Summary
एक कुशल माउस वृषण से उच्च शुद्ध व्यवहार्य meiotic भिन्न प्राप्त वर्णित विधि है, जो फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के साथ एक परिष्कृत सेल हदबंदी प्रोटोकॉल को जोड़ती है. इस विधि डीएनए सामग्री और परमाणु असतत meiotic भिन्न के घनत्व में अंतर का लाभ लेता है.
Abstract
वृषण में सेल प्रकार की विषम प्रकृति और meiotic सेल संस्कृति मॉडल के अभाव अद्वितीय भेदभाव प्रोग्राम है कि अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान प्रकट कर रहे हैं का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण बाधाओं किया गया है. Elutriation या Staput (अवसादन) BSA और / या percoll gradients है का उपयोग: दो प्रमुख तरीके डिग्री बदलती करने के लिए शुद्ध, दोनों वयस्क और अपरिपक्व जानवरों से विभिन्न meiotic भिन्न विकसित किया गया है. इन तरीकों के दोनों सेल आकार और घनत्व meiotic कोशिकाओं 1-5 अलग पर भरोसा करते हैं. कुल मिलाकर, कुछ सेल 6 आबादी के लिए छोड़कर, इन प्रोटोकॉल के लिए कई meiotic सेल आबादियों कि विस्तृत आणविक विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं के लिए पर्याप्त शुद्धता उपज असफल. इसके अलावा, इस तरह के तरीकों के साथ आमतौर पर meiotic कोशिकाओं की एक प्रकार एक निश्चित समय है, जो reproducibility और समरूपता के बारे में जब meiotic सेल के नमूने की तुलना जटिलता के एक अतिरिक्त स्तर कहते हैं शुद्ध किया जा सकता है.
यहाँ, हम एक परिष्कृत विधि का वर्णन है कि एक आसानी से कल्पना करने के लिए की पहचान, और meiotic कोशिकाओं को शुद्ध की अनुमति देता, जर्म कोशिकाओं से गोल spermatids, Hoechst धुंधला 33,342 7,8 के साथ संयुक्त FACS का उपयोग कर. इस विधि पूरे meiotic की प्रक्रिया का एक समग्र स्नैपशॉट प्रदान करता है और एक अत्यधिक अर्धसूत्रीविभाजन के सबसे मंच से व्यवहार्य कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए अनुमति देता है. ये शुद्ध कोशिकाओं तो कि अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से प्रगति के साथ, उदाहरण के जीन अभिव्यक्ति 9,10 में परिवर्तन और nucleosome अधिभोग की गतिशीलता के लिए meiotic पुनर्संयोजन 11 के आकर्षण के केंद्र में आणविक परिवर्तन के लिए विस्तार में विश्लेषण किया जा सकता है.
Protocol
इस प्रोटोकॉल के दो प्रमुख चरणों में विभाजित किया जा सकता है: (1) माउस वृषण कोशिकाओं की हदबंदी और Hoechst 33342 धुंधला द्वारा के बाद, यदि आवश्यक हो, (2) अर्धसूत्रीविभाजन के सभी चरणों सहित प्रासंगिक meiotic भिन्न, छँटाई जर्म कोशिकाओं से, FACS दौर spermatids. एक बार एकत्र, इन अत्यधिक समृद्ध meiotic आबादी विश्लेषण की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल एक वयस्क वृषण के पृथक्करण का वर्णन; मात्रा किशोरों के लिए या अतिरिक्त testes के लिए तदनुसार अनुकूलित कर सकते हैं.
1. वृषण हदबंदी
- 15 मिलीलीटर की एक ट्यूब में एक Decapsulated वृषण रखें.
- Gey बैलेंस नमक समाधान के 3 मिलीलीटर (GBSS) यू 120 / Collagenase प्रकार मैं के मिलीलीटर युक्त जोड़ें
- DNase मैं (1mg/ml 50% ग्लिसरॉल में शेयर समाधान) के 10 μl जोड़ें और यह सख्ती हाथ से जब तक आप देख वृषण के लिए अलग कर देना शुरू tubules हिला.
- 33 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 120 rpm के एक अधिकतम पर क्षैतिज आंदोलन
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए खड़ी छानना और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- 1,5 करने के लिए 1,2 चरणों को दोहराएँ.
- Collagenase प्रकार मैं, एक 50mg/ml trypsin शेयर 1mm एचसीएल समाधान, और DNase मैं (1mg/ml) के 10 μl में resuspended समाधान के 50 μl, युक्त GBSS के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें और ट्यूब कई बार पलटना.
- 33 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 120 rpm के एक अधिकतम पर क्षैतिज आंदोलन
- विस्तृत छिद्र के साथ प्लास्टिक डिस्पोजेबल पाश्चर pipet का प्रयोग, पिपेट धीरे ऊपर और नीचे 3 min.No clumps के लिए इस बिंदु पर दिखाई होना चाहिए.
- Trypsin के 30 μl, DNase मैं, 33342 Hoechst के 40 μl DMSO में resuspended (10 मिलीग्राम / एमएल) की 10 μl जोड़ें और ट्यूब कई बार पलटना.
- 33 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 120 rpm के एक अधिकतम पर क्षैतिज आंदोलन
- भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के 400 μl को जोड़ें और inverting द्वारा मिश्रण करने के लिए trypsin निष्क्रिय.
- अंतिम धुंधला 33342 Hoechst के 50 μl DMSO (10 मिलीग्राम / एमएल) में resuspended, और DNase मैं (1 मिलीग्राम / एमएल) की 10 μl जोड़कर किया जाता है.
- 33 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 120 rpm के एक अधिकतम पर क्षैतिज आंदोलन
- dissociated वृषण नमूना तो दो 40-सुक्ष्ममापी GBSS के माध्यम से पारित हो जाता है एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर पूर्व गीला डिस्पोजेबल फिल्टर, तो propidium आयोडाइड के 5 μl (PI) समाधान जोड़ी जाती है और डिस्पोजेबल पाश्चर के साथ कई बार pipetting द्वारा नमूना धीरे मिश्रित है विंदुक.
- नमूना एक 18 गेज सुई के माध्यम से एक प्लास्टिक की 5 मिलीलीटर सिरिंज को सौंप दिया है. बाद नमूना प्रसव के लिए एक 22 गेज सुई के द्वारा बदल दिया है. सिरिंज बर्फ पर संग्रहीत है और FACS प्रसंस्करण के लिए तैयार है जब तक प्रकाश से सुरक्षित है.
2. FACS सेटअप और शोधन
- छंटनी एक Becton Dickinson Aria IIu सेल सॉर्टर पर प्रदर्शन किया गया था. वर्णित शर्तों इसलिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, खासकर जब विभिन्न उपकरणों का उपयोग कर. हम स्थितियों पहले से इस्तेमाल किया 7,8 वर्णित.
- Aria IIu के बाद से एक यूवी लेजर नहीं है, हम Hoescht इसके अलावा में एक 405nm वायलेट लेसर हम आगे और पक्ष स्कैटर पता लगाने के लिए एक 488nm नीले लेजर का इस्तेमाल का उपयोग धुंधला पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल रूपांतरित किया. इसके अलावा, कुछ फिल्टर के क्रम में कुछ लाल लेजर सुधार बिखरे साजिश तीखेपन में जिसके परिणामस्वरूप leakiness सीमा संशोधित किया गया है.
- वायलेट लेसर Hoescht ब्लू उत्सर्जन का पता लगाने के लिए एक 450/40nm बैंड पास और Hoescht लाल उत्सर्जन के लिए एक 585/42nm बैंड पास के साथ विन्यस्त किया गया था. एक 502nm लंबे पारित करने के लिए लाल प्रतिदीप्ति से नीले अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
- एक 100 सुक्ष्ममापी नोक 28,000 बूँदें / दूसरा एक बूंद ड्राइव आवृत्ति के साथ इस्तेमाल किया गया था. नमूना दहलीज दर लगभग 4000 / घटनाओं दूसरा था. तापमान नियंत्रण विकल्प 4 में नमूना संग्रह और ट्यूबों को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था सी छँटाई की पूरी अवधि °. इसके अतिरिक्त, नमूना आंदोलन सुविधा 200 rpm पर इस्तेमाल किया गया था सॉर्ट भर sedimenting से नमूना को रोकने के.
- आमतौर पर, दो से तीन testes 6 घंटे सॉर्ट प्रति प्रोसेस किया गया प्रत्येक आबादी के लिए 0.5-2.0x10 6 कोशिकाओं (प्रतिनिधि अनुभाग देखें) के संग्रह की अनुमति .
- नमूना 750μl लगभग aliquots सिरिंज से तिरस्कृत में हल किया गया था. इस बीच, इन pauses के दौरान संग्रह ट्यूबों 4 में रखा गया था डिग्री सेल्सियस, प्रकाश से सुरक्षित है, और धीरे से पहले शुरू करने सॉर्ट करने के लिए मिश्रित.
- सॉर्ट किया गया नमूने एक 12x75mm कांच borosilicated संग्रह 250μl DMEM युक्त ट्यूब के साथ पूरक 10% FCS में एकत्र किए गए थे.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
एक ठेठ FACS प्रोफ़ाइल चित्र 1 में दिखाया गया है. अर्धसूत्रीविभाजन के प्रमुख चरणों के सभी की पहचान की और कथा में संकेत हैं. यदि Hoechst 33342 दाग इष्टतम नहीं है, वैश्विक प्रोफ़ाइल अधिक कॉम्पैक्ट दिखाई देते हैं और कम परिभाषित. एक आम समस्या जोड़ने पर्याप्त DNase, जो तेजी से सेल clumping को प्रेरित करेगा संबंध नहीं है. अतिरिक्त DNase के सभी चरणों में दोषी पाया अलावा आम तौर पर इस समस्या को हल करती है. रुक वेंDNase शेयर (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) के awing एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए, एंजाइम गतिविधि के तेजी से नुकसान में यह परिणाम के रूप में,.
Spo11 meiotic endonuclease कि meiotic पुनर्संयोजन 12 के आकर्षण के केंद्र के स्थलों पर डबल भूग्रस्त टूटता निर्देश चित्रा 2 है. एक Spo11 अशक्त वृषण जहां डबल भूग्रस्त को तोड़ने का गठन नहीं कर रहे हैं के विशिष्ट प्रोफाइल, एक निष्फल 12 अर्धसूत्रीविभाजन में जिसके परिणामस्वरूप, और साथ ही एक से पता चलता है एक 13 दिन पुरानी माउस, जो अर्धसूत्रीविभाजन की यह पहली लहर के अतुल्यकालिक प्रकृति का पता चलता है की पूर्व puberous प्रोफ़ाइल. मंच मानक cytogenetic synaptonemal जटिल 3 प्रोटीन (SCP3) और phosphorylated histone H2AX एंटीबॉडी के संयोजन का उपयोग करते हुए विश्लेषण विशिष्ट अर्धसूत्रीविभाजन मार्करों शुरू होने के लिए पवित्रता और सॉर्ट किया गया meiotic कोशिकाओं की प्रकृति के रूप में वर्णित elswhere 11 की पुष्टि किया जाना चाहिए.
चित्रा 1 जंगली प्रकार अर्धसूत्रीविभाजन FACS प्रोफाइल.. ए) प्रतिनिधि तितर बितर साजिश दिखाया गया है. gated कोशिकाओं दिखाए जाते हैं. मलबे के बड़े वयस्क ज्यादातर खाली झिल्ली और spermatid पूंछ युक्त वृषण में मौजूद राशि का नोट. बी) के एक प्रतिनिधि PI साजिश PI सकारात्मक एक नमूने में मौजूद कोशिकाओं की बहुत सीमित मात्रा से पता चलता है. ठेठ गेट दिखाया गया है. सी) एक प्रतिनिधि जंगली प्रकार Hoechst 33342 FACS प्रोफ़ाइल दिखाया गया है. विभिन्न meiotic सेल आबादी है कि आगे के अध्ययन के लिए इस पद्धति का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है संकेत कर रहे हैं: (सपा) spermatogonia, पूर्व leptotene (pl), leptotene zygotene (एल / Z), प्रारंभिक Pachytene (EP), मध्यम Pachytene ( सांसद) देर Pachytene (LP) (डी) diplotene, और दौर spermatids (राज्यसभा).
चित्रा 2 Spo11 अशक्त और जंगली प्रकार दिन 13 meiotic FACS प्रोफाइल. ए) एक ठेठ प्रोफ़ाइल Spo11 - अशक्त एक स्पष्ट meiotic विफलता है, जहां / leptotene zygotene जल्दी pachytene अतीत नहीं स्तर का पता लगाया जा सकता है के साथ दिखाया गया है. बी) एक 13 दिन पुरानी जंगली प्रकार पुरुष माउस का प्रोफ़ाइल leptotene / zygotene कोशिकाओं की उच्च एकाग्रता से पता चलता है. अर्धसूत्रीविभाजन की यह पहली लहर बल्कि अतुल्यकालिक है, के रूप में स्पष्ट रूप से इस पद्धति का उपयोग कल्पना.
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Discussion
प्रोटोकॉल के साथ साथ प्रस्तुत एक साथ वयस्क नर चूहों से बहुत उच्च शुद्धता के साथ meiotic चरण कोशिकाओं की संपूर्ण रेंज शुद्ध जांचकर्ताओं इस मौलिक प्रक्रिया की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है की अनुमति देता है. शुद्ध कोशिकाओं आरएनए 9,10 निष्कर्षण, nucleosome मानचित्रण 11, पुनः संयोजक अणु का पता लगाने, प्रोटीन विश्लेषण, और कई और अधिक से लेकर कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, तरीकों का पता लगाने meiotic शुद्ध कोशिकाओं की राशि के लिए अनुकूलित किया जा है. इसके अलावा, इस पद्धति के उच्च reproducibility के साथ, यह पूल ही अलग अलग दिनों पर प्रदर्शन के लिए एक विशेष प्रयोग के लिए आवश्यक सामग्री की राशि में वृद्धि अंश के कई स्वतंत्र प्रकार संभव है. इसके अलावा, इस पद्धति को पूरे meiotic प्रक्रिया का एक अनूठा दृश्य प्रतिनिधित्व है, जो एक तेजी से आनुवंशिक पीटा, विकास प्रगति विपथन, या किसी विशेष अर्धसूत्रीविभाजन को प्रभावित करने के उद्देश्य से उपचार (जैसे, विकिरण के प्रभाव के प्रभाव का आकलन करने के लिए अनुमति देता है के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करता है, या छोटे अणु inhibitors के साथ इलाज).
इस प्रोटोकॉल में गंभीर कदम (i) के पर्याप्त DNase, जो बहुत सेल clumps और समुच्चय से बचने के द्वारा सेल छँटाई की सुविधा और (ii) संगत Hoechst 33342 धुंधला कि करने के लिए कुशलतापूर्वक meiotic चरण कोशिकाओं के विभिन्न आबादी भेद आवश्यक है का उपयोग कर रहे हैं. इसके अलावा, FACS ऑपरेटर खुद को विशेष meiotic सेल छँटाई और peculiarities के साथ परिचित क्रम में बेहतर चित्रा 1 और वीडियो में विस्तृत में दिखाया प्रोफाइल प्राप्त करने के अपने साधन सेटअप चाहिए. एक संभव संशोधन के नए Vybrant DyeCycle दाग वायलेट (Invitrogen) कि वायलेट लेसर के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है के साथ 33342 Hoechst विकल्प हो सकता है. हालांकि, समग्र प्रोफ़ाइल काफी बदल नहीं किया जा उम्मीद होगी. अंत में, यह भी महत्वपूर्ण है ध्यान दें करने के लिए कि इस्तेमाल ऊतक की प्रकृति के कारण, एक ठेठ प्रक्रिया 1 ले आधा घंटा सेल प्रकार के लिए 6 घंटा meiotic कोशिकाओं और 4 को तैयार, प्लस अतिरिक्त के बाद सॉर्ट जोड़तोड़.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस परियोजना के हिस्से में फ्लोरिडा के राज्य से स्क्रिप्स और पुरस्कार R01GM085079 और R21HD061304 जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बाल स्वास्थ्य और मानव विकास से, क्रमशः संख्या पैसा द्वारा समर्थित किया गया. यह स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट की पांडुलिपि संख्या 20917 है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| 6" Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
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