Summary
En effektiv metod för att få renat livskraftiga meiotiska fraktioner från mus testiklarna beskrivs, som kombinerar en raffinerad cell dissociation protokoll med fluorescerande aktiverad cell sortering (FACS). Denna metod tar fördel av skillnader i DNA-innehåll och nukleära densiteten av diskreta meiotiska fraktioner.
Abstract
Heterogena karaktär typer av celler i testiklarna och frånvaron av meiotiska modeller cellodling har varit betydande hinder för att studera den unika differentiering program som manifesteras under meios. Två huvudsakliga metoder har utvecklats för att rena, i varierande grad, olika meiotiska fraktioner från både vuxna och växande djur: elutriation eller Staput (sedimentering) med hjälp av BSA och / eller Percoll lutningar. Båda dessa metoder är beroende av cellens storlek och densitet för att separera meiotiska celler 1-5. Totalt sett, med undantag för några cellpopulationer 6, dessa protokoll inte ge tillräcklig renhet många meiotiska cellpopulationer som är nödvändiga för detaljerade molekylära analyser. Dessutom med sådana metoder oftast en typ av meiotiska celler kan renas vid en given tidpunkt, vilket ger en extra nivå av komplexitet vad avser reproducerbarhet och homogenitet när man jämför meiotiska cellprover.
Här beskriver vi en raffinerad metod som gör att man kan lätt visualisera, identifiera och rena meiotiska celler, från könsceller till runda spermatider, med hjälp av FACS kombination med Hoechst 33.342 färgning 7,8. Denna metod ger en övergripande bild av hela meiotiska processen och gör att man kan mycket rena livskraftiga celler från de flesta steg i meios. Dessa renas celler kan sedan analyseras i detalj för molekylära förändringar som följer med progression genom meios, till exempel förändringar i genuttryck 9,10 och dynamiken i nukleosomen beläggning på hotspots i meiotiska rekombination 11.
Protocol
Detta protokoll kan delas i två stora steg: (1) av dissociation och Hoechst 33.342 färgning av musen testiklarna celler följt av, om nödvändigt, (2) FACS sortering av relevanta meiotiska fraktioner, inklusive alla stadier av meios, från könsceller till runda spermatider. När samlas in, kan dessa höganrikat meiotiska populationer kan användas för ett brett spektrum av analys. Detta protokoll beskriver dissociation av en vuxen testiklarna, volymerna kan anpassas för ungdomar eller för ytterligare testiklarna.
1. Testiklar Dissociation
- Placera en decapsulated testiklar i en 15-ml tub.
- Tillsätt 3-ml Gey balans Salt Solution (GBSS) som innehåller 120 U / ml kollagenas typ I.
- Tillsätt 10 ìl DNAse I (1mg/ml stamlösning i 50% glycerol) och skaka den kraftigt för hand tills du ser testikelcancer tubuli börjar ta avstånd.
- Skaka horisontellt till högst 120 rpm i 15 min vid 33 ° C.
- Häll i 1 min vertikalt vid rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Upprepa steg från 1,2 till 1,5.
- Tillsätt 2,5 ml GBSS innehåller kollagenas typ I, 50 ìl av ett 50mg/ml Trypsin stamlösning suspenderade i 1mm HCl-lösning, och 10 ìl DNAse I (1mg/ml), och invertera röret flera gånger.
- Skaka horisontellt till högst 120 rpm i 15 min vid 33 ° C.
- Använda plast disponibel Pasteurpipett med bred öppning, pipett försiktigt upp och ner för 3 min.No klumpar skall vara synliga på denna punkt.
- Tillsätt 30 ìl av trypsin, 10 ìl DNAse I, 40 ìl av Hoechst 33.342 återsuspenderad i DMSO (10 mg / ml), och invertera röret flera gånger.
- Skaka horisontellt till högst 120 rpm i 15 min vid 33 ° C.
- Tillsätt 400-ìl fetalt kalvserum (FCS) och blanda genom att vända för att inaktivera trypsin.
- Final färgning utförs genom att tillsätta 50 ìl av Hoechst 33.342 återsuspenderad i DMSO (10 mg / ml) och 10 ìl DNAse I (1 mg / ml).
- Skaka horisontellt till högst 120 rpm i 15 min vid 33 ° C.
- Det dissocierade testiklar Provet leds sedan genom två 40-ìm GBSS förhand fuktade engångsfilter över en 50-ml konisk tub, sedan 5 ìl propidiumjodid (PI) tillsätts och provet försiktigt blandas genom att pipettera flera gånger med disponibel Pasteur pipett.
- Exempel överförs till en 5-ml plastspruta genom en 18-gauge nål. Den senare ersätts av en 22-gauge nål vid prov leverans. Sprutan lagras på is och skyddas från ljus tills klar för FACS bearbetning.
2. FACS Installation och Purification
- Sortering utfördes på ett Becton-Dickinson Aria iiU cell sorterare. De beskrivna villkor bör därför användas som utgångspunkt speciellt när man använder olika utrustning. Vi använde villkor beskrivits tidigare 7,8.
- Eftersom Aria iiU inte har en UV-laser, vi anpassat protokollet för att upptäcka Hoescht färgning med hjälp av en 405nm violett laser dessutom använde vi en 488nm blå laser för framåt och Side Scatter upptäckt. Dessutom var några filter ändras för att begränsa vissa röd laser leakiness leder till förbättrad utspridda tomt skärpa.
- Den violett laser var konfigurerad med en 450/40nm bandpass för upptäckt av Hoescht Blå utsläpp och en 585/42nm bandpass för Hoescht Red utsläpp. En 502nm lång passning användes för att skilja blått från rött fluorescens.
- En 100 ìm munstycke användes med en droppe köra frekvens av 28.000 droppar / sekund. Provet tröskeln låg på cirka 4000 händelser / sekund. Temperaturen kontroll alternativet var används för att upprätthålla prov och rör insamling vid 4 ° C hela den tid sortering. Dessutom var provet agitation funktionen används vid 200 rpm för att förhindra att provet från sedimenterande hela sortera.
- Vanligtvis hade två till tre testiklar bearbetas per 6 timmar sortera möjliggör insamling av 0,5-2.0x10 6 celler för varje population (se representativ sektion).
- Provet var sorterade i portioner på cirka 750μl dispenseras från sprutan. Samtidigt under dessa pauser insamling rören hölls vid 4 ° C, skyddat från ljus, och försiktigt blandas före återupptas sortera.
- De sorterade proverna samlades in i en 12x75mm glas borosilicated samling rör som innehåller 250μl DMEM kompletteras med 10% FCS.
3. Representativa resultat:
En typisk FACS profilen visas i Figur 1. Alla de viktigaste stegen i meios identifieras och anges i förklaringen. Om Hoechst 33.342 fläcken inte är optimal, kommer den globala profilen verkar mycket mer kompakt och mindre definierade. Ett vanligt problem gäller inte lägga tillräckligt DNAse, vilket kommer att leda till en snabb cell klibbar. Tillsats av extra DNAse alls åtalade steg löser oftast detta problem. Freeze: eawing av DNAse lager (förvaras vid -20 ° C) bör hållas till ett minimum, eftersom detta resulterar i snabb förlust av enzymaktivitet.
Spo11 är meiotiska endonuclease som styr dubbla strängbrott i områden av meiotiska rekombination hotspots 12. Figur 2 visar typiska profiler för en Spo11-null testikel, där dubbel tråd bryter inte bildas, vilket resulterar i en misslyckad meios 12, samt en före puberous profilen av en 13-dagar gammal mus, som avslöjar asynkrona naturen för denna första våg av meios. Standard cytogenetiska analyser med hjälp av en kombination av synaptonemal komplexa protein 3 (SCP3) och fosforyleras histon antikroppar H2AX steg-specifika bör meios markörer användes ursprungligen till bekräftad renhet och arten av det sorterade meiotiska cellerna, som beskrivs elswhere 11.
Figur 1. Vildtyp meios FACS profiler. A) representant punktdiagram visas. Den gated cellerna visas. Notera den stora mängd skräp som finns i vuxna testiklar som innehåller mest tomma membran och spermatid svansar. B) en representant PI plot visar mycket begränsad mängd PI-positiva celler i ett prov. Den typiska porten visas. C) Ett representativt vildtyp Hoechst 33.342 FACS profilen visas. De olika meiotiska cellpopulationer som kan renas med hjälp av denna metod för vidare studier anges: spermatogonier (Sp), pre-leptotene (PL), leptotene-zygotene (L / Z), tidig-Pachytene (EP), mitten-Pachytene ( MP), sen Pachytene (LP), diplotene (D), och runda spermatider (RS).
Figur 2. Spo11-noll och vildtyp dag 13 meiotiska FACS profiler. A) En typisk Spo11-null profilen visas med en tydlig meiotiska misslyckande, där ingen steg förbi leptotene / zygotene tidig pachytene kan upptäckas. B) Beskrivning av en 13-dagar gamla vildtyp hanmöss visar den höga koncentrationen av leptotene / zygotene celler. Denna första våg av meios är ganska asynkront, vilket tydligt visualiseras med hjälp av denna metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet presenteras här gör att man samtidigt rena från vuxna hanmöss hela sortimentet av meiotiska scenen celler med mycket hög renhet, vilket gör utredare för att studera dynamiken i denna grundläggande process. Renat celler kan användas för många tillämpningar, från RNA-extraktion 9,10, nukleosomen kartläggning 11, rekombinanta molekylen upptäckt, analyser protein och många fler. Men detektionsmetoder måste anpassas till den mängd meiotiska renat celler. I och med hög reproducerbarhet av denna metod är det möjligt att samla flera oberoende sorters samma andel som utförs på olika dagar för att öka mängden material som krävs för ett visst experiment. Dessutom ger denna metod utredare med en unik visuell representation av hela meiotiska processen, som gör att man snabbt bedöma effekterna av genetisk knockout, utvecklingspsykologi progression aberration, eller effekten av en viss behandling som syftar till att påverka meios (t.ex. bestrålning, eller behandling med små molekyler hämmare).
Kritiska steg i detta protokoll är (i) användning av tillräcklig DNAse, vilket avsevärt underlättar cellsortering genom att undvika cell klumpar och aggregat, och (ii) konsekvent Hoechst 33.342 färgning som är nödvändig för att effektivt skilja de olika populationer av meiotiska skede celler. Dessutom bör FACS operatören bekanta sig med detaljerna och egenheter meiotiska cellsortering för att optimalt ställa sina instrument för att få profilerna visas i figur 1 och som beskrivs i videon. En möjlig förändring skulle kunna vara att ersätta Hoechst 33.342 med den nya Vybrant DyeCycle Violet Stain (Invitrogen) som har optimerats för violett laser. Skulle dock den övergripande profilen inte förväntas ändras drastiskt. Slutligen är det också viktigt att notera att på grund av arten av den använda vävnad, kommer en typisk procedur tar 1 ½ timme att förbereda meiotiska celler och 4 till 6-h för cellen sortering, plus ytterligare efter sortera manipulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta projekt stöds delvis av pengar från delstaten Florida till Scripps och siffror utmärkelse R01GM085079 och R21HD061304 från National Institute of General Medical Sciences och National Institute of Child Health and Human Development, respektive. Detta manuskript antal 20.917 av The Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| 6" Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Purification, A. R. culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Namekawa, S. H. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).
- Lassalle, B. Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131, 479-487 (2004).
- Bastos, H. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. Genetic analysis of variation in human meiotic recombination. PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).
- Roig, I. Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis. PLoS Genet. 6, (2010).
- Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots. EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).
- Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis. Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).
