Summary
Эффективный метод получения высокоочищенного жизнеспособной мейоза фракций из семенников мышей описана, который сочетает в себе изысканный клеточной диссоциации протокол с люминесцентными активированный сортировки клеток (FACS). Этот метод использует различия в содержании ДНК и ядерной плотности дискретных мейоза фракций.
Abstract
Гетерогенный характер типов клеток в яичках и отсутствие мейоза модели культуры клеток были значительные препятствия для изучения уникальных программ дифференциации, которые проявляются во время мейоза. Два основных метода были разработаны для очистки, в разной степени, различных фракций мейоза от взрослых, так и незрелых животных: отмучивания или Staput (осаждение) с помощью BSA и / или Перколла градиентов. Оба эти методы основаны на размер ячейки и плотности отдельных мейоза клетки 1-5. В целом, за исключением нескольких клеточных популяций 6, эти протоколы не сможет привести к достаточной чистоты многочисленные мейоза клеточных популяций, которые необходимы для подробного молекулярного анализа. Кроме того, с такими методами как правило, один тип мейоза клетки могут быть очищены в данный момент времени, который добавляет дополнительный уровень сложности в отношении воспроизводимости и однородности при сравнении образцов мейоза клетки.
Здесь мы описываем точный метод, который позволяет легко визуализировать, идентифицировать, очистить и мейоза клетки, из половых клеток в круглых сперматид, используя FACS в сочетании с Hoechst 33342 окрашивание 7,8. Этот метод обеспечивает общий снимок всего процесса мейоза и позволяет очистить высоко жизнеспособных клеток от большинства стадии мейоза. Эти очищенные клетки могут затем быть детально проанализированы для молекулярных изменений, которые сопровождают прогрессии через мейоз, например, изменения в экспрессии генов, 9,10 и динамика нуклеосом размещение в горячих точках мейотических рекомбинации 11.
Protocol
Этот протокол может быть разделен на два основных этапа: (1) диссоциация и Hoechst 33342 окрашивание мышиные клетки семенников затем, при необходимости, (2) FACS сортировки соответствующих фракций мейоза, включая все стадии мейоза, из половых клеток, чтобы круглые сперматиды. После сбора этих обогащенного мейоза населения может быть использован для широкого спектра анализа. Этот протокол описывает диссоциации одного яичка взрослого; объемы могут быть адаптированы соответственно для несовершеннолетних или для дополнительной яичек.
1. Яичко Диссоциация
- Разместите один decapsulated яичка в 15-мл трубки.
- Добавить 3-мл раствора соли Баланс Гей (в GBSS), содержащих 120 ЕД / мл коллагеназы типа I.
- Добавьте 10 мкл ДНКазы I (1mg/ml маточного раствора в 50% глицерина) и энергично встряхните его вручную, пока не увидите яичек канальцах начинает диссоциировать.
- Перемешивают горизонтально со скоростью до 120 оборотов в минуту в течение 15 мин при 33 ° C.
- Декантировать в течение 1 мин вертикально при комнатной температуре и отбросить супернатант.
- Повторите шаги с 1,2 до 1,5.
- Добавить 2,5 мл GBSS содержащие коллагеназы типа I, 50 мкл 50мг/мл фондовом Трипсин решение ресуспендировали в 1 мМ HCl раствора и 10 мкл ДНКазы I (1mg/ml), и инвертировать трубку несколько раз.
- Перемешивают горизонтально со скоростью до 120 оборотов в минуту в течение 15 мин при 33 ° C.
- Использование пластиковой одноразовой пипетки Пастера с широким отверстием, пипетку осторожно вверх и вниз в течение 3 min.No скопления должны быть видны в этой точке.
- Добавить 30 мкл трипсина, 10 мкл ДНКазы I, 40 мкл Hoechst 33342 ресуспендировали в ДМСО (10 мг / мл), и инвертировать трубку несколько раз.
- Перемешивают горизонтально со скоростью до 120 оборотов в минуту в течение 15 мин при 33 ° C.
- Добавить 400-мкл эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и перемешать путем обращения для инактивации трипсина.
- Заключительное окрашивание производится путем добавления 50 мкл Hoechst 33342 ресуспендировали в ДМСО (10 мг / мл) и 10 мкл ДНКазы I (1 мг / мл).
- Перемешивают горизонтально со скоростью до 120 оборотов в минуту в течение 15 мин при 33 ° C.
- Диссоциированных образец яичка затем проходит через два 40-мкм GBSS предварительно смачивается одноразовые фильтры в течение 50-мл коническую трубку, затем 5 мкл йодида пропидий (PI) раствор добавляют и образец осторожно перемешивают с помощью пипетки несколько раз с одноразовыми Пастер пипетки.
- Пример переносится на 5-мл пластиковый шприц через 18-иглы. Последняя заменяется 22-иглы для образца доставки. Шприца хранится на льду и защищенном от света до готовности для обработки СУИМ.
2. FACS настройки и очистки
- Сортировка была выполнена на Becton Dickinson Ария-сортировщик ячейки ИМУ. Условиях, описанных поэтому его следует использовать в качестве отправной точки, особенно при использовании различного оборудования. Мы использовали условиях описанных выше 7,8.
- С Ария ИМУ не указал УФ лазер, мы адаптировали протокол для обнаружения Hoescht окрашивания использованием 405 нм лазер фиолетовый кроме того, мы использовали 488nm синий лазер для прямого и бокового рассеяния обнаружения. Кроме того, некоторые фильтры были изменены, с тем чтобы ограничить какие-то красные лазерные неплотности в результате чего улучшается рассеяны резкость сюжет.
- Лазерной фиолетовый был настроен с 450/40nm полосы пропускания для обнаружения Hoescht Синий выбросов и 585/42nm полосы пропускания для выбросов Hoescht Red. 502nm длинный пас был использован для отдельных синий с красной флуоресценции.
- 100 мкм сопла был использован с частотой падения привода 28000 капель / сек. Частота дискретизации порог составляет примерно 4000 событий / сек. Опция контроля температуры был использован для поддержания образца и сбор труб при 4 ° С всего времени сортировки. Кроме того, функция образец агитации была использована при 200 оборотов в минуту, чтобы предотвратить выборку из осаждающихся всей рода.
- Обычно два-три яички были обработаны в 6 часов позволяет сортировать коллекцию 0,5-2.0x10 6 ячеек для каждой группы населения (см. раздел представителя).
- Образец был отсортирован в аликвоты примерно 750μl освобождены от шприца. Между тем, во время этих пауз коллекции трубы хранились при температуре 4 ° С, защищенном от света, и осторожно перемешивают до возобновления рода.
- Отсортированных образцы были собраны в 12x75mm стекла borosilicated трубки коллекцию, содержащую 250 мкл DMEM с добавлением 10% FCS.
3. Представитель Результаты:
Типичный профиль FACS показано на рисунке 1. Все основные шаги мейоза определены и указаны в легенде. Если Hoechst 33342 пятно не является оптимальным, глобальный профиль появится гораздо более компактным и менее определены. Общая проблема касается не добавляя достаточное ДНКазы, которая будет стимулировать быстрое слипание клеток. Добавление дополнительных ДНКазы на всех обвиняемых шаги обычно решает эту проблему. Стоп-йтрепетны из ДНКазы акций (хранить при температуре -20 ° С) должны быть сведены к минимуму, так как это приводит к быстрой потере активности фермента.
Spo11 является мейоза эндонуклеазы, которая направляет двунитевых разрывов в местах мейоза горячие точки рекомбинации 12. Рисунке 2 показаны типичные профили Spo11-нуль яичка, где двухнитевых перерыв не образуются, в результате неудачного мейоза 12, а также предварительно puberous профиля 13-дневного возраста мыши, которая показывает, асинхронный характер этой первой волны мейоза. Стандартный цитогенетический анализ с использованием сочетания синаптонемных белковый комплекс 3 (SCP3) и фосфорилированного гистона антител H2AX этап-специфических маркеров мейоза должны быть изначально предназначался для подтвердил чистоту и характер отсортированы мейотических клеток, как описано elswhere 11.
Рисунок 1. Дикого типа мейоза FACS профилей. ) Участок представитель разброс показано на рисунке. Закрытого клетки показано на рисунке. Обратите внимание на большое количество мусора, присутствующих в яичках взрослого содержит в основном пустые оболочки и сперматиды хвосты. Б) представитель участок PI показывает очень ограниченное количество PI-положительных клеток, присутствующих в образце. Типичный ворота показано на рисунке. С), представитель дикого типа Hoechst 33342 FACS профиль показано на рисунке. Различных мейоза клеточных популяций, которые могут быть очищены с помощью этого метода для дальнейшего изучения указаны: сперматогонии (Sp), предварительно leptotene (PL), leptotene-зиготены (L / Z), раннего пахитены (EP), среднего пахитены ( МП), в конце-пахитены (LP), диплотенной (D), и круглые сперматиды (РС).
Рисунок 2. Spo11-нуль и дикого типа 13-й день мейоза профили FACS. А) типичный Spo11-нуль-профиля показан с ясным мейоза недостаточность, где нет этапе прошлого leptotene / зиготены раннего пахитены могут быть обнаружены. Б) профиль 13-дневных дикого самца мыши показывает высокую концентрацию leptotene / зиготены клеток. Это первая волна мейоза, а асинхронный, так же ясно, визуализированы с помощью этой методики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные здесь, позволяет одновременно очистить от взрослых самцов мышей весь спектр мейоза клетки сцене с очень высокой чистоты, что позволяет исследователям для изучения динамики этого фундаментального процесса. Очищенные клетки могут быть использованы для многочисленных приложений, начиная от выделения РНК 9,10, нуклеосом отображение 11, рекомбинантный обнаружения молекулы белка анализы, и многое другое. Тем не менее, методы обнаружения должны быть адаптированы к сумме мейоза клетки очищаются. Кроме того, с высокой воспроизводимостью этого метода, можно объединить несколько независимых видов той же фракции осуществляется в разные дни, чтобы увеличить количество материалов, необходимых для конкретного эксперимента. Кроме того, этот метод обеспечивает исследователей с уникальным визуальным представлением всей мейоза процесс, который позволяет быстро оценить эффекты генетического нокаута, развития аберрации прогрессии, или действие того или иного лечения, направленные на изменение мейоза (например, облучение, или лечение ингибиторами небольшие молекулы).
Критические шаги в этом протоколе (я) использование достаточного ДНКазы, что значительно облегчает сортировки клеток, избегая скопления клетка и агрегатов, и (II) в соответствии Hoechst 33342 окрашивание, что необходимо эффективно различать различные популяции мейотических клетках стадии. Кроме того, FACS оператор должен ознакомиться со спецификой и особенностями мейоза сортировки ячейки для того, чтобы оптимально установка свои документы для получения профилей показано на рисунке 1 и более подробно в видео. Возможного изменения могут быть заменить Hoechst 33342 с новым Vybrant DyeCycle фиолетовый пятна (Invitrogen), который был оптимизирован для фиолетового лазера. Тем не менее, общий профиль не должны будут существенно меняться. Наконец, важно также отметить, что в связи с характером тканей используются, типичная процедура займет 1 ½ часа, чтобы подготовиться мейоза клетки и от 4 до 6-час для клетки рода, а также дополнительные пост-рода манипуляций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан частично денежные средства от штата Флорида в Scripps и наградить номера R01GM085079 и R21HD061304 из Национального Института общей медицинских наук и Национального института здоровья ребенка и развития человека, соответственно. Это рукописи номер 20917 из исследовательского института Скриппса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| 6" Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Purification, A. R. culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Namekawa, S. H. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).
- Lassalle, B. Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131, 479-487 (2004).
- Bastos, H. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. Genetic analysis of variation in human meiotic recombination. PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).
- Roig, I. Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis. PLoS Genet. 6, (2010).
- Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots. EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).
- Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis. Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).
