את צמרות מהאריזה עבור רשת מוסיף, אבל להשאיר את מוסיף באריזה.
    6. העברת Slices מהתקשורת והתרבות מוסיף רשת (עם cuttransfer פיפטה): פרוסות עמדה במרכז הכנס (איור 1A). קצת קטנה של מדיה תרבות יבוא יחד עם הפרוסה. בעזרת פיפטה להעביר שלם, הסר את המדיה והתרבות עודף מיד לאחר הצבת פרוסה על להכניס את. נסה למקם במרכז פרוסה של הכנס (זה מאפשר transfection biolistic ומקלה להסיר את פרוסת הקלטה מאוחר יותר).
    7. מניחים רשת הכנס / פרוסה בתקשורת תרבות צלחת 6-היטב (איור 1 ב). היזהר כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר תחת 3 מוסיף mesh.When / פרוסות נמצאים צלחת 6-הבאר, מקום 6-היטב את הצלחת באינקובטור. דגירה פרוסות 37 ° C בחממה במשך שעה 1 ~.
  6. Transfect פרוסות באמצעות אקדח גנים (Bio-Rad הליוס). ניתן לעשות זאת מיד לאחר חיתוך ומיקום על רשת בצלחת 6, אך אנו בדרך כלל דגירה במשך שעה 1 ב 37 ° C כדי לייצב את פרוסות ואז transfect התאים. עבור פרוטוקולים מפורטים להכנת cDNA "כדורי" ושימוש Gun ג'ין, ראה השופטים. 17-22.
    1. טען פלסטיק "cartidges" המכיל "כדורי". (אנו מתייחסים cDNA מצופה חלקיקי זהב כמו כדורים. לכן, כדורים רבים הכלולים "מחסנית" פלסטיק.). השאר את עמדת חופשי הראשונה (לא "מיכל"). טען כל עמדה אחרת עם מחסנית המכילה cDNA מצופים גומי. המקום בעל מחסנית של אקדח גנים.
    2. נקה באמצעות ירי אקדח עם מחסנית חבית לא.
    3. Advance חבית אחת עם מחסנית. הסר 6-גם צלחת מן החממה מקום מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. החזק את האקדח בדיוק מעל גבי צלחת 6 היטב. החזק אנכי. תירה ב ~ 100 psi.
    4. חבית מראש, חזור ברורה. ירייה אחת לכל פרוסה.
    5. לאחר הירי, להחזיר 6-גם צלחות עם פרוסות / מוסיף אל האינקובטור.
  7. תרבות פרוסות (תחת תנאים סטריליים למחצה). המניפולציות כל פרוסות 6-גם צלחות יש לבצע עם כפפות רווי EtOH ו מתחת למכסה המנוע לזרום למינרית, לאחר ניקוי השטח עם EtOH. אנחנו בתרבות פרוסות לפרקי זמן שונים (בדרך כלל 2-7 ימים), כדי לאפשר התאוששות של ההליך חיתוך חריף כדי לאפשר זמן transfection להוביל חלבון חדש.
    1. תרבות של 2-7 ימים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) בתוך אינקובטור (פורמה מודל מדעי # 3110).
    2. החלף התקשורת בכל יום אחר: הוסף מדיה חדשה לשלוש בארות פנוי, להחליף באינקובטור במשך שעה לפחות 1. העבר פרוסה / קרום היטב חדשה עם EtOH לניקוי מלקחיים מעוקל. לשאובהתקשורת הישנה. חזור אל צלחת חממה.

3. שיא של תאים פירמידליים ב Slices

זה מעבר להיקף של פרוטוקול זה על מנת לספק הדרכה מפורטת על טכניקות הקלטה כל תא. אנו מספקים מידע על אופן העברת פרוסות לתא הקלטה לספק פרטים של הקלטה שלנו הגדרת, במיוחד נוגע לזיהוי תאים transfected הקלטה.

  1. אנו למשוך אלקטרודות מן הכוס GC150TF-10 הרווארד באמצעות P-87 סאטר חולץ אופקי. אלקטרודות 2-6 MΩ בפתרון תאיים. אלקטרודות מלאים 4 KMeSO פנימי (ראה טבלה 3).
  2. לבשו כפפות. הסר 6-גם צלחת מן החממה. מתחת למכסה המנוע הזרימה למינרית, להסיר בזהירות פרוסה אחת / רשת הכנס עם EtOH לניקוי, מלקחיים מעוקל. החלף 6-גם צלחת החממה ולהעביר את הפרוסה שיירשמו מן לאזור ההקלטה. במקרה שלנו זה במעבדה אחרת. אנו נושאים את הכנס / פרוסה מכוסה צלחת פלסטיק 35 מ"מ פטרי. לאחר שלב זה, כפפות לא צריך להיות שחוקים (אין אפשרות של זיהום תרבויות או חממה).
  3. גזור משם עם קרום # 11 אזמל. גזור נגד המתח המסופק על ידי מלקחיים או סרגל מתכת גמיש. (זה עשוי להיות נחוץ כדי לסיים את הקיצוץ הסופי עם מספריים). באמצעות מלקחיים, להעביר את הפרוסה עם רשת המחובר לתא הקלטה על הבמה של מיקרוסקופ BX50 WI אולימפוס זקוף.
  4. אנו משתמשים מכשירים אקסון מגבר Multiclamp 700B ורכישת פרוטוקולי נתונים PClamp 10. עמדת אלקטרודה נשלטת עם סאטר ROE-200 ו-PC המניפולטורים-200 בקר. אנו משתמשים במיקרוסקופ BX-50WI אולימפוס זקוף עם IR-DIC אופטיקה לדמיין עצב פירמידליים שכבות II / III או ו 'אנו משתמשים במצלמה אחת IR-רגיש (אולימפוס Oly-150 או DAGE-MTI) ולפקח ProVideo 1201B לדמיין התאים הפרוסה. Slices שטופים carbogenated מלאכותי הנוזל השדרתי (aCSF: לוח 3) שנשא 2-3 mL / min ב 33 ± 1 ° C.
    בדרך כלל, אנו מוצאים 10-50 תאים transfected לכל פרוסה. תאים ממוקמים ידי lookingthrough את העינית מיקרוסקופ באמצעות epifluorescence עם מסנן FITC (רכוב על גלגל לסנן בהר צריח ממוקם מעל יעדי ומתחת העינית של המיקרוסקופ). זה מאפשר לנו לעבור בקלות בין IR-DIC ו epifluorescence כדי לקבוע את סוג התא, כי תא transfected (תא ירוק מופיע תחת epifluorescence ומכיל כדור), וכי התא בריא (תא היא 3 מימדי ויש לו משטח חלק , גרעין לא נפוחה, התא לא נפוחה או מכווץ).
    אנחנו יעד עצב פירמידליים שכבות II / III או V (ראה תרשים 1). תאים פירמידליים מזוהים על ידי נוכחות של דנדריט apical עולה כלפי השכבה אני, הקוצים הדנדריטים רבים, בצורת אגס סומה. שכבה נקבעת על ידי צפיפות התאים ומיקום ביחס פיא. תאים transfected בדרך כלל על פני השטח של הפרוסה לא יהיה בריא. למרות שזה קשה יותר לחזות תאים עמוק בתוך פרוסה organotypic מאשר עם פרוסות חריף, בדרך כלל אנחנו יכולים לדמיין בריא, תאים transfected 20-50 מיקרומטר מתחת לפני השטח פרוסה. אנו משתמשים תקן כל הקלטה שיטות התא. אנו מתקרבים תא תחת הדרכתו חזותית עם לחץ חיובי מהדק מתח. אטמים נרכשים עם שאיבה עדינה (באמצעות מזרק 1 מ"ל) תחת מהדק מתח. לאחר השגת חותם GΩ, שאיבה נוספת מוחל לפרוץ לתא. אנחנו מכן לבצע הקלטות או מהדק מתח הנוכחי או.
    בסיום ההקלטה, אנו לוודא כי תא רשמה ירוק, מכיל כדור, ואת בעליל מגיב ללחץ שלילי או חיובי. כדי לשלוט על וריאציה בין פרוסות, שכבות התא, גיל בזמן הניתוח, וזמן בתרבות, אנחנו תמיד זוג הקלטות שלנו של תאים transfected עם הקלטות מתאי השליטה untransfected מהשכבה באותו ממוקם עם 50 מיקרומטר של התא transfected.

4. נציג תוצאות:

איור 1 א מציג פרוסה מוכן היטב יושב על הממברנה להכנסה לתוך צלחת 6-גם עבור culturing. פלח זה כולל את הקורטקס המוטורי ואת החושית של חולדה P10 הגור. פיא היא בצד ימין של הדמות, עם חומר לבן הסטריאטום משמאל. 1B איור מראה את הפרוסה / קרום בבאר, שקוע ~ 1.1 מ"ל מדיה ותרבות. המטרה שלנו לתרבות organotypic היא לשמר את דפוס למינרית נורמלית של קליפת המוח, למנוע משטח הייבוש במהלך התרבות, ובסופו של דבר לייצר אחוז גבוה של תאים חיים הפרוסה לאחר מספר ימים בתרבות כי ניתן להקליט מן (תאים לא מצומק or נפוחה, גרעינים מינימלית תא נפוחות, מראה מבריק ממדי שלושה תאים IR-DIC אופטיקה). איור 1C מראה תמונות IR-DIC ו epifluorescence של שכבה III פירמידה נוירון פרוסה organotypic של הקליפה החושית אחרי 3 ימיםתרבות (מן החי P10). איור 1D היא דימוי epifluorescence פרוסת שונים, מראה כמה V שכבת תאים transfected עם cDNA של ה-GFP (תאים ירוקים).

איור 2 מראה עקבות נציג הנוכחי מתח-clamp הקלטות מתא שכבה V לאחר פירמידה תרבות פרוסה organotypic במשך 3 ימים (P10 בעלי חיים). איור 2 א מראה פעולה להחטיא פוטנציאל (AP). איור 2B מראה ירי חוזרות בתגובה זריקת 2 ים, הרשות 400 זרם קבוע. עקבות אלו מצביעים על מאפיינים אלקטרו נורמלי של השכבה קבוע spiking V נוירון (ראה גם לוח 1). איור 1C הוא הקלטה מתח מ-clamp תא עצב פירמידלי שכבה V בנוכחות tetrodotoxin 1 מיקרומטר (TTX) לחסום מתח מגודרת Na + זרמים. עקבות הם משפחה של זרמים בתגובה 500 צעדים ms מתח מן הפוטנציאל אחזקה של mV -70 כדי פוטנציאלים שונים בין 70 ו -90 mV mV (ב mV בין 10 שלבים).

איור 1
באיור 1. פרוסה תרבות Organotypic א. פורסים הסנסורית של קליפת המוח של חולדות חולדה P10 על הוספת מסנן רשת Millicell. פיא היא לעניין, ממש לבן עמוק הסטריאטום משמאל. קו האמצע הוא בקצה העליון. ב 'שלושה מוסיף פרוסה רשת שקוע ~ 1 מ"ל מדיה התרבות להציב בארות שאינם סמוכים צלחת 6-היטב (בעלי חיים זהה). ג IR-DIC (העליון) ו epifluoresent (התחתון) תמונות של תא שכבה III פירמידה neocortical בתרבות organotypic (P10 בעלי חיים, 3 ימים בתרבות). הערה "כדור" נראה בתמונה DIC (כדור שחור). ד תמונה פלורסנט של הנוירונים בשכבה V לאחר מספר transfection biolistic עם cDNA של ה-GFP.

איור 2
איור 2. הקלטות מתאי פירמידה neocortical בתרבות פרוסה organotypic א. פוטנציאל פעולה בתא פירמידלי שכבה III (מן החי P10, לאחר 3 ימים בתרבות) בתגובה הזרקת suprathreshold ms 10 הנוכחי. ב ירי חוזר ונשנה של אחר, שכבה V פירמידה נוירון (P10 חולדה, 3 ימים בתרבות) בתגובה זריקה של 2, 400 הרשות הפלסטינית הנוכחית. זה היה נוירון spiking קבוע. ג Voltage-clamp שיא משכבת ​​שונה V פירמידה נוירון (P10 חולדה, 3 ימים בתרבות). 1 מיקרומטר TTX נכח לחסום מתח מגודרת Na + הנוכחי. כלפי חוץ, K + זרמים בתגובה למשפחה של 500 צעדים ms מתח מ פוטנציאל החזקת -70 mV (פרוטוקול מימין). מתח תוקנו עבור פוטנציאל צומת mV 10 נוזלי. ההתנגדות היתה גישה ~ 9 MΩ. פיצוי לא להתנגדות סדרה או קיבול הממברנה הועסק.

טבלה 1. המאפיינים החשמליים דומים של שליטה לעומת ה-GFP-transfected תאים פירמידליים (פרוסות של עכברוש P10; פרוסה organotypic: 3-4 ימים במבחנה). ממוצע + שגיאת התקן של הממוצע (מספר התאים). RMP = פוטנציאל הממברנה במנוחה, Rn = התנגדות קלט, AP = פוטנציאל פעולה; Vth = סף מתח AP; HW = רוחב AP ב משרעת וחצי.

טיפול RMP (mV) Rn (MΩ) AP משרעת Vth (mV) HW (ms)
שליטה -72 ± 1 (21) 119 ± 17 (11) 84 ± 2 (24) -45 ± 1 (21) 1.7 ± 0.1 (19)
GFP בלבד -77 ± 1 (9) 123 ± 7 (5) 87 ± 2 (24) -45 ± 2 (9) 2.1 ± 0.2 (7)

טבלה 2. Media מסחרי. בתקשורת אלה רכשו והשתמשו ללא שינוי (יצירות שלהם זמינים ב-line מהיצרן).

1 לשטוף מדיה: ממ (GIBCO # 12360)
התרבות מדיה: 20 מ"ל HMEM 1 (Lonza Biowhittaker) + 10 מ"ל HBSS1 (Gibco, 24020-117) + 10 מ"ל סוס serum1 (Hyclone # SH 30,074.03)

לוח 3. פתרונות (ריכוזים ב mM).

חיתוך פתרון: 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1.25 לאא 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 20 גלוקוז (pH 7.4, 310 MOsm / L).
נוזל המוח והשדרה מלאכותית aCSF (הקלטה חיצוני): 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1.25 לאא 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 20 גלוקוז (pH 7.4, 310 MOsm / L).
הקלטה פנימית (הנוכחי מהדק): 130.5 KMeSO4, 10 KCl, NaCl 7.5, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 ATP, GTP 0.2, 0.1 EGTA (pH 7.2, 285-295 mOsm / L).
הקלטה פנימית (מתח-clamp): 55 KMeSO 4, 55 KOH, 2 MgCl 2, 20 HEPES, 6 פוספט קריאטין, 4 ATP, GTP 0.5, 10 BAPTA, 0.1 leupeptin (pH 7.2, 285-295 mOsm / L).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנחנו כבר לומדים את הביטוי הפונקציונלי התפקידים של מתח מגודרת ערוצי אשלגן עצב פירמידליים מן החולדה הניאוקורטקס (4, 11/09). בגלל חוסר של סוכנים תרופתי ספציפי עבור הערוצים הללו, אנו משתמשים בגישה מניפולציה גנטית לביטוי ערוץ (1,14,15,17-19). אנו מנצלים להכנת תרבות organotypic (2,3, 5-8; 12,13,15-22). שונה מהגישה של Stoppini et al (16), על מנת לשמור על מורפולוגיה של תאים דפוס למינרית של קליפת המוח. אנו לבודד פרוסות neocortical חריפה על 6-17 ימים לאחר הלידה ולשמור את פרוסות בתרבות עבור 2-7 ימים. זה מאפשר לנו ללמוד נוירונים בגילאים דומים לאלה של העבודה שלנו עם פרוסות חריפה ממזער את התפתחות הקשרים מעוררים התוסס של הפרוסה. אנו להקליט עצב פירמידליים מזוהה ויזואלית שכבות II / III או V באמצעות תאורה אינפרא אדום (IR-) הפרעות ההפרש בניגוד מיקרוסקופיה (DIC) עם מהדק תא כל תיקון בבית מהדק מתח הנוכחי או. Biolistic (ג'ין אקדח) transfection של סוג בר או ערוץ מוטציה בדנ"א אשלגן משמש כדי לתפעל הביטוי של הערוצים ללמוד את תפקידם (1,14,15,17). עד transfection בשיתוף עם cDNA עבור ה-GFP, התאים transfected מזוהים בקלות תחת מיקרוסקופ epifluorescence. אנו משווים הקלטות של תאים transfected אל, נוירונים סמוכים untransfected באותה השכבה של פרוסת זהה (1,17).

אף אחד הנהלים מכוסה כאן קשה, אולם תשומת לב כמה פרטים יכולה לשפר באופן משמעותי את התוצאות. בידיים שלנו, כדאיות התא היא הטובה ביותר כאשר תרבויות עשויות פרוסות מחיות ~ P8-P10. חשוב לשמור על תנאים סטריליים למחצה במהלך חיתוך ו culturing של פרוסות. כדי למנוע זיהום חיידקי, אנו החיטוי המכשירים לנקות את האזור כירורגית עם האור האולטרה סגול ו EtOH, פתרונות סינון, ללבוש כפפות, כפפות לשנות בין הסרת המוח פרוסות ההחלטות. ההשלכות של זיהום חיידקי כוללים הכדאיות רקמות העניים הצורך לטהר החממות. כמו עם כל פרוסות המוח, הכדאיות היא משופרת על ידי צמצום הזמן בין הקרבה של החיה וחותך. המוח צריך להיות ממוקם וחותך צריך לעשות עם המוח שקוע slurry קרח קר הפתרון חיתוך. פורסים במהירות איטית, עם רטט נמוך אופקי משרעת של הלהב.

בעיה נוספת היא פוטנציאל ייבוש של פרוסות בעוד בחממה. ייבוש ניתן למזער על ידי הכנת פרוסות כי הם קטנים: מוגבלת בקליפת עניין פיסה קטנה של הסטריאטום (לצורך התמצאות). פרוסות גדולות נוטות להתייבש בחממה וקשה יותר להשיג תנאים הקלטה יציבה עם פרוסות גדולות. Slices נחתכים ב 250-300 מיקרומטר עבה. אנו מוצאים כי פרוסות דק (אנחנו מעדיפים 250 מיקרומטר) לגרום לייבוש פחות. בעת העברת פרוסות מפתרון חיתוך אל האינקובטור, אנו לשטוף פרוסות מספר פעמים, תחילה בתקשורת ולאחר מכן לשטוף המדיה והתרבות. חשוב להסיר את הנוזלים העודפים לאחר העברת הממברנה (כדי לאפשר פרוסה לצרף הרשת). עבור פרוסות עבות יותר (למשל, 300 מיקרומטר), טיפה אחת של תרבות המדיה בקצב על גבי הפרוסה (בזמן שהוא יושב על הממברנה) מסייע במניעת התייבשות. הליך זה נראה ראש תנועת התקשורת לחות על פני השטח העליון של הפרוסה. החלפת מדיה ותרבות בכל יום אחר גם מונע התייבשות ומקדם הכדאיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות Mayumi Sakuraba ורבקה Foehring לקבלת סיוע טכני יוצא מן הכלל. בנוסף, אנו רוצים להודות בני הזוג. רודריגו אנדרדה לסיוע ביישום תרבות פרוסה organotypic ופרוטוקולים transfection biolistic וד"ר ג'ין Nerbonne לספק לנו בונה cDNA עבור transfection. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק: NS044163 מ NINDS (עד RCF).

Materials

Surgery / transfection / culture:

  1. Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
  2. Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
    • Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
    • Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
    • disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
      • 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
      • Tefzel Tubing: #165-2441
  3. Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766).

Media:

  1. Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
  2. HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  3. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  4. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  5. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
  6. Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
  7. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)

Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.

Recording:

  1. Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
  2. Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
  3. Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  4. PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  5. lectrode position is controlled with Sutter R–-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
  6. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
  7. IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North R–ske Avenue, Michigan City, IN 46360).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).
  2. Buonomano, D. V. Timing of neural responses in cortical organotypic slices. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).
  3. Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex. Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).
  4. Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons. Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).
  5. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
  6. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).
  7. Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
  8. Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue. Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).
  9. Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones. J Physiol. 571, 371-389 (2006).
  10. Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).
  11. Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons. J Physiol. 581, 941-960 (2007).
  12. Johnson, H. A., Buonomano, D. V. A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes. Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).
  13. Johnson, H. A., Buonomano, D. V. Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices. J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).
  14. Malin, S. A., Nerbonne, J. M. Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons. J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).
  15. O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
  16. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  17. Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons. J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).
  18. Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons. J Neurochem. 75, 882-885 (2000).
  19. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
  20. O'Brien, J. A., Lummis, S. C. Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun. Nat Proc. 1, 977-981 (2006).
  21. Joshi, P., Dunaevsky, A. Gene gun transfection of hippocampal neurons. J Vis Exp. , (2006).
  22. Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).

Tags

Neuroscience גיליון 52 Organotypic הניאוקורטקס החושית תא פירמידלי הכנה פרוסה transfection biolistic
הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Foehring, R. C., Guan, D., Toleman,… More

Foehring, R. C., Guan, D., Toleman, T., Cantrell, A. R. Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex. J. Vis. Exp. (52), e2600, doi:10.3791/2600 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter