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Neuroscience

Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

Published: June 3, 2011 doi: 10.3791/2600
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center

Summary

Este es un protocolo para preparar y mantener una rebanada preparación neocortical en la cultura organotípicos con el propósito de realizar grabaciones eléctricas de las neuronas piramidales.

Abstract

Hemos estado estudiando el papel funcional de expresión y de voltaje canales de potasio en las neuronas piramidales de la corteza cerebral de rata. Debido a la falta de agentes farmacológicos específicos para estos canales, hemos tomado un enfoque genético para la manipulación de la expresión del canal. Utilizamos una preparación cultivo organotípico (16) con el fin de mantener la morfología celular y el patrón laminar de la corteza. Por lo general aislar aguda rebanadas neocortical en 8-10 días después del parto y mantener los cortes en la cultura durante 3-7 días. Esto nos permite estudiar las neuronas a una edad similar a los de nuestro trabajo con las rebanadas de agudos y reduce al mínimo el desarrollo de una exuberante conexiones excitadoras en el corte. Grabamos de forma visual se identifican las neuronas piramidales en las capas II / III o V con iluminación por infrarrojos (IR) y microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) con pinza de toda mancha de células en la corriente o voltaje-clamp. Usamos biolística (pistola de genes) de la transfección de tipo salvaje o mutante de ADN del canal de potasio para manipular la expresión de los canales para estudiar su función. Las células transfectadas son fácilmente identificables por microscopía de epifluorescencia después de co-transfección con ADNc para la proteína verde fluorescente (GFP). Se comparan las grabaciones de las células transfectadas con las neuronas adyacentes, untransfected en la misma capa de la misma división.

Protocol

1. Preparativos antes del Día de rebanar

Encontramos que es más eficiente para autoclave de los instrumentos quirúrgicos y de preparar las soluciones antes de la fecha de corte.

  1. Autoclave de los instrumentos. (La cirugía y el corte se realiza bajo condiciones de semi-estériles). Autoclave de los siguientes paquetes, envueltos individualmente en papel de autoclave:
    • Paquete de la cirugía: espátula, # 22 mango bisturí, tijeras, pinzas
    • Paquete de corte de 3 botones (hoja de retención de mando y dos botones de sujeción de baño) y de protección de disco (tiene una hoja de afeitar de la máquina de cortar: Campden Vibroslice, # MA572), envueltos individualmente (ya que se puso en el congelador) por encargo de cámara de metal ( muestra de baño) para máquina de cortar (plexiglás del fabricante no puede soportar tratamiento repetido en autoclave), hemostático, tijeras, pinzas.
    • Paquete de cristalería: dos vasos de 50 mL y un vaso de precipitados 25 mL
  2. Alícuotas de suero de caballo (Hyclone donantes equina # 30074 SH: Thermoscientic). Alícuota ~ 11 ml de suero de caballo en tubos de 15 ml cónicos. (10 ml de suero que se necesita. Debido a que las burbujas se forman cuando el suero se descongela, se necesitan 11 ml de la que la aspiración de los necesarios 10 ml). Tienda de alícuotas de suero en un congelador a -20 ° C.
  3. Los medios de comunicación alícuota. Después de las botellas de los medios de comunicación están abiertos, sólo son estables durante ~ 4 semanas (debido a los cambios de pH). Las rebanadas de sobrevivir mejor con medio fresco.
    • Utilizamos tres tipos de medios disponibles en el mercado (compra en botellas de 500 ml), además de suero de caballo. Los medios de comunicación son: HMEM (Lonza Biowhittaker medio esencial mínimo más HBSS y HEPES, no glutamina: Catálogo # 12-137f), HBSS (GIBCO Hanks solución salina tamponada, # 24020-117), y el MEM (GIBCO medio esencial mínimo, # 12360 - 038). Véase la Tabla 2.
    • Para cada uno de los tres tipos de medios de comunicación (HMEM, HBSS, y MEM), alícuota de ~ 50 ml de una botella de 500 ml de los medios de comunicación en cada uno de los cuatro tubos de 50 ml cónicos. Parafilm todos los tubos después de alícuotas. Tienda MEM en el refrigerador, y HMEM almacenar y HBSS a temperatura ambiente.
    • La cultura de los medios de comunicación consiste en una mezcla de suero de caballo, HMEM y HBSS (ver más abajo, Cuadro 2). MEM se utiliza como medio de lavado.
  4. Hacer corte de la solución (Cuadro 3). La solución de corte está compuesto por (en mM): NaCl 125, KCl 3, NaH 2 PO 4 1,25, NaHCO 3 26, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, y 20 mM de glucosa. Por lo general hacer 250 ml (llevar a volumen en matraz aforado). Compruebe la osmolaridad (debe ser ~ 310) y el pH (7,2 a 7,3).

Pasos posteriores (# 2 y # 3) se llevan a cabo en el día de corte.

2. Cirugía, cortado, y Cultura organotípicos

Es importante realizar la cirugía en un lugar distinto frente a todos los demás procedimientos. Nosotros usamos un vacío (humos) capucha de la cirugía para la remoción del cerebro. Una campana de flujo laminar se utiliza para los procedimientos realizados en condiciones semi-estériles condiciones, tales como corte y manipulación de sectores y soluciones.

  1. Preparar las soluciones. (Estos procedimientos no tienen que ser realizadas bajo condiciones estériles, ya que las soluciones se filtran en un paso posterior.).
    1. Prepare la solución de corte (Tabla 3). La burbuja de la solución con una mezcla de 95% O 2 / 5% CO 2 durante al menos 20 minutos (para estabilizar el pH y asegurarse de que todas las sales están en solución). Añadir 1 mM de ácido pirúvico (inhibidor metabólico) and0.6 mM ascorbato (antioxidante).
    2. Descongelar una alícuota de suero de caballo (11 ml).
  2. Prepare campana de flujo laminar (use guantes para todos los procedimientos, saturar los guantes con EtOH). En esta sección, preparar el área de trabajo para proporcionar un ambiente limpio, semi-estériles espacio de trabajo. También vamos a filtrar las soluciones para esterilizarlas.
    1. Uso de la luz UV para aproximadamente 1 hora para esterilizar el espacio de trabajo dentro de la campana de flujo laminar (luz ultravioleta puede dañar las piezas de plástico por lo que cubren theCampden Vibroslice que utilizamos para cortar, ver más abajo). Limpie todas las superficies con un 70% EtOH (excepto botones de plástico de máquina de cortar: EtOH dañará). También suelen presentar bajo la campana de flujo laminar son los pipeteador y pipetas, una botella de EtOH, pegamento y un tubo conectado a 95% O 2 / 5% CO 2 y 100 de O 2.
    2. Coloque el siguiente bajo campana de flujo laminar:
      • Paquete de autoclave corte
      • 250 ml de solución de corte
      • Millipore Express Plus filtro: 250 ml [0,2 micras filtro (# SC6PU02RE) para filtrar la solución de corte]:
      • Medios de cultivo componentes:
        • 20 ml HMEM
        • 10 ml HBSS
        • 10 ml de suero de caballo
      • Paquete de material de vidrio: Los vasos de autoclave
      • 50 ml de MEM lavado de los medios de comunicación
      • Pipeteador (Drummondpipeta de ayuda)
      • Siete pipetas de plástico (Fisher # 13-711-20). Estos se utilizan para la transferencia de las rebanadas y soluciones, así como para servir como conducto para las soluciones de gas (O 2, y el 95% de O 2 / 5% CO 2) para las soluciones de burbujas y los medios de comunicación.
      • Pegamento de cianoacrilato
      • Hoja de afeitar o tijeras (para cortar de plástico).
      • Cuchilla estéril de bisturí # 22
      • Millicell insertos de cultivo celular (0,4 m, 30 m de diámetro, # 03050 PICM) 3 insertos para cada placa de 6 pocillos
      • 6-así placa de cultivo (s) (Corning: Costar # 3516)
    3. Filtrar el preparado 250 ml de solución de corte usando un filtro Millipore de 250 ml (ver arriba).
      Alícuota de 40 ml de solución de corte en un vaso de 50 ml. Colocar la alícuota de 40 ml de solución de corte y 210 ml restantes solución de corte en el congelador (-20 ° C). El objetivo es utilizar estas soluciones como una mezcla de aguanieve en ~ 4 ° C para recibir el cerebro después de la eliminación de la calavera (40 ml en el vaso) y para el corte (210 ml).
    4. Coloque la cámara de metal de corte (cubierta con papel de autoclave) en el congelador a -20 ° C. Esto ayuda a mantener la solución de corte y el frío del cerebro durante el corte.
    5. Preparar medios de cultivo y ponen en los pozos (no los medios de comunicación burbuja Cultura - será la espuma).
      • Prepare 40 ml Medios de cultivo en 50 ml tubo de centrífuga de plástico:
        • Mezcla de 20 ml HMEM + 10 + 10 ml de HBSS alícuota ml de suero de caballo (Tabla 2)
        • Filtro de medios de cultivo (para esterilizar) con 50 ml Millipore steriflip 0,22 M filtro (# SCGP00525).
      • Coloque 1.1 mL Medios de cultivo en tres pozos espaciados en diagonal de una placa de 6 pocillos (Corning: Costar # 3516 6 de racimo y la cultura). Lugar de 6 pocillos / Medios de cultivo a 37 ° C incubadora por lo menos una hora.
    6. Con unas tijeras estériles u hoja de afeitar, acortar el 4 de pipetas de transferencia (el uso para la transferencia de cortes). Los extremos del tubo de corte se utilizan sin ninguna otra modificación para dispersar los gases de soluciones de burbujas. Estos tubos se conectan las líneas de los tanques de 95% O 2 / 5% CO 2 o el 100% de O2 a las soluciones.
    7. Filtro Lavar los medios de comunicación (50 ml) con 50 ml de Millipore steriflip 0,22 M filtro (# SCGP00525). Coloque medio de lavado en el refrigerador.
  3. Preparación para la cirugía. Las soluciones deben estar dispuestos a aceptar el cerebro después de la cirugía (campana de vacío) y para permitir un rápido corte y preparación para la cultura (campana de flujo laminar). Llevamos a cabo la operación bajo una campana de vacío. Es importante que la cirugía se realiza en un área separada para mantener los líquidos del cabello y el cuerpo lejos de la cubierta laminar semi-estériles de flujo.
    1. Prepare los medios de comunicación y soluciones.
      • Retirar el vaso de 50 ml con 40 ml de solución de corte del congelador y poner bajo el capó de vacío para recibir el cerebro después de la eliminación del cráneo. Vierta unos 10 ml de esta solución de corte en frío en un vaso de 25 ml. Esto será utilizado para el transporte de cerebro para campana de flujo laminar.
      • Retire la solución 210 ml de corte del congelador y poner en campana de flujo laminar (para rebanar y cortar la colección).
      • Retire la cámara de metal de corte del congelador y poner bajo campana de flujo laminar.
      • Burbuja tanto soluciones de corte con 95% O 5.2% de CO 2 (usar pipetas de plástico cortadas a la transferencia de conectar el tubo a la solución).
    2. Coloque los siguientes artículos bajo el capó de vacío (30 mL solución de corte ya está presente y burbujeante, con un 95% O 2 / 5% CO 2):
      • autoclave 25 vaso de precipitados
      • Autoclave instrumentos quirúrgicos, guantes, pinzas
    3. Quitar Lavar los medios de comunicación de la nevera y la burbuja con oxígeno al 100% 2 (uso final de la pipeta de transferencia de corte de plástico para conectar la tubería a la solución).
  4. La cirugía (realizada bajo el capó de vacío de flujo). Este paso es necesario para eliminar el cerebro para su posterior corte. Es importante minimizar el tiempo entre el sacrificio del animal y colocar el cerebro en la solución de frío, corte oxigenada. También es importante para minimizar el trauma al cerebro. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo de la Universidad de Tennessee, Centro de Ciencias Médicas.
    1. Utilizamos ratas Sprague-Dawley, de P6-P17 (preferimos P8-P10). Lugar rata en envase de plástico cubierta 4.2 L. Para la anestesia, aproximadamente 1 ml isofluorano se aplica a un trozo de gasa encuentra bajo una malla de plástico (para que no entre en contacto anestésico animal). Anestesiar la rata con isoflurano hasta que el animal es areflexive. Saturar los guantes con EtOH.
    2. Después de la rata es anestesiada, decapitar a los animales con grandes bisturí, y eliminar el cerebro. Puesto en el cerebrofrasco que contiene 30 ml de frío (~ 4 ° C) Solución de corte de aproximadamente 30 segundos. Con cuidado, la transferencia de cerebro para vaso de precipitados de 25 ml para minimizar la transferencia de pelo o de sangre para campana de flujo laminar.
    3. Cambie los guantes (se satura con EtOH).
    4. Transferencia de cerebros en la solución de corte en frío (25 ml vaso) de campana de flujo laminar.
  5. Cortar el cerebro y la preparación para la cultura. En este paso, nos orientamos en el cerebro, extraer el tejido cerebral que no sean necesarios, y cortar y recoger las secciones de cerebro. A continuación, lavar las rodajas, colocar cada trozo en una inserción de malla, el lugar inserciones de malla en placas de cultivo de 6 pocillos, y la transferencia de las placas (con cortes) a la incubadora para cultivo.
    1. Oriente y el cerebro de bloque (quitar el cerebelo y el polo frontal, que parcial a mediados de corte sagital ~ a medio camino entre la corteza frontal finales Esto permite el corte simultáneo de dos rebanadas -. Uno de cada hemisferio - pero todavía conserva dos hemsipheres juntos en el extremo caudal de una base estable para pegar a la etapa). Pegamento del cerebro bloqueado en el escenario con cianoacrilato. Lugar del cerebro con la corteza frontal y corte cortes coronales de la corteza frontoparietal. Hacer recortes adicionales de bisturí, según sea necesario para limitar el tamaño de la rebanada.
    2. Coloque el escenario con el cerebro en la cámara de metal esterilizados corte (que se adjunta a la máquina de cortar el tejido vibración) y rellenar con baño helado y burbujeante solución de corte. Vierta aproximadamente 30 ml de la solución restante de corte en un vaso de 50 ml (para recoger en rodajas) y la burbuja con un 95% O 2 / 5% CO 2.
    3. Cortar rodajas de 250-300 micras con una máquina de cortar el tejido vibrante (Campden Vibroslice # MA572: Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL, EE.UU.). Coloca las rebanadas en el vaso que contiene 30 ml de solución de corte. Recoge el número de sectores que desee a la cultura (generalmente 3-6), además de algunos extras.
    4. Lave Rebanadas: Coloque ~ 2 ml de medio de lavado de un plástico de 35 mm placa de Petri. La transferencia de todos los sectores a partir de la solución de corte a la placa Petri de plástico con medio de lavado. Lávese las rebanadas de 3 veces, utilizando los medios de comunicación recién lavado cada vez. Usar pipetas separadas transferencia para transferir las rebanadas, añadir los medios de comunicación, y aspirar las soluciones de los residuos.
    5. Transferencia de las rebanadas de medios de cultivo (en otro 35 mm plato Petri de plástico, pipeta de transferencia nuevo). Retire las tapas de los envases para las inserciones de malla, pero deje los insertos en el envase.
    6. Rebanadas de transferencia del medio de cultivo a las inserciones de malla (con cuttransfer pipeta): rebanadas de posición en el centro de la pieza (Figura 1). Un pequeño fragmento de medios de cultivo se vienen junto con la división. Usando una pipeta de transferencia intacta, retire el exceso de medios de cultivo inmediatamente después de la colocación de corte hacia abajo en la inserción. Trata de colocar corte en el centro de inserción (lo que facilita la transfección biolística y hace que sea más fácil quitar la parte de grabación más adelante).
    7. Colocar malla de insertar / corte en medios de cultivo en placa de 6 pocillos (fig. 1B). Tenga cuidado para evitar la formación de burbujas de aire bajo el mesh.When 3 inserciones / cortes están en la placa de 6 pocillos, lugar de 6 y la placa posterior en la incubadora. Incubar las rebanadas en incubadora a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora.
  6. Transfectar rebanadas con pistola de genes (Bio-Rad Helios). Esto se puede hacer inmediatamente después del corte y la colocación de malla en placa de 6 pocillos, sin embargo, normalmente se incuba durante 1 hora a 37 º C para estabilizar las rebanadas y luego transfectar las células. Para los protocolos de detalle para la toma de cDNA "balas" y el uso de la pistola de genes, ver Refs. 17-22.
    1. De carga de plástico "cartidges" contener "las balas". (Nos referimos a las partículas de oro recubiertas de cDNA como balas. Por lo tanto, muchas balas están contenidos en una bolsa de "cartucho".). Deje la primera posición libre (no "cartucho"). Carga cualquier otra posición con un cartucho que contiene cDNA balas recubiertas. Lugar en el soporte del cartucho de pistola de genes.
    2. Claro por el disparo de arma de fuego de cañón con ningún cartucho.
    3. Avanzar a un barril con un cartucho. Quitar los 6 y placas de la incubadora y bajo la campana de flujo laminar. Sostenga la pistola justo por encima de la parte superior de la placa de 6 pocillos. Mantenga vertical. Dispara a ~ 100 psi.
    4. Barril de antemano, claro, repetir. Un tiro por rebanada.
    5. Después de disparar, placas de 6 pocillos con rodajas / inserciones a la incubadora.
  7. Rebanadas de Cultura (Bajo semi-estériles condiciones). Todas las manipulaciones de los cortes y las placas de 6 pocillos debe realizarse con guantes saturado con EtOH y bajo la campana de flujo laminar, después de limpiar la zona con EtOH. Nos cultura las rebanadas de diferentes períodos de tiempo (generalmente 2-7 días) para permitir la recuperación del procedimiento de corte de agudos y dar tiempo para la transfección de conducir a una nueva proteína.
    1. Cultura de 2-7 días (37 ° C, 5% CO 2) en la incubadora (Forma Scientific modelo # 3110).
    2. Vuelva a colocar los medios de comunicación todos los días: añadir un nuevo soporte para los tres pozos de desocupados, sustituir en la incubadora por lo menos 1 hora. Mueva rebanada / membrana y nuevos con EtOH-limpiar pinzas curvas. Aspiradolos viejos medios. Vuelva a colocar a la incubadora.

3. Registro de las células piramidales en rebanadas

Está más allá del alcance de este protocolo para proporcionar instrucciones detalladas sobre todo las técnicas de grabación de la célula. Ofrecemos información sobre cómo transferir las rebanadas a la cámara de registro y los detalles de nuestro registro de puesta en marcha, especialmente en lo que se refiere a la identificación de las células transfectadas para la grabación.

  1. Tiramos electrodos de Harvard GC150TF-10 con un vaso Sutter P-87 extractor horizontal. Los electrodos son 2.6 mW en la solución extracelular. Los electrodos se llena con un KMeSO 4 en la residencia (ver tabla 3).
  2. Use guantes. Quitar los 6 y placas de la incubadora. Bajo la campana de flujo laminar, retire con cuidado un trozo de malla / inserción con EtOH-limpieza, pinzas curvas. Vuelva a colocar la placa de 6 pocillos en la incubadora y la transferencia de la porción que se registran desde la zona de grabación. En nuestro caso, esto es en un laboratorio diferente. Nos dedicamos a la inserción / rebanada en un plato cubierto de plástico 35 mm Petri. Después de este paso, los guantes no tienen que ser usados ​​(sin posibilidad de contaminación de cultivos o incubadora).
  3. Cortar la membrana con bisturí # 11. Corte en contra de la tensión suministrada por fórceps o barra de metal flexible. (Puede que sea necesario para terminar los últimos cortes con unas tijeras). El uso de pinzas, la transferencia en el sector con malla conectada a la cámara de grabación en el escenario de un microscopio Olympus BX50 WI vertical.
  4. Nosotros usamos un Axon Instruments amplificador MultiClamp 700B y protocolos de adquisición de datos en pCLAMP 10. Posición de los electrodos se controla con Sutter ROE-200 manipuladores y el controlador PC-200. Nosotros usamos una Olympus BX-50WI microscopio vertical con IR-DIC óptica para visualizar las neuronas piramidales en las capas II / III o V. Nosotros usamos una sola cámara IR-sensibles (Olympus OLY-150 o DAGE MTI) y el monitor para visualizar ProVideo 1201B las células de la división. Los sectores se bañó en carbogenated líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF: Tabla 3) entrega de 2-3 ml / min a 33 ± 1 ° C.
    Por lo general, nos encontramos con 10-50 células transfectadas por rebanada. Las células se encuentran por lookingthrough el ocular del microscopio y el uso de epifluorescencia con un filtro FITC (montado en una rueda de filtros en un montaje de la torreta situada por encima de los objetivos y por debajo de la lente del microscopio). Esto nos permite cambiar fácilmente entre IR-DIC y de epifluorescencia para determinar el tipo de células, que la célula es transfectada (celda aparece verde bajo epifluorescencia y contiene una bala), y que la célula está sana (celular es de 3 dimensiones y tiene una superficie lisa , el núcleo no hinchada, no de células inflamadas o encogido).
    Nos dirigimos a las neuronas piramidales en las capas II / III o V (ver Figura 1). Las células piramidales se identifican por la presencia de una dendrita apical ascendente hacia la capa I, numerosas espinas dendríticas, y el soma en forma de pera. Capa se determina por la densidad celular y la ubicación en relación con el PIA. Las células transfectadas en general en la superficie del corte no será saludable. Aunque es más difícil de visualizar las células en lo profundo de parte de organotípicos con rodajas aguda, por lo general, puede visualizar las células sanas, transfectadas 20-50 micras por debajo de la superficie de corte. Utilizamos los métodos estándar de grabación de toda la célula. Nos acercamos a la celda bajo la guía visual y con presión positiva en el voltaje-clamp. Los sellos se adquieren con una succión suave (con jeringa de 1 ml), bajo voltaje-clamp. Al cumplir un sello GΩ, aspiración adicional se aplica a la ruptura de la célula. A continuación, realizar grabaciones en cualquier corriente o voltaje-clamp.
    Al final de la grabación, se verifica que la célula registrado es de color verde, contiene una bala, y visiblemente responde a la presión negativa o positiva. Para controlar la variación entre cortes, capas de células, la edad al momento de la cirugía, y el tiempo en la cultura, siempre par nuestras grabaciones de las células transfectadas con las grabaciones de las células control no transfectadas de la misma capa y situado a 50 m de la célula transfectada.

4. Los resultados representativos:

La figura 1A muestra una porción sumamente preparado sentado en la membrana para su inserción en una placa de 6 pocillos para el cultivo. Este sector incluye la corteza somatosensorial y motora de una rata P10 cachorro. El PIA es a la derecha de la figura, con la materia blanca y el cuerpo estriado a la izquierda. Figura 1B muestra el corte / la membrana en el pozo, inmerso en ~ 1.1 Medios de cultivo ml. Nuestra meta para el cultivo organotípico es conservar el patrón laminar normal de la corteza, evitar secado de la superficie durante el cultivo, y en última instancia, para producir un alto porcentaje de células vivas en el corte después de varios días en la cultura que se puede grabar a partir de (células no contraído o núcleos hinchados, un mínimo de células inflamadas, el aspecto brillante y tres dimensiones de las células en el IR-DIC óptica). Figura 1C muestra imágenes IR-DIC y de epifluorescencia de una capa de neuronas piramidales III en una rebanada organotípicos de la corteza somatosensorial después de 3 días encultura (de animal P10). Figura 1D es una imagen de epifluorescencia de un sector diferente, que muestra varias células de la capa V transfectadas con cDNA de GFP (células verdes).

La figura 2 muestra las huellas representante de la corriente y tensión de la abrazadera, las grabaciones de una capa de células piramidales V después de la cultura rebanada organotípicos durante 3 días (P10 animal). Figura 2A muestra un potencial de acción overshooting (AP). La Figura 2b muestra disparos repetitivos en respuesta a un 2 s, la inyección de 400 pA de corriente constante. Estos rastros indican las propiedades electrofisiológicas normales de una capa de neuronas de adición regular de V (ver Tabla 1). La figura 1C es una grabación de voltaje-clamp de una neurona piramidal de la capa V, en presencia de tetrodotoxina M 1 (TTX) para bloquear el voltaje corrientes de Na +. Las huellas son una familia de corrientes en respuesta a 500 pasos de voltaje de ms de un potencial de mantenimiento de -70 mV a varios potenciales entre -90 mV y 70 mV (a 10 mV entre los pasos).

Figura 1
Figura 1. Cultura rebanada organotípicos. A. Rebanada de rata sensoriomotoras corteza de rata P10 en el inserto Millicell malla del filtro. Pia es la materia derecha, en el fondo blanco y el cuerpo estriado a la izquierda. La línea media está en el borde superior. B. Tres inserciones de malla de corte y sumergidos en medios de cultivo ~ 1 ml y se colocan en pozos adyacentes, de 6 y placa (el mismo animal, como en A). C. IR-DIC (superior) y epifluoresent (inferior) imágenes de la capa III neocortical células piramidales de la cultura organotípicos (P10 animales, 3 días en la cultura). Tenga en cuenta "bala" visible en la imagen DIC (esfera negro). D. fluorescentes imagen de varias capas neuronas V después de la transfección biolística con cDNA de GFP.

Figura 2
Figura 2. Las grabaciones de neocortical células piramidales de la cultura rebanada organotípicos. A. Potencial de acción en el nivel III de células piramidales (de animal P10, después de 3 días de cultivo) en respuesta a la inyección de 10 ms por encima del umbral actual. B. repetitivos disparando desde una perspectiva diferente, la capa de neuronas piramidales V (P10 rata, 3 días en la cultura) en respuesta a un 2 s, 400 por inyección pA actual. Esta fue una neurona normal remate. C. voltaje-clamp registro de una capa de diferentes neuronas piramidales V (P10 rata, 3 días en la cultura). 1 TTX M estuvo presente para bloquear el voltaje de Na + actual. Hacia el exterior, corrientes de K + en respuesta a una familia de 500 pasos de tensión ms de un potencial de mantenimiento de -70 mV (protocolo de la derecha). Tensiones fueron corregidos por un potencial de 10 mV unión líquida. Resistencia de acceso se ~ 9 mW. No hay compensación por la resistencia en serie o capacitancia de la membrana se utilizó.

Tabla 1. Similares propiedades eléctricas de control frente a las buenas prácticas agrarias-transfectadas las células piramidales (rodajas de rata p10; organotípicos de corte: 3-4 días in vitro). Media ± error estándar de la media (número de células). RMP = potencial de membrana en reposo, Rn = resistencia de entrada, AP = potencial de acción; V = umbral de tensión de AP, HW = ancho de AP a la mitad de la amplitud.

Tratamiento RMP (mV) Rn (MW) AP amplitud V (mV) HW (ms)
Control -72 ± 1 (21) 119 ± 17 (11) 84 ± 2 (24) -45 ± 1 (21) 1,7 ± 0,1 (19)
GFP sólo -77 ± 1 (9) 123 ± 7 (5) 87 ± 2 (24) -45 ± 2 (9) 2,1 ± 0,2 (7)

Tabla 2. Medios de comunicación comerciales. Estos medios son comprados y usados ​​sin ninguna modificación (Sus composiciones están disponibles on-line del fabricante).

1 Lavar los medios de comunicación: MEM (GIBCO # 12360)
Medios de cultivo: 20 ml HMEM 1 (Lonza Biowhittaker), + 10 ml HBSS1 (Gibco, 24020-117) + 10 ml caballo serum1 (Hyclone # SH 30.074,03)

Tabla 3. Soluciones (concentración en mM).

Solución de corte: 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 de NaHCO 3, 20 glucosa (pH 7,4, 310 mOsm / L).
Artificial líquido cefalorraquídeo LCRa (grabación externa): 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 de NaHCO 3, 20 glucosa (pH 7,4, 310 mOsm / L).
Grabación interna (actual-clamp): 130,5 KMeSO4, 10 KCl, NaCl 7,5, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 ATP, GTP 0,2, 0,1 EGTA (pH 7,2, 285 a 295 mOsm / L).
Grabación interna (voltaje-clamp): 55 KMeSO 4, 55 KOH, 2 MgCl 2, 20 HEPES, 6 fosfato de creatina, 4 ATP, GTP 0,5, 10 BAPTA, leupeptina 0,1 (pH 7,2, 285-295 mOsm / L).

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Discussion

Hemos estado estudiando el papel funcional de expresión y de voltaje canales de potasio en las neuronas piramidales de la corteza cerebral de rata (4, 9-11). Debido a la falta de agentes farmacológicos específicos para estos canales, se utiliza un enfoque genético para la manipulación de la expresión del canal (1,14,15,17-19). Utilizamos una preparación de la cultura organotípicos (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modificada del enfoque de Stoppini et al (16), a fin de mantener la morfología celular y el patrón laminar de la corteza. Aislamos aguda rebanadas neocortical en los días 6-17 después del parto y mantener los cortes en la cultura de 2-7 días. Esto nos permite estudiar las neuronas de edad similares a los de nuestro trabajo con las rebanadas de agudos y reduce al mínimo el desarrollo de una exuberante conexiones excitadoras en el corte. Grabamos de identificar visualmente las neuronas piramidales en las capas II / III o V con iluminación por infrarrojos (IR) y la interferencia de microscopía de contraste diferencial (DIC) con pinza de toda mancha de células en la corriente o voltaje-clamp. Biolística (pistola de genes) de la transfección de tipo salvaje o mutante de ADN del canal de potasio se utiliza para manipular la expresión de los canales para estudiar su función (1,14,15,17). Por la co-transfección con ADNc de las buenas prácticas agrarias, las células transfectadas se identifican fácilmente bajo el microscopio de epifluorescencia. Se comparan las grabaciones de las células transfectadas con las neuronas adyacentes, untransfected en la misma capa de la misma división (1,17).

Ninguno de los procedimientos cubiertos aquí son difíciles, sin embargo la atención a algunos detalles puede mejorar los resultados. En nuestras manos, la viabilidad celular es mejor cuando las culturas están hechas de trozos de ~ P8-P10 animales. Es importante mantener las condiciones de semi-estériles durante el corte en lonchas y el cultivo de las rebanadas. Para evitar la contaminación bacteriana, que autoclave de los instrumentos y limpiar el área quirúrgica con luz UV y EtOH, las soluciones de filtro, use guantes y cambiarse los guantes entre la extracción del cerebro y las rodajas de decisiones. Las consecuencias de la contaminación bacteriana incluyen la viabilidad del tejido pobres y la necesidad de descontaminar las incubadoras. Al igual que con todos los cortes de cerebro, la viabilidad es al minimizar el tiempo entre el sacrificio del animal y corte. El cerebro debe ser colocado y el corte se debe hacer con el cerebro sumergido en una mezcla helada de la solución de corte. Cortar a baja velocidad, con baja amplitud de oscilación horizontal de la hoja.

Otro problema potencial es el secado de rodajas de tiempo en la incubadora. El secado puede ser minimizado mediante la preparación de secciones que son pequeñas: restringido a la corteza de interés y un trozo pequeño de cuerpo estriado (para fines de orientación). Rebanadas grandes tienden a secar en la incubadora y es más difícil de conseguir unas condiciones estables de grabación con las rebanadas grandes. Rodajas se cortan a 250-300 m de espesor. Nos encontramos con que cortes más delgados (preferimos 250 micras) se traducen en menos de secado. Al transferir las rebanadas de la solución de corte a la incubadora, nos lavamos las rodajas en varias ocasiones, por primera vez en medio de lavado y en medios de cultivo. Es importante para eliminar el exceso de líquido después de la transferencia a la membrana (para permitir la división para conectar a la malla). De rodajas más gruesas (por ejemplo, a 300 m), una sola gota de cultura de los medios de ritmo en la parte superior del corte (mientras está sentado en la membrana) ayuda a evitar que se sequen. Este procedimiento parece primordial del movimiento de papel húmedo en la superficie superior de la división. Sustitución de los medios de cultivo cada dos días también impide el secado y promueva la viabilidad.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Mayumi Sakuraba y Foehring Rebecca de asistencia técnica excepcional. Además, nos gustaría agradecer a los Dres. Rodrigo Andrade para la asistencia en la implementación de la cultura rebanada organotípicos y protocolos de transfección biolística y la Dra. Jeanne Nerbonne por darnos construcciones de ADNc para la transfección. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención: NS044163 del NINDS (a RCF).

Materials

Surgery / transfection / culture:

  1. Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
  2. Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
    • Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
    • Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
    • disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
      • 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
      • Tefzel Tubing: #165-2441
  3. Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766).

Media:

  1. Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
  2. HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  3. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  4. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  5. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
  6. Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
  7. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)

Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.

Recording:

  1. Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
  2. Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
  3. Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  4. PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  5. lectrode position is controlled with Sutter R–-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
  6. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
  7. IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North R–ske Avenue, Michigan City, IN 46360).

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References

  1. Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).
  2. Buonomano, D. V. Timing of neural responses in cortical organotypic slices. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).
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  21. Joshi, P., Dunaevsky, A. Gene gun transfection of hippocampal neurons. J Vis Exp. , (2006).
  22. Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).

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Foehring, R. C., Guan, D., Toleman, T., Cantrell, A. R. Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex. J. Vis. Exp. (52), e2600, doi:10.3791/2600 (2011).

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