Всего Запись сотовый от органотипической Подготовка Кусочек Неокортекс

Summary

Это протокол для подготовки и поддержания неокортекса подготовки ломтик в органотипической культуры с целью создания электрических записей из пирамидных нейронов.

Abstract

Мы изучали выражения и функциональные роли напряжения закрытого калиевые каналы в пирамидных нейронов коры головного мозга крысы. Из-за отсутствия конкретных фармакологических средств для этих каналов, мы взяли генетический подход к манипуляциям с каналом выражения. Мы используем органотипической подготовки культура (16) в целях сохранения морфологии клеток и ламинарного структуры коры головного мозга. Как правило, мы изолировать острой неокортекса срезов на послеродовой 8-10 дней и сохранить ломтики в культуре в течение 3-7 дней. Это позволяет нам изучать нейронов на того же возраста тем, кто в нашей работе с острыми кусочками и сводит к минимуму развитие избыточных возбуждающими связями в срез. Мы записываем с визуально-определены пирамидных нейронов в слоях II / III или V с помощью инфракрасной подсветки (ИК-) и дифференциальный интерференционный контраст микроскопии (ДВС-синдром) с целыми зажим патч ячейки в текущем или напряжения зажимом. Мы используем biolistic (Gene пушка) трансфекции дикого типа или мутантного ДНК калиевого канала манипулировать выражением каналов для изучения их функции. Трансфекции клетки легко идентифицировать по epifluorescence микроскопии после совместной трансфекции кДНК зеленый флуоресцентный белок (GFP). Мы сравниваем записи трансфицированных клеток на соседние, untransfected нейронов в одном слое из того же фрагмента.

Protocol

1. Подготовка Перед Днем нарезки

Мы находим его более эффективным в автоклаве хирургических инструментов и подготовить решения до дня нарезки.

1. Автоклав инструментов. (Хирургия и нарезки выполняются под полу-стерильных условиях). Автоклав следующие пакеты, индивидуально упакованные в автоклаве бумаги:
   • Хирургия пакета: шпателем, № 22 скальпеля ручку лезвие, ножницы, пинцеты
   • Нарезки пакета: 3 ручки (лезвие-холдинг ручку и 2 ванных обеспечение ручки) и защитный кожух (вмещает лезвие от среза: Campden Vibroslice, # MA572), в индивидуальной упаковке (потому что он будет сдан в морозильник) на заказ металла камеры ( образца бане) слайсер (плексиглас производителя никто не выдержит многократного автоклавирования), кровоостанавливающего, ножницы, пинцет.
   • Стекло пакет: два стакана 50 мл и 25 мл один стакан
2. Алиготе лошадиной сыворотки (Hyclone доноров лошадей # SH 30074: Thermoscientic). Алиготе ~ 11 мл лошадиной сыворотки на 15 мл конические пробирки. (10 мл сыворотки необходимо. Потому что пузырьки образуются, когда сыворотка талой, необходимо 11 мл, из которых для аспирации требуется 10 мл). Магазин аликвоты сыворотки в морозильной камере -20 ° C.
3. Алиготе СМИ. После медиа бутылки открыты, они только стабильные в течение ~ 4 недель (из-за изменения рН). Ломтиков лучше выживают со свежими средствами массовой информации.
   • Мы используем три типа коммерчески доступных средств массовой информации (купленный в 500 мл бутылки), а также лошадиной сыворотки. СМИ: HMEM (Lonza Biowhittaker Минимальная Основные Медиа плюс HBSS и HEPES, не глютамин: Каталог # 12-137F), HBSS (GIBCO Хэнкс солевой буфер, # 24020-117), и MEM (GIBCO минимальным необходимой среде, # 12360 - 038). См. Таблицу 2.
   • Для каждого из трех типов носителей (HMEM, HBSS и MEM), аликвоту ~ 50 мл из 500 мл бутылка СМИ в каждой из четырех 50 мл конические пробирки. Парафильмом все пробирки после aliquoting. Магазин MEM в холодильнике, и хранить HMEM и HBSS при комнатной температуре.
   • Медиакультуры состоит из смеси лошадиной сыворотки, HMEM и HBSS (см. ниже, Таблицу 2). MEM используется как мытье СМИ.
4. Сделать резки Solution (табл. 3). Резка Решение состоит из (в мМ): NaCl 125, KCl 3, NaH ₂ PO ₄ 1.25, NaHCO ₃ 26, 2 мМ CaCl _2, 2 мМ MgCl ₂ и 20 мМ глюкозы. Как правило, мы составит 250 мл (довести до объема в мерную колбу). Проверьте осмоляльности (должно быть ~ 310) и рН (7.2-7.3).

Последующие шаги (# 2 и # 3) выполняются на день нарезки.

2. Хирургия, нарезки и органотипической культуре

Важно, чтобы выполнить операцию в отдельном месте против всех других процедур. Мы используем вакуумные (испарения) кожух для операции по удалению мозга. Капот ламинарного потока используется для процедур, выполняемых при полу-стерильных условиях, таких как нарезка и манипуляции ломтиками и решений.

1. Подготовка решений. (Эти процедуры не должны проводиться в стерильных условиях, что решения будут отфильтрованы на более позднем этапе.).
   1. Подготовка резки Solution (табл. 3). Bubble решение со смесью 95% O ₂ / 5% CO ₂ в течение по крайней мере, 20 минут (для стабилизации рН и убедитесь, что все соли в растворе). Добавить 1 мМ пировиноградной кислоты (метаболический ингибитор) and0.6 мМ аскорбата (антиоксидант).
   2. Оттепель 1 аликвоту лошадиной сыворотки (11 мл).
2. Подготовка ламинарном потоке (носить перчатки для всех процедур, насыщают перчатки с этанолом). В этом разделе мы готовим рабочей области, чтобы обеспечить чистую, полу-стерильной рабочей зоны. Мы также фильтр решения стерилизовать их.
   1. Использование ультрафиолетового излучения в течение ~ 1 часа для стерилизации рабочего пространства в ламинарном потоке (ультрафиолетовый свет может повредить пластиковые детали поэтому мы покрываем theCampden Vibroslice мы используем для нарезки, см. ниже). Очистите все поверхности с 70% этанола (за исключением ручки из пластика из слайсер: EtOH повредит). Также обычно присутствует под капотом ламинарного потока являются pipetter и пипец, EtOH бутылку, клей, и трубка подключена к 95% O ₂ / 5% СО ₂ и 100 O _2.
   2. Поместите следующий под капотом ламинарного потока:
      • Автоклавного нарезки пакет
      • 250 мл резки решения
      • Millipore Express Plus Фильтр: 250 мл [0,2 мкм (# SC6PU02RE) для фильтрации резки Решение]:
      • Культурное пространство компоненты:
        • 20 мл HMEM
        • 10 мл HBSS
        • 10 мл лошадиной сыворотки
      • Стекло пакета: автоклавного стаканы
      • 50 мл MEM мыть СМИ
      • Pipetter (Drummondпипетка-помощь)
      • Семь пластиковых пипеток передачи (Fisher # 13-711-20). Они используются для передачи ломтиками и решений, а также в качестве канала для газа решений (O _2, 95% O ₂ / 5% CO ₂₎ для восходящей решений и средств массовой информации.
      • Цианакрилатный клей
      • Лезвия бритвы или ножницы (резать пластик).
      • Стерильные # 22 лезвие скальпеля
      • Millicell культуре клеток вставками (0,4 мкм, 30 мкм в диаметре, # PICM 03050) 3 вставки для каждого 6-луночный планшет
      • 6-луночный планшет культуры (ов) (Corning: Costar # 3516)
   3. Фильтры подготовлено 250 мл резки Решение с помощью 250 мл Millipore фильтр (см. выше).
      Алиготе 40 мл резки раствора в 50 мл стакан. Место 40 мл аликвоту резки Решение и 210 мл оставшегося резки Решение в морозильной камере (-20 ° С). Цель состоит в использовании этих решений при слякотной смеси при ~ 4 ° C для получения мозга после удаления из черепа (40 мл на стакан), а также для резки (210 мл).
   4. Место металла нарезки камеры (покрытый бумагой автоклаве) в морозильной камере -20 ° C. Это помогает держать резки решения и головного мозга во время холодной нарезки.
   5. Подготовка культуры СМИ и введена в скважинах (Не Медиа пузырь Культура - это пена).
      • Подготовка 40 мл Медиа культура в 50 мл центрифужную пробирку пластика:
        • Смешайте 20 мл HMEM + 10 мл HBSS + 10 мл аликвоту лошадиной сыворотки (табл. 2)
        • Фильтры культуры средств массовой информации (по стерилизации), используя 50 мл Millipore steriflip 0,22 мкм фильтр (# SCGP00525).
      • Место Медиа 1,1 мл культуры на 3 диагонально расположенных скважин 6-луночного планшета (Corning: Costar # 3516 6 куста скважин культуры). Место 6-луночного планшета / Культура СМИ на 37 ° C инкубатор, по крайней мере один час.
   6. С стерильными ножницами или лезвием бритвы, сократить 4 из передачи пипец (использование для передачи ломтиками). Вырезать концы трубки используются без дальнейшей модификации для разгона газов для восходящей решений. Эти трубки подключения линий из резервуаров 95% O ₂ / 5% CO _2, или 100% O ₂ до решений.
   7. Промыть фильтр СМИ (50 мл), используя 50 мл Millipore steriflip 0,22 мкм фильтр (# SCGP00525). Место Вымойте СМИ в холодильнике.
3. Подготовка к операции. Решения должны быть готовы принять мозга после операции (вакуум капотом) и для обеспечения быстрой нарезки и подготовки к культуре (ламинарном потоке). Мы выполняем операции под вакуумом капотом. Важно, что операция осуществляется в отдельной области, чтобы сохранить волосы и жидкости организма от полу-стерильные ламинарном боксе.
   1. Подготовка средств массовой информации и решений.
      • Удалить 50 мл стакан с 40 мл резки решения из морозильника и поместить под вакуумом капот получать мозга после удаления из черепа. Налейте ~ 10 мл этого холодного Решение Резка в 25 мл стакан. Эта информация будет использоваться для транспортировки мозга ламинарным потоком капота.
      • Удалить 210 Решение резки мл из морозильника и поместить в ламинарном капот потока (для нарезки и нарезать коллекции).
      • Удалите металлические нарезки камеру от холодильника и поставить под капот ламинарного потока.
      • Пузырь как резка решений с 95% O ₂ / 5% СО ₂ (применяйте обрезанные пластиковые пипетки передачи для подключения трубки к решению).
   2. Место следующие пункты под капотом вакуумные (30 мл резки решение уже присутствует и пузырей с 95% O ₂ / 5% CO _2):
      • автоклавного 25 мл стакан
      • Автоклавного хирургические инструменты, перчатки, щипцы
   3. Удалить Вымойте СМИ из холодильника и пузырь со 100% O ₂ (использование конце сократить пипетки передачи пластиковые для подключения трубки к решению).
4. Хирургии (проводится под вакуумом капот потока). Этот шаг необходим, чтобы удалить мозг для последующей нарезки. Важно, чтобы свести к минимуму время между ущерба животному и размещение мозга в холодной, насыщенной кислородом резки Solution. Важно также, чтобы свести к минимуму травмы головного мозга. Все процедуры были одобрены уходу и использованию животных комитета, Университет Теннесси, Научного центра здоровья.
   1. Мы используем Sprague-Dawley крыс, от Р6-P17 (мы предпочитаем П8-П10). Место крысы в ​​закрытые 2-4 пластиковый контейнер L. Для анестезии, ~ 1 мл isofluorane наносится на кусочек марли расположен под пластиковой сеткой (так, что анестетик не свяжется с животными). Обезболить крысы с изофлуран, пока животное не areflexive. Пропитайте перчатки с этанолом.
   2. После крысы под наркозом, обезглавить животное с большими скальпель, и удалить мозг. Положите мозга встакан, содержащий 30 мл холодной (~ 4 ° C) раствор для резки ~ 30 сек. Тщательно передачи мозга до 25 мл стакан, чтобы свести к минимуму передачу волосы или кровь ламинарным потоком капота.
   3. Изменение перчатки (насыщение этанолом).
   4. Передача мозга в холодной резки Решение (25 мл стакан), чтобы ламинарном боксе.
5. Нарежьте мозга и подготовиться к культуре. На этом этапе мы ориентируемся мозга, удалить ненужные ткани мозга, а вырезать и собирать мозга ломтиками. Мы затем промыть ломтиками, каждый ломтик место на сетке вставки, место сетчатые вставки в 6-луночных культуры, и передачи пластин (с кусочками), чтобы инкубатор для культуры.
   1. Восток и блока мозга (удаление мозжечка и лобного полюса, сделать частичную середине сагиттальной вырезать ~ полпути от фронтальной коры конца Это позволяет одновременно резки из двух ломтиков -. По одному от каждого полушария - но все еще сохраняет как hemsipheres вместе в хвостовой конец для устойчивое основание, чтобы клей на сцене). Клей заблокирован мозга на одной сцене с цианоакрилата. Место мозга с лобной коре и сократить корональных ломтиками лобно-теменной коры. Сделать дополнительные разрезы скальпелем по мере необходимости ограничить размер среза.
   2. Место сцене с мозгом в стерилизованные металла нарезки камеры (которая прилагается к вибрирующей ткани слайсер) и заполнить ванну с ледяной, бурлящие резки Solution. Налейте ~ 30 мл оставшихся резки раствора в 50 мл стакан (для сбора ломтики в) и пузырь с 95% O ₂ / 5% СО _2.
   3. Вырезать 250-300 мкм срезов вибрирующей ткани слайсер (Campden Vibroslice # MA572: Инструменты Всемирной Precision, Сарасоте, штат Флорида, США). Место срезы в стакан, который содержит 30 мл резки Solution. Сбор число срезов вы хотите культуры (обычно 3-6), плюс несколько дополнительных.
   4. Вымойте фрагменты: Место ~ 2 Медиа мл Стирать в 35 мм блюдо пластиковой Петри. Перенесите все ломтики от резки Решение пластиковые чашки Петри с Вымойте Media. Вымойте ломтиками в 3 раза, с использованием свежих СМИ Вымойте каждый раз. Используйте отдельные пипетки передачи для передачи ломтиками, добавить средства массовой информации, и аспирация отходов решений.
   5. Передача ломтики в культуре средств массовой информации (в другом 35 мм пластиковые чашки Петри, пипетки новый перевод). Удаление вершины из упаковки для сетчатыми вставками, но оставить вставки в упаковке.
   6. Передача фрагментов из культуры Медиа сетчатыми вставками (с cuttransfer пипетки): Поместите ломтики в середине вставка (рис. 1А). Маленький кусочек культуры Медиа придет вместе с ломтиком. Использование нетронутыми пипетки передачи, удаления избытка медиа-культуры сразу после размещения срез вниз на вставке. Постарайтесь расположить часть в центре вставить (это облегчает biolistic трансфекции и делает его легче удалить часть для последующего записи).
   7. Место вставки сетки / ломтик в культуре средств массовой информации в 6-луночного планшета (рис. 1В). Будьте осторожны, чтобы предотвратить образование воздушных пузырьков под mesh.When 3 вставок / ломтики в 6-луночный планшет, место 6-луночный планшет обратно в инкубатор. Инкубируйте ломтики в 37 ° С инкубатор для ~ 1 час.
6. Трансфекции ломтиками использованием генной пушки (Bio-Rad Helios). Это может быть сделано сразу же после нарезки и размещения на сетке в 6-луночный планшет, тем не менее мы обычно инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° С для стабилизации ломтиками, а затем трансфекции клеток. Для получения подробных протоколов для принятия кДНК "пули" и с помощью генной пушки, см.. 17-22.
   1. Нагрузка пластика "картриджи", содержащий "пули". (Мы имеем в виду кДНК покрытые частицы золота, как пули. Таким образом, многие пули, содержащиеся в пластиковых "патрон".). Оставьте первое место свободное (без "патрон"). Нагрузка любой другой позиции картридж, содержащий кДНК пулями. Место держатель фильтра в генной пушки.
   2. Очистить пистолет при стрельбе ствола без каких-либо картриджа.
   3. Advance баррель на один с картриджем. Удалите 6-луночного планшета из инкубатора и место под капотом ламинарного потока. Держите пистолет чуть выше верхней части 6-луночный планшет. Держите вертикальной. Стреляйте в ~ 100 фунтов на квадратный дюйм.
   4. Advance баррель, открыто, повторить. Один выстрел на срез.
   5. После съемки, возвращение 6-луночных планшетах с ломтиками / вставки для инкубатора.
7. Культура ломтиками (Под полу-стерильных условиях). Все манипуляции с ломтиками и 6-луночных следует проводить в перчатках насыщенной этанолом и под капотом ламинарного потока, после очистки области с этанолом. Мы культуры ломтиками за различные периоды времени (как правило 2-7 дней), чтобы восстановление после острой нарезки процедуру и дать время для трансфекции, приведет к новым белком.
   1. Культура для 2-7 дней (37 ° C, 5% СО ₂₎ в инкубатор (Forma Научно модель № 3110).
   2. Замените СМИ каждый день: добавлять новые носители три незанятых скважин, заменить в инкубаторе в течение по крайней мере 1 час. Перемещение ломтик / мембраны новой скважины с этанолом очисткой изогнутых щипцов. Аспирируйтестарые СМИ. Вернуться пластины в инкубатор.

3. Запись с пирамидных клеток в срезах

Это выходит за рамки этого протокола представить подробные инструкции по методам записи целом клетки. Мы предоставляем информацию о том, как передать ломтиками для записи камеры и представить подробную информацию о нашей записи установки, тем более, что касается выявления трансфекции клеток для записи.

1. Тянем электроды из Гарвардского GC150TF-10 стекла с использованием Саттер Р-87 горизонтальных съемника. Электроды 2-6 МОм во внеклеточной решение. Электроды заполнены KMeSO ₄ внутренних (см. таблицу 3).
2. Надевайте перчатки. Удалите 6-луночного планшета из инкубатора. Под капотом ламинарным потоком, осторожно удалить один ломтик / сетка вставка с этанолом очисткой, изогнутых щипцов. Замените 6-луночный планшет в инкубаторе и передачи срез для записи от до записи области. В нашем случае это находится в другой лаборатории. Мы выполняем вставки / ломтик в крытом 35 мм блюдо пластиковой Петри. После этого шага, перчатки не должны носить (без возможности загрязнения культуры или инкубатор).
3. Срежьте мембраны с № 11 скальпеля. Отрежьте от напряжения поставляется щипцов или гибкий металлический стержень. (Это может быть необходимо завершить окончательное сокращения с ножницами). Используя пинцет, передача срез с прикрепленными сетки записи камеры на сцене Olympus BX50 WI прямой микроскоп.
4. Мы используем инструменты Axon Multiclamp 700B Усилитель и протоколы сбора данных в PClamp 10. Электрод положение контролируется с Саттер ROE-200 манипуляторов и PC-200 контроллера. Мы используем Olympus BX-50WI прямой микроскоп с ИК-ДИК оптика для визуализации пирамидных нейронов в слоях II / III или V. Мы используем одним ИК-чувствительной камерой (Olympus Oly-150 или DAGE-MTI) и ProVideo 1201B монитор для визуализации клеток в срезе. Ломтики купаются в carbogenated искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF: Таблица 3) поставляются в 2-3 мл / мин при 33 ± 1 ° C.
   Как правило, мы находим 10-50 трансфекции клеток в срезе. Клетки расположены lookingthrough микроскопе окуляр и использования epifluorescence с FITC фильтр (устанавливается на фильтр колесо в башне горы расположены над целями и под окуляр микроскопа). Это позволяет легко переключаться между ИК-ДИК и epifluorescence, чтобы определить тип клеток, что клетка трансфекции (ячейки появляется зеленый под epifluorescence и содержит пули), а также, что клетка здорова (ячейка представляет собой 3-мерное и гладкую поверхность , ядро ​​не опухшие, клетка не опухшие или сморщенным).
   Мы нацелены пирамидных нейронов в слоях II / III или V (см. рисунок 1). Пирамидальные клетки определяются наличием апикальный дендрит восхождения к слою я, многочисленные дендритных шипиков, а грушевидный сомы. Слоя определяется плотностью клеток и расположение относительно мягкая. Вообще трансфекции клеток на поверхности среза не будет здоровой. Хотя это и более трудно представить себе клетки глубоко внутри органотипической среза, чем при остром ломтиками, мы вообще можем представить себе здорового, трансфекции клетки 20-50 мкм ниже срез поверхности. Мы используем стандартные методы записи целом клетки. Мы подходим к клетке под визуальным руководством и с положительным давлением в напряжении-зажимом. Уплотнения приобретаются с нежным всасывания (с помощью шприца 1 мл) под напряжением зажимом. По достижении печать ГОм, дополнительный всасывающий применяется для ворваться в клетку. Мы затем выполнить записей в базисном или напряжения зажимом.
   В конце записи, мы проверим, что записанные ячейки зеленого цвета, содержит пулю, и заметно реагирует на негативные или позитивные давления. Для контроля за различия между ломтиками, слоев клеток, возраст на момент операции, и время в культуре, мы всегда пара наших записей трансфекции клеток с записями из untransfected клетки управления из одного слоя и расположены с 50 мкм трансфекции клеток.

4. Представитель Результаты:

Рисунок 1А показывает остро подготовлена ​​часть сидит на мембране для вставки в 6-луночный планшет для культивирования. Этот срез включает двигатель и соматосенсорной коры от крыс P10 щенка. Пиа является правом рисунке, с белого вещества и полосатого тела в левую сторону. На рисунке 1б показывает срез / мембраны хорошо, погруженных в ~ 1,1 мл медиа культуры. Наша цель в органотипической культура сохранить нормальную структуру ламинарного коры, предотвращает высыхание поверхности в культуре, и в конечном счете для получения высокой доли живых клеток в срезе через несколько дней в культуре, которые можно записать из (клетки не усохших или опухшие, минимальный опухшие клеточных ядер, блестящие и трехмерных появление клеток в ИК-ДИК оптики). Рис 1С показывает, ИК-ДИК и epifluorescence изображения слой III пирамидальных нейронов в органотипической кусочек соматосенсорной коры после 3 днейкультуры (от животного P10). Рис. 1D является epifluorescence образ различных срез, показывающий несколько слоев V клеток, трансфицированных кДНК для GFP (зеленый клеток).

На рисунке 2 показан представителю следы тока и напряжения зажим записи из слоя V пирамидальные клетки после органотипической культуры срез в течение 3 дней (P10 животных). Рисунок 2А показывает потенциал превышения действия (AP). Рисунок 2B показывает, повторные стрельбы в ответ на 2 сек, 400 мкА постоянного тока инъекции. Эти следы указывают на нормальные электрофизиологические свойства регулярные пики слой V нейрона (см. также таблицу 1). Рис 1С напряжения зажим записи из слоя V пирамидальных нейронов в присутствии 1 мкМ тетродотоксин (TTX), чтобы заблокировать напряжения закрытого Na ⁺ токов. Следы представляют собой семейство токов в ответ на напряжение 500 мс шагах от проведения потенциал -70 мВ до различных потенциалов между -90 и +70 мВ мВ (при 10 мВ между ступенями).

Рисунок 1. Органотипической культуры срез. A. Кусочек сенсомоторной коры крыс от P10 крысы на Millicell вставлять сетчатый фильтр. Пиа находится справа, глубокие белого вещества и полосатого тела в левую сторону. Средней линии находится на верхней грани. В. Три нарезать и сетчатыми вставками погруженные в ~ 1 мл культуры СМИ и помещен в несмежных скважин 6-луночного планшета (то же животное, как в). С. ИК-ДИК (вверху) и epifluoresent (нижний) слой изображения III неокортекса пирамидальной ячейки в органотипической культуры (P10 животного, 3 дня в культуре). Обратите внимание, "Пуля" видны в DIC изображения (черно-белая сфера). Д. флуоресцентные изображения из нескольких слоев нейронов V biolistic после трансфекции кДНК для GFP.

Рисунок 2. Записи из неокортекса пирамидных клеток в культуре органотипической срез. A. Действие потенциал клеточного слоя III пирамидальной (от животного P10, после 3 дней в культуре) в ответ на сверхпороговой 10 мс инжекции тока. Б. Повторные стрельбе из различных, слой V пирамидальных нейронов (P10 крысы, 3 дня в культуре) в ответ на 2 с, 400 Па инжекции тока. Это была регулярная пики нейрона. C. Напряжение зажим запись из различных слоев V пирамидальных нейронов (P10 крысы, 3 дня в культуре). 1 мкМ ТТХ присутствовал блокировать напряжения закрытого Na ⁺ током. Внешний, K ⁺ токов в ответ на семью в 500 мс напряжение шагах от проведения потенциал -70 мВ (протокол справа). Напряжения были исправлены на +10 мВ потенциала жидкостного соединения. Доступ сопротивление ~ 9 МОм. Компенсация за последовательное сопротивление или емкость мембраны была применена.

Таблица 1. Подобные электрические свойства по сравнению с контролем GFP-трансфицированных пирамидных клеток (кусочки от крыс p10; органотипической срез: 3-4 дня в пробирке). Средний + Стандартная ошибка среднего (количество клеток). RMP = мембранный потенциал покоя, Rn = входное сопротивление, А. П. = потенциала действия; Vth = порогового напряжения для AP; HW = AP ширина на половине амплитуды.

Лечение	RMP (мВ)	Rn (МОм)	А. П. амплитуда	V-ой (мВ)	HW (мс)
Контроль	-72 ± 1 (21)	119 ± 17 (11)	84 ± 2 (24)	-45 ± 1 (21)	1,7 ± 0,1 (19)
GFP только	-77 ± 1 (9)	123 ± 7 (5)	87 ± 2 (24)	-45 ± 2 (9)	2,1 ± 0,2 (7)

Таблица 2. Коммерческие СМИ. Эти средства закупаются и используются неизмененные (Их композиции доступны он-лайн от производителя).

¹ Вымойте СМИ: MEM (GIBCO # 12360)
Культурное пространство: 20 мл HMEM ¹ (Lonza Biowhittaker), + 10 мл HBSS1 (Gibco, 24020-117) + 10 мл лошади serum1 (Hyclone # SH 30074,03)

Таблица 3. Решения (концентрация в мм).

Резка Решение: 125 NaCl, 3 KCl, CaCl 2 _{2, 2} MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 20 глюкозы (рН 7,4, 310 мОсм / л).
Искусственные спинномозговой жидкости aCSF (внешней регистрации): 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl _2, MgCl ₂ 2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 20 глюкозы (рН 7,4, 310 мОсм / л).
Внутренние записи (текущий зажим): 130,5 KMeSO4, 10 KCl, 7,5 NaCl, MgCl 2 _2, 10 HEPES, 2 АТФ, ГТФ 0,2, 0,1 EGTA (рН 7,2, 285-295 мОсм / л).
Внутренние записи (напряжение-зажим): 55 KMeSO _4, 55 КОН, 2 MgCl _2, 20 HEPES, 6 креатинфосфата, 4 АТФ, ГТФ 0,5, 10 BAPTA, 0,1 leupeptin (рН 7,2, 285-295 мОсм / л).

Discussion

Мы изучали выражения и функциональные роли напряжения закрытого калиевые каналы в пирамидных нейронов коры головного мозга крысы (4, 9-11). Из-за отсутствия конкретных фармакологических средств для этих каналов, мы используем генетический подход для управления каналом выражения (1,14,15,17-19). Мы используем органотипической подготовки культуры (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Редактировался подход Stoppini и др. (16), в целях сохранения морфологии клеток и ламинарного структуры коры головного мозга. Выделим острой неокортекса срезов на 6-17 день после рождения и поддерживать ломтики в культуре в течение 2-7 дней. Это позволяет нам изучить аналогичные возрасте нейроны тем, кто в нашей работе с острыми кусочками и сводит к минимуму развитие избыточных возбуждающими связями в срез. Мы записываем от визуальный пирамидных нейронов в слоях II / III или V с помощью инфракрасной подсветки (ИК-) и дифференциальный интерференционный контраст микроскопии (ДВС-синдром) с целыми зажим патч ячейки в текущем или напряжения зажимом. Biolistic (Gene пушка) трансфекции дикого типа или мутантного калия ДНК канал используется для манипулирования выражение каналов для изучения их функции (1,14,15,17). По совместной трансфекции кДНК для GFP, трансфекции клетки легко идентифицируются при epifluorescence микроскопии. Мы сравниваем записи трансфицированных клеток на соседние, untransfected нейронов в одном слое из того же часть (1,17).

Ни одна из процедур описано здесь трудно, однако внимание на несколько деталей может значительно улучшить результаты. В наших руках, жизнеспособности клеток лучше всего, когда культур сделаны из кусочков от ~ P8-P10 животных. Важно сохранить полу-стерильных условиях в процессе резки и культивирование срезов. Чтобы предотвратить бактериальное загрязнение, мы автоклаве инструментов и чистой хирургической области УФ-светом и этанола, фильтр решений, носить перчатки и менять перчатки между удалением головного мозга и сделать ломтиками. Последствия бактериального загрязнения, включая слабые жизнеспособности тканей и необходимости обеззараживания инкубаторов. Как и у всех мозги ломтиками, жизнеспособность повышается за счет минимизации времени между жертву животных и нарезки. Мозг должен быть размещен и нарезая должно быть сделано с мозгом погруженный в ледяной взвеси резки Solution. Фрагментов на медленной скорости, с малой амплитудой горизонтальной вибрации клинка.

Другой потенциальной проблемой является высыхание ломтиками то время как в инкубаторе. Сушка может быть сведена к минимуму путем подготовки ломтиками, которые мало: ограничивается коры интересов и небольшой кусочек полосатого тела (для ориентировки). Большой ломтиками, как правило, высыхают в инкубатор и труднее получить стабильные условия записи с большими кусочками. Ломтики разрезаются на 250-300 мкм. Мы считаем, что тоньше ломтики (мы предпочитаем 250 мкм) приводит к снижению сушки. При переводе из ломтиков резки решение инкубатора, мы моем ломтиками несколько раз, сначала в Вашингтоне СМИ, а затем в культуре средств массовой информации. Важно, чтобы удалить лишнюю жидкость после перевода на мембраны (чтобы срез приложить к сетке). Для более толстых ломтиков (например, 300 мкм), ни капли Культурное ходил в верхней части среза (в то время как он сидит на мембране) помогает предотвратить высыхание. Эта процедура представляется премьер движение влажного СМИ, чтобы верхняя поверхность среза. Замена Культурное пространство через день также предотвращает высыхание и способствует жизнеспособности.

Materials

Surgery / transfection / culture: Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413) disposable supplies for Helios from Bio-Rad: 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264 Tefzel Tubing: #165-2441 Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766). Media: Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321) HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525) Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132. Recording: Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949 Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 lectrode position is controlled with Sutter R–-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North R–ske Avenue, Michigan City, IN 46360).