Summary
وصفت وسيلة فعالة للحصول على تخصيبه بدرجة الكسور الانتصافي قابلة للحياة من خصية الفأر ، الذي يجمع بين المكرر الخلية تفارق بروتوكول مع الفلورسنت الفرز تنشيط الخلية (FACS). هذا الأسلوب تستفيد من الاختلافات في المحتوى وكثافة النووية DNA الكسور الانتصافي منفصلة.
Abstract
كانت الطبيعة غير المتجانسة من أنواع الخلايا في الخصية وعدم وجود نماذج الانتصافي خلية ثقافة عقبات كبيرة لدراسة البرامج التمايز الفريدة التي تظهر خلال الانقسام الاختزالي. وقد وضعت اثنين من الطرق الرئيسية لتنقية ، بدرجات متفاوتة ، وكسور مختلفة من كلا الانتصافي الكبار والحيوانات غير ناضجة : تصويل أو Staput (الترسيب) باستخدام جيش صرب البوسنة و / أو تدرجات percoll. كل من هذه الأساليب تعتمد على حجم الخلية وكثافة لفصل الخلايا الانتصافي 1-5. عموما ، باستثناء عدد قليل من السكان الخلية 6 ، هذه البروتوكولات لا تسفر نقاء كافية للسكان الخلية الانتصافي العديدة والتي هي ضرورية لإجراء تحليلات مفصلة الجزيئية. وعلاوة على ذلك ، يمكن مع مثل هذه الأساليب يمكن تنقيته عادة نوع واحد من الخلايا الانتصافي في وقت معين ، والذي يضيف مستوى إضافي من التعقيد فيما يتعلق استنساخ والتجانس عند مقارنة عينات الخلايا الانتصافي.
هنا ، نحن تصف طريقة المكرر الذي يسمح للمرء أن يتخيل بسهولة ، وتحديد ، وتنقية الخلايا الانتصافي من الخلايا الجرثومية الى أرومة النطفة في الجولة ، وذلك باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية جنبا إلى جنب مع تلوين 33342 هويشت 7،8. هذا الأسلوب يوفر لقطة الكلي للعملية برمتها الانتصافي ويسمح احد لتنقية عالية خلايا قابلة للحياة من معظم مرحلة الانقسام الاختزالي. ويمكن بعد ذلك تنقية هذه الخلايا يتم تحليلها بالتفصيل عن التغييرات التي تصاحب التقدم الجزيئية من خلال الانقسام الاختزالي ، على سبيل المثال التغيرات في التعبير الجيني 9،10 وديناميات الإشغال في المناطق الساخنة من النيوكليوسومات تأشب الانتصافي 11.
Protocol
ويمكن فصل هذا البروتوكول في خطوتين رئيسيتين : (1) التفكك وهويشت 33342 من خلايا الخصية تلطيخ الماوس تليها ، إذا لزم الأمر ، (2) FACS الفرز من الكسور في الانتصافي ذات الصلة ، بما في ذلك جميع مراحل الانقسام الاختزالي ، من الخلايا الجرثومية الى جولة أرومة النطفة. جمعها مرة واحدة ، يمكن استخدام هؤلاء السكان التخصيب الانتصافي لمجموعة واسعة من التحليل. يصف هذا البروتوكول تفارق الكبار للخصية واحدة ، ويمكن تكييفها وفقا لحجم الأحداث أو الخصيتين إضافية.
1. خصية التفكك
- مكان واحد الخصية decapsulated في أنبوب 15 مل.
- أضف 3 مل من Gey ميزان محلول الملح (GBSS) التي تحتوي على 120 يو / مل من نوع كولاجيناز أولا
- أضف 10 ميكرولتر من أنا الدناز (1mg/ml حل الأسهم في الجلسرين 50 ٪) والتخلص منه بقوة باليد حتى تشاهد نبيبات الخصية بدأت تنأى.
- تستنهض الهمم أفقيا بحد أقصى من 120 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في 33 درجة مئوية.
- صب ل1 دقيقة عموديا في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف.
- كرر الخطوات من 1،2-1،5.
- إضافة 2.5 مل من GBSS تحتوي على نوع كولاجيناز الأول ، 50 ميكرولتر من حل 50mg/ml الأسهم التربسين معلق في محلول حمض الهيدروكلوريك 1MM ، و 10 ميكرولتر من أنا الدناز (1mg/ml) ، وعكس الأنبوب عدة مرات.
- تستنهض الهمم أفقيا بحد أقصى من 120 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في 33 درجة مئوية.
- باستخدام الماصة البلاستيك القابل للتصرف مع باستور فوهة واسعة ، وينبغي ماصة بلطف صعودا ونزولا لكتل 3 min.No تكون مرئية عند هذه النقطة.
- إضافة 30 ميكروليتر من التربسين ، 10 ميكرولتر الدناز الأول ، و 40 ميكرولتر من هويشت 33342 معلق في DMSO (10 ملغ / مل) ، وعكس الأنبوب عدة مرات.
- تستنهض الهمم أفقيا بحد أقصى من 120 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في 33 درجة مئوية.
- إضافة 400 ميكرولتر من مصل العجل الجنين (FCS) وتخلط بواسطة قلب لتعطيل التربسين.
- يتم تنفيذ تلطيخ النهائية بإضافة 50 ميكرولتر من هويشت 33342 معلق في DMSO (10 ملغ / مل) ، و 10 ميكرولتر من أنا الدناز (1 ملغ / مل).
- تستنهض الهمم أفقيا بحد أقصى من 120 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في 33 درجة مئوية.
- ثم يتم تمرير عينة الخصية فصلها من خلال اثنين من 40 ميكرومتر GBSS قبل المبللة مرشحات المتاح عبر أنبوب 50 مل المخروطية ، ثم 5 ميكرولتر من يوديد propidium (PI) يضاف الحل ويتم خلط عينة من pipetting بلطف عدة مرات مع باستور المتاح ماصة.
- يتم نقل عينة لحقنة بلاستيكية 5 مل من خلال إبرة عيار 18. يتم استبدال هذا الأخير بواسطة إبرة عيار 22 للتسليم العينة. يتم تخزين حقنة على الجليد ومحمية من الضوء حتى على استعداد لتجهيز نظام مراقبة الأصول الميدانية.
2. FACS الإعداد والتنقية
- تم تنفيذ الفرز على فارز الأغنية بيكتون ديكنسون ، IIu الخلية. ولذلك ينبغي للشروط المذكورة ستستخدم كنقطة انطلاق وخاصة عند استخدام معدات مختلفة. اعتدنا الظروف الموصوفة سابقا 7،8.
- منذ IIu الأغنية لا يملك ليزر الأشعة فوق البنفسجية ، وتكييفها ونحن على بروتوكول للكشف عن تلطيخ Hoescht باستخدام الليزر البنفسجي 405nm بالإضافة كنا 488nm الليزر الزرقاء لكشف مبعثر إلى الأمام والجانب. وعلاوة على ذلك ، تم تعديل بعض المرشحات من أجل الحد من بعض التسرب ليزر حمراء مما أدى إلى تحسين الحدة مؤامرة متناثرة.
- تم تكوين ليزر البنفسج بتمريرة الفرقة 450/40nm للكشف عن Hoescht الأزرق الانبعاثات وتمريرة لانبعاث الفرقة 585/42nm Hoescht الأحمر. واستخدمت طويلا لتمرير 502nm منفصلة الأزرق من مضان أحمر.
- تم استخدام 100 فوهة ميكرومتر مع انخفاض وتيرة محرك 28000 قطرات / ثانية. كان معدل عتبة حوالي 4000 عينة الأحداث / ثانية. تم استخدام الخيار للحفاظ على التحكم في درجة الحرارة وأنابيب جمع العينات عند 4 درجة مئوية طوال فترة الفرز. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام ميزة التحريض على عينة 200 دورة في الدقيقة لمنع العينة من المترسبة في جميع أنحاء الفرز.
- عادة ، تم تجهيز 2-3 الخصيتين في المرتبة 6 ساعات مما يسمح للخلايا جمع 0.5 - 2.0x10 6 لكل السكان (انظر القسم التمثيلية).
- وكان فرز عينة في aliquots من 750μl حوالي الاستغناء عن الحقنة. وفي الوقت نفسه ، خلال هذه مؤقتا بقيت أنابيب جمع في 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء ، والمختلط بلطف قبل استئناف الفرز.
- تم جمع عينات مصنفة في أنبوب زجاجي يحتوي على مجموعة borosilicated 12x75mm 250μl DMEM تستكمل مع FCS 10 ٪.
3. ممثل النتائج :
ويرد التعريف FACS نموذجية في الشكل 1. ويتم تحديد كافة الخطوات الرئيسية لالانقسام الاختزالي ويشار في أسطورة. إذا هويشت 33342 صمة عار ليس الأمثل ، فإن الوضع يبدو أكثر من ذلك بكثير العالمية المدمجة وتعريف أقل. وهناك مشكلة مشتركة لا تعتبر كافية مضيفا الدناز ، والتي سوف تحفز السريع التثاقل الخلية. إضافة الدناز إضافية في جميع الخطوات المتهمين عادة ما يحل هذه المشكلة. تجميد اليجب أن تبقى من مخزون الإهابة الدناز (المخزنة في -20 درجة مئوية) إلى أدنى حد ممكن ، لأن هذا يؤدي إلى فقدان سريع لنشاط انزيم.
Spo11 هو الذي يوجه الانتصافي نوكلياز داخلية مزدوجة الجديلة في مواقع النقاط الساخنة تأشب الانتصافي 12. ويبين الشكل 2 الملامح النموذجية للخصية Spo11 خالية حيث لا تشكل حبلا كسر مزدوج ، مما أسفر عن الانقسام الاختزالي فاشل 12 ، فضلا عن قبل puberous ملف ماوس 13 يوما من العمر ، الذي يكشف عن طبيعة هذه الموجة غير متزامنة الأول من الانقسام الاختزالي. القياسية التحليلات الوراثية الخلوية باستخدام مزيج من بروتين معقد المشبكي الخيطي 3 (SCP3) وأضداد H2AX هيستون فسفرته مرحلة معينة ينبغي استخدام علامات الانقسام الاختزالي في البداية لتأكيد نقاء وطبيعة الخلايا الانتصافي فرزها ، كما هو موضح elswhere 11.
الشكل 1. البرية من نوع الانقسام الاختزالي FACS التشكيلات. أ) يظهر الممثل مؤامرة مبعثر. وتظهر الخلايا المغلقة. لاحظ كمية الحطام الحالية كبيرة في الخصية التي تحتوي في الغالب الكبار الأغشية الفارغة وذيول أرومة النطفة. ب) قطعة PI ممثل يبين كمية محدودة جدا من الخلايا PI الإيجابية الموجودة في العينة. يظهر بوابة نموذجية. C) ويرد ممثل من النوع البري هويشت ملف FACS 33342. يشار إلى مختلف السكان الانتصافي الخلية التي يمكن تنقيتها باستخدام هذا الأسلوب لمزيد من الدراسة : بزرات النطاف (SP) ، قبل leptotene (pl) ، ودور الاقتبال leptotene - (L / Z) ، في وقت مبكر ، Pachytene (EP) ، في منتصف Pachytene - ( MP) ، في وقت متأخر من Pachytene (LP) ، طور التضعف (D) ، وجولة أرومة النطفة (RS).
الشكل 2. Spo11 وخالية من النوع البري يوم 13 الانتصافي FACS التشكيلات. أ) يتم عرض نموذجي Spo11 خالية نبذة عن فشل واضح الانتصافي ، حيث لا يمكن الكشف عن المرحلة الماضية على pachytene المبكر leptotene / دور الاقتبال. B) وملف ماوس من النوع البري قبل 13 يوما من العمر ويبين تركيز عال من الخلايا leptotene / دور الاقتبال. هذه الموجة الأولى من الانقسام الاختزالي غير متزامن بدلا من ذلك ، كما تصور واضح باستخدام هذه المنهجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول المقدمة في هذه الوثيقة يسمح احد لتنقية واحد من الفئران الذكور البالغين مجموعة كاملة من الخلايا مرحلة الانتصافي مع درجة نقاوة عالية جدا ، مما يسمح للمحققين لدراسة ديناميات هذه العملية الأساسية. ويمكن استخدام الخلايا النقية للعديد من التطبيقات بدءا من استخراج الحمض النووي الريبي 9،10 ، ورسم خرائط النيوكليوسومات 11 ، المؤتلف اكتشاف جزيء ، ويحلل البروتين ، وغيرها الكثير. ومع ذلك ، طرق الكشف يجب أن تتكيف مع كمية من الخلايا الانتصافي المنقى. علاوة على ذلك ، مع استنساخ عالية من هذه الطريقة ، فمن الممكن لأنواع متعددة من تجمع المستقلين الكسر نفسه القيام في أيام مختلفة لزيادة كمية المواد المطلوبة لإجراء تجربة معينة. أيضا ، وهذا الأسلوب يتيح للمحققين مع تمثيل بصرية فريدة للعملية الانتصافي بأكملها ، مما يسمح احد لتقييم سريع للآثار خروج المغلوب الوراثية والتقدم التنموي انحراف ، أو تأثير من أي علاج خاص يهدف إلى التأثير الانقسام المنصف (على سبيل المثال ، الإشعاع ، أو المعاملة مع مثبطات جزيء صغير).
خطوات حاسمة في هذا البروتوكول هي : (ط) استخدام الدناز كافية ، مما يسهل إلى حد كبير عن طريق تجنب الفرز خلية خلية وكتل الركام ، و (ب) بما يتفق هويشت 33342 تلطيخ ما هو ضروري للتمييز بين المجموعات السكانية المختلفة بكفاءة من الخلايا مرحلة الانتصافي. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي FACS مشغل التعرف على مواصفات وخصائص الخلية الفرز الانتصافي من أجل الإعداد الأمثل للحصول على صك التشكيلات هو مبين في الشكل (1) ومفصلة في الفيديو. ويمكن أن التعديل ممكن تكون بديلا للهويشت 33342 مع فيوليت جديدة DyeCycle Vybrant اللطخة (Invitrogen) التي تم تحسينها ليزر البنفسجي. ومع ذلك ، لن يكون الوضع العام المتوقع أن تتغير جذريا. أخيرا ، من المهم أيضا أن نلاحظ أنه نظرا لطبيعة النسيج المستخدمة ، وإجراء نموذجي سيستغرق 1 ½ ساعة لتحضير الخلايا الانتصافي ساعة و 4 إلى 6 لفرز الخلايا ، بالإضافة إلى التلاعب إضافية بعد انتهاء الفرز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد أيد هذا المشروع في جزء من الأموال من ولاية فلوريدا لسكريبس وأرقام وR21HD061304 R01GM085079 جائزة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة والمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية ، على التوالي. هذا هو الرقم 20917 مخطوطة من معهد سكريبس للأبحاث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| 6" Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Purification, A. R. culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Namekawa, S. H. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).
- Lassalle, B. Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131, 479-487 (2004).
- Bastos, H. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. Genetic analysis of variation in human meiotic recombination. PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).
- Roig, I. Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis. PLoS Genet. 6, (2010).
- Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots. EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).
- Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis. Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).
