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Neuroscience

Avaliar buraqueira, Construção Nest, e Hoarding em Ratos

doi: 10.3791/2607 Published: January 5, 2012

Summary

Construção de galerias, de nidificação e açambarcamento são espécies típicas atividades que os ratos prontamente executar em laboratório. Este artigo descreve como podem ser simplesmente mais barato avaliados. Estes protocolos são extremamente sensíveis à tensão mouse, lesões cerebrais e doenças. Além disso, eles constituem "enriquecimento ambiental" para os ratos, e encarnar o "refinamento" aspecto do "3 Rs" 18.

Abstract

Deterioração da capacidade de realizar "atividades da vida diária" (ADL) é um sinal precoce da doença de Alzheimer (AD). Triagem comportamental pré-clínicos de possíveis tratamentos para AD atualmente em grande parte concentra-se em testes cognitivos, que freqüentemente exige equipamentos caros e muito tempo experimentador. No entanto, a memória episódica humano (o aspecto mais severamente afetados de memória em AD) é diferente para a memória dos roedores, o que parece ser em grande parte não-episódica. Portanto, as formas atuais de triagem para tratamentos novos para a AD AD em roedores são intrinsecamente improváveis ​​de sucesso. Uma nova abordagem à triagem pré-clínicos seria caracterizar a ADL de camundongos. Por sorte, vários testes, tais têm sido recentemente desenvolvidos na Universidade de Oxford, e aqui os três mais sensíveis e bem caracterizadas são apresentados.

Burrowing foi desenvolvido em Oxford 13. Ela evoluiu a partir de uma necessidade de desenvolver um paradigma hoarding mouse. Mais publicarparadigmas hoarding ed roedores necessária uma fonte de alimento distante para ser ligada à gaiola por uma passagem de ligação. Isso implicaria a modificação da gaiola, bem como fazer um mouse à prova de passagem de conexão e fonte de alimento. Por isso, foi considerado se seria possível colocar a fonte de alimento dentro da gaiola. Verificou-se que se um contêiner foi colocado no chão, foi esvaziado na manhã seguinte., As pelotas de alimentos foram, no entanto, simplesmente depositado em uma pilha na entrada de contentores, ao invés de colocados em um lugar discreto fora do container, como seria de esperar se os ratos eram verdadeiramente acumular-los. Inspeção cuidadosa mostrou que os ratos estavam realizando escavação ("burrowing") movimentos, não carregando a pellets em suas bocas para um lugar escolhido como fariam se realmente hoarding-los 6.

Pelotas do alimento não é um substrato essencial para a construção de galerias; ratos irá tubos vazios cheios de areia, cascalho, mesmo roupa de cama sujas de sua própria gaiola. Maismais, eles vão esvaziar um tubo cheio mesmo se um vazio é colocado próximo a ele 8.

Vários protocolos de nidificação existem na literatura. O Oxford apresentar um simplifica o procedimento e tem um sistema de pontuação bem definidos para a qualidade do ninho 5.

Um paradigma hoarding foi desenvolvido mais tarde em que os ratos, ao invés de acumulação de volta para a jaula casa real, foram adaptados a viver na "base" de um aparelho de entesouramento. Esta base de casa foi conectado a um tubo feito de malha de arame, a extremidade distal do que continha a fonte de alimento. Este arranjo provou rendimento bom comportamento de manada, enquanto os ratos foram adaptados a viver na "base" durante o dia e só autorizados a entrar no tubo de acumulação à noite.

Protocol

1. Burrowing

1. Aparelho

Projetos recipiente vários foram julgados (por exemplo uma jarra de metal que pode ser facilmente limpo, mas os ratos estavam relutantes em entrar nele). Eventualmente foi descoberto que um comprimento de downpipe de plástico (como ligado ao calhas nas casas) elevou ligeiramente em uma extremidade para evitar deslocamentos acidentais (não-intencional) de pelotas de comida e selado, no outro extremo, foi um eficiente aparelho. Burrows agora são feitas de plástico downpipe, 68 mm de diâmetro, cortado em comprimentos de 20 centímetros de comprimento (Figura 1). Uma extremidade é selada com um bujão de 12 mm de média densidade MDF (MDF). (A proteção respiratória é aconselhável quando se trabalha com mdf). Para limpeza e impermeabilização, um composto adesivo à prova d'água de aroeira pode ser aplicada às superfícies, dentro e fora do mdf, bem como servir de cola-lo para dentro do tubo burrowing. Parafusos de máquina (5 cm de comprimento) são usadas para elevar a outra extremidade of tubo de três centímetros do chão. Dois buracos são perfurados a 1 cm da extremidade aberta do tubo burrowing em um ângulo de 90 ° e os parafusos inseridos e apertados 4.

O diâmetro do burrows é provavelmente crítico; Schmid-Holmes et al 19 observaram que os ratos in the wild "toca limpa" principalmente a partir de tocas semelhante em tamanho aos nossos entes artificial..

Figura 1

Figura 1. Um rato em um tubo de escavação.

2. Procedimento

  1. Habituação
    Burrowing normalmente é espontânea, mas há um elemento de aprendizagem determinadas. O processo de aprendizagem é reforçada pela facilitação social. Portanto, coloque uma toca cheia durante a noite na gaiola grupo de ratos que são mais tarde a ser testado com um tratamento. Cada escavação é preenchida com 200 g de pellets de alimentos normalmente fornecidos como dieta. (Trata-se de tele tipo comprimido densa de dieta, se uma dieta "expandido" está em uso o burrow manterá menos de 200g). Experimentadores deve levar em consideração fatores ao selecionar um substrato burrowing.

    Se os ratos estão no racionamento de alimentos (por exemplo, para motivá-los para executar uma tarefa labirinto simultâneos de aprendizagem) não-alimentares substâncias podem ser utilizadas, por exemplo, bolas de argila, como usado para a linha da superfície do solo em vasos de plantas indoor; ervilha cascalho (pedras pequenas ~ 1 cm de diâmetro) e areia. Telha de ervilha e areia, sendo três vezes mais pesado que pellets de alimentos, são substitutos úteis para pelotas do alimento se os ratos estão cavando muito vigorosamente, para evitar um "efeito teto".
  2. Baselining
    Run (preferencialmente dois) de base burrowing testes 48 h para além da mesma maneira como será feito para o teste após o tratamento proposto. O teste é ideal começou por volta das 16:00 se os ratos estão alojados em um 0700-1900 h ciclo claro-escuro. Este é um momento delicadopara testar, pois eles não são normalmente acordados neste momento e burrowing começa mais lentamente do que se fossem assim para a fase escura e, conseqüentemente, muito ativa. Duas horas após o início, um "instantâneo" medição é feita do peso dos alimentos escavados; a toca é esvaziado em um recipiente tarado e pesado e os pellets substituído na toca que é colocada de volta na gaiola. Se o mouse está na toca, apenas suavemente derramá-lo eo conteúdo para o recipiente de pesagem e substituir o mouse na gaiola. O peso burrowed menos duas horas é então calculada por subtração a partir do original 200 g. A leitura final é tomada na manhã seguinte. Tempo não é crítico como os ratos terão voltado a dormir (muitas vezes na toca) e não são mais ativamente burrowing. Use as 2 h medição tomadas no segundo julgamento para formar grupos equilibrados para o desempenho de linha de base. Como burrowing aumenta com a prática 17, baselining também ajuda os ratos para alcançar asymp mais estáveldesempenho totic que revela os efeitos do tratamento melhor.
  3. Ensaio
    Para testes, após os tratamentos são administrados os ratos são submetidos ao teste burrowing exatamente o mesmo que na fase de linha de base. Se o teste burrowing é para ser usado cronicamente, recomenda-se que pelo menos 48 h separar os testes para evitar um declínio no desempenho devido ao excesso de exposição ao procedimento.
  4. Nota
    NÃO substitua o alimento burrowed no chão da gaiola para a toca. Mesmo que o mouse não tem nada de burrowed, execute o procedimento de pesagem como você faria se tivesse ocorrido burrowing; a perturbação causada por peso tende a estimular o comportamento, e os ratos que já enterrou algumas das substrato, muitas vezes, começar cavando com vigor renovado após a pesando processo.

2. Resultados esperados

C57 ~ BL / 6 ratos toca normalmente em torno de 70 g nas duas primeiras horas, e perto de 200 gdurante a noite. Hipocampo ratos lesionados, muitas vezes burrow menos de 5 g 11 (Figura 2). Doença de príon inibe burrowing 1,2, assim como a administração de lipopolissacarídeo 20. Buraqueira pode detectar a doença priônica (scrapie) em 10-12 semanas após a injeção de homogenato de cérebro de doentes, enquanto que os sinais clínicos aparecem apenas em 22 semanas 13. (Figura 3). Buraqueira tem se mostrado sensível às diferenças tensão 15 e knock-out de subunidades de íons de potássio canal 10.

Figura 2

Figura 2. Peso de pelotas de alimento (medianas e intervalos interquartis) burrowed em duas horas pelo controle e hipocampo lesado camundongos. O último burrowed significativamente menos do que os controles (P = 0,0001).

Figura 3

Figura 3. Peso dapelotas do alimento (meios) burrowed durante a noite por e controle de scrapie camundongos infectados. Buraqueira aumenta (com prática) em ambos os grupos de semana 7-10 pós-injeção, mas a partir de 12 semanas diminui burrowing no grupo scrapie ea diferença entre os grupos torna-se estatisticamente significativa (superior a dois erros padrão da média).

3. Discussão

Nós testamos burrowing em outras espécies de roedores - ratos, gerbils, hamsters e ratos egípcios spiny 8. Todos, mas este último poderia ser induzido a quantidades substanciais burrow de substratos terrestres como cascalho ou areia, mas burrowing de pelotas de comida era muito menos, mesmo depois de vasta experiência com os materiais terrestres. A razão para esta diferença de ratos não é conhecido. Após este trabalho tinha sido feito, foi descoberto que os ratos egípcios spiny de fato não fazem tocas na natureza, eles podem ocupar tocas feitas por gerbils, também a superfície de seus ha naturaisBitat muitas vezes é hard rock. Observação recente em Nairóbi mostrou que, dentro do gênero Acomys, mouse Wilson spiny (Acomys wilsoni) e spiny Percival mouse (Acomys percivali), que se enterram no estado selvagem, também burrowed em laboratório.

4. Nidificação

1. Aparelho

Este teste é realizado em gaiolas individuais, sendo que os mesmos utilizados para escavação são adequados. Cama normal deve cobrir o chão a uma profundidade de 0,5 cm. (Variação em profundidade, e roupa de cama muito profundo, poderia afetar a construção do ninho). Cada gaiola é fornecido com um "Nestlet", um quadrado de 5 cm de batting de algodão prensado (Ancare).

2. Procedimento

Os ratos são colocados individualmente em gaiolas de nidificação cerca de uma hora antes da fase escura, e os resultados são avaliados na manhã seguinte. Tal como acontece com construção de galerias, e por razões semelhantes, o tempo não é crítico.

3.Pontuação

Os ninhos são avaliados em uma escala de 5 pontos (Figuras 4-8), ea quantidade de untorn Nestlet é também pesava 5.

  1. O Nestlet é praticamente intocados (> 90% intacta).
  2. O Nestlet é parcialmente rasgado (50-90% restantes intactos).
  3. O Nestlet é mais desfiado, mas muitas vezes não há local do ninho identificáveis: <50% do Nestlet permanece intacta, mas <90% está dentro de um quarto da área do piso da gaiola, ou seja, o algodão não é reunido em um ninho, mas espalhados ao redor da gaiola . Nota: o material pode por vezes estar em uma área ninho amplamente definido, mas a definição crítica é que 50-90% foi picado.
  4. Um ninho de identificação, mas plana:> 90% do Nestlet é rasgado, o material é reunido em um ninho dentro de um quarto da área do piso da gaiola, mas o ninho é plana, com muros mais altos do que a altura do corpo do rato (enrolado em seu lado) com menos de 50% da sua circunferência.
  5. A n (próximo) perfeitaest:> 90% do Nestlet é rasgado, o ninho é uma cratera, com muros mais altos do que a altura do mouse corpo em mais de 50% da sua circunferência.

Onde o critério de não concordar dividir a diferença. Por exemplo, um ninho perfeito com um pedaço unshredded 0,7 g marcaria 4.5.

Figura 4

Figura pontuação Ninho 4 1.

Figura 5

Figura 5 pontos. Nest 2

Figura 6

Figura 6 pontos. Nest 3

Figura 7

Figura 7. Nest pontuação 4

Figura 8

Figura 8. Scor Ninhoe 5

4. Resultados esperados

Os machos e as fêmeas fazem ninhos, como sua finalidade é a termorregulação, além de ser associada com a reprodução. Para camundongos C57BL / 6, a pontuação ninho para homens e mulheres estão no mesmo intervalo, embora não tenhamos feito uma comparação controlada em um único experimento. A maioria dos mouses C57BL / 6 pontuação 4-5 na construção do ninho, mas quando o hipocampo é lesionada a pontuação média seria em torno de 1-2; uma pontuação de 3 dificilmente será ultrapassado (Figura 9). Nidificação também se mostrou sensível à doença de príon em torno de 10-12 semanas 1,2,16.

Figura 9

Figura 9. Pontuações Nest (medianas e intervalos interquartis) para controle de ratos e camundongos com lesões do hipocampo, dorsal ventral e completa. Somente os ratos lesionados mostram a inibição completa de aninhamento, então os efeitos da dorsal seletiva e Ventr. Dirregiões al aparecem sub-limiar, mas aditivo.

5. Acumulação

1. Aparelho

Uma série de "bases em casa" estão ligados a tubos de malha de arame, selado de forma permanente na extremidade distal onde a pellets alimentos são colocados e, temporariamente, na extremidade proximal por um tampão de madeira. Isto é usado para impedir que os ratos que entram os tubos antes de adaptação para a base de casa tem occurred7.

O aparelho (Figura 10) pode ser feita de várias maneiras, desde que os princípios básicos são respeitados. Nosso consiste de uma linha de 8 caixas de madeira, cada um 30 x 13 x 15 cm, com tampas de acrílico transparente. Cada um é fornecido com uma garrafa de água, e tem um buraco na parte de trás em que o tubo de entesouramento é push-equipada. Os tubos são feitos de plástico preto, 10 cm de comprimento, 40 mm de diâmetro, juntou-se a um tubo de malha de arame, 45 cm de comprimento, 4 cm de diâmetro, para formar um comprimento total de 50 cm. A malha é composta de 13 quadrados mm,e é um rolo de casal com as malhas mis-alinhados para fazer os buracos na malha menor e evitar pelotas do alimento cair completamente. Se seis milímetros de malha quadrada está disponível este é um material melhor como um rolo seria suficiente. A extremidade distal do tubo, onde os alimentos são colocados pellets, está fechado. A extremidade proximal é selada com um bujão removível de madeira.

Figura 10

Figura 10. Mice nos tubos de açambarcamento

2. Procedimento

  1. Tipicamente, o entesouramento é muito variável pela primeira vez e alguns ratos não podem acumular em tudo. Entesouramento, como construção de galerias, melhora com a prática. Portanto, onde o design experimental permite, sessões baselining são os melhores dados antes de um tratamento é administrado. Claramente, isto não é prático, se a variável independente é inata, como com um rato (não-condicional) mutante ou ao testar linhagens de camundongos diferentes.
  2. Um rato é colocado emcada caixa no início do dia a habituar a ele. A caixa é fornecida com um túnel de papelão que foi na gaiola verdadeiro grupo de casa por pelo menos uma noite, também uma generosa porção de cama suja, fazer-se sentir como "casa". Acesso ao tubo de entesouramento é impedido até a noite com uma rolha de madeira. 100 g pellets de alimentos (uma mistura de pequenos e grandes) é colocada na extremidade distal do tubo de entesouramento (deitando-os em, no outro extremo com o tubo na vertical). Para certificar-se o mouse é levemente com fome antes do início dos testes, a caixa de casa não é fornecido com alimentos.
  3. Pouco antes do início da fase escura, retire o tampão de madeira para permitir o acesso do rato ao tubo de entesouramento. Na manhã seguinte (novamente, o tempo não é crítico) Recolher e pesar todos os pellets de alimentos que foram acumulados na caixa de base.

6. Resultados esperados

Usando C57BL feminino / 6 ratos, o valor médio acumulado seria de cerca de50-70 g. Lesões do hipocampo fortemente suprimir hoarding11, enquanto as lesões córtex pré-frontal tem apenas um efeito fraco 12 (Figura 11).

Figura 11

Figura 11. Peso de pelotas de alimento acumulado por controle e medial córtex pré-frontal-lesionada camundongos (medianas e faixas interquartil). Embora as medianas diferem consideravelmente, a alta variabilidade nos controles, o resultado está longe de ser estatisticamente significativa (P = 0,3).

Discussion

Estes testes são extremamente simples de executar, mas os tamanhos de efeito são muito grandes, tornando-os extremamente sensíveis aos tratamentos, as diferenças de tensão, etc Eles estão em conformidade com o "Requinte" aspecto de Russell e Burch 3 Rs "18. Na verdade, o bom desempenho em testes como burrowing parece ser um indicativo de boa saúde geral dos animais. Portanto, este poderia ser um bom teste para avaliação do bem-estar animal.

A importância do enriquecimento ambiental para roedores de laboratório é bem reconhecida nos dias de hoje. Fornecimento de material de nidificação é agora uma prática comum em casas de muitos animais, e isso é fácil de fazer. O entusiasmo com que os ratos escavam tocas faz um enriquecimento potencialmente excelente, mas, infelizmente, uma "auto-recarregamento" toca o que seria uma maneira prática de fornecer este ainda não foi desenvolvido. Se encontrar ratos hoarding enriquecendo ainda não foi determinada.

_content "> Uma desvantagem é que os dados gerados por esses testes é geralmente não-paramétricas (não gaussianas na distribuição), de modo apropriado as estatísticas não-paramétricas são necessários para analisá-los, por exemplo, o Mann-Whitney U para comparações pairwise, Kruskal- Wallis ANOVA para o grupo multi-dados. Se designs medidas repetidas são usadas, uma vez que não há nenhum teste ANOVA adequada para dados não-paramétricos, os resultados podem ser transformadas, por exemplo, raiz quadrada ou procedimentos de registro para fazê-los obedecer a uma distribuição mais normal .

As medições do aparelho podem ser ligeiramente diferentes daqueles especificados no texto (útil para pesquisadores EUA), mas grandes diferenças devem ser evitados. No entanto, em alguns casos, outros experimentadores podem encontrar diferentes construções funcionam melhor do que as descritas aqui.

Como para todas as medições de comportamento, os ratos devem ser testadas para ver se seus níveis de atividade são normais, como a inatividade terá, obviamente, uma detrimental efeito sobre as espécies típicas comportamentos. Quando scrapie camundongos infectados foram mostrando burrowing prejudicada e nidificação, seus níveis de atividade foram normais (testado em um aparelho de campo aberto). De fato, um período de hiperatividade ocorre em torno de 2-4 semanas após esses comportamentos típicos da espécie são os primeiros prejudicada 2.

O comprometimento forte produzida por lesões do hipocampo na construção de galerias, de nidificação e entesouramento, que são espécies típicas comportamentos, complementa as deficiências no aprendizado espacial e Memória9 que são tão bem estabelecidos os efeitos dessas lesões. Eles parecem ser equivalentes aos prejuízos nas atividades da vida diária tão característico da AD 14.

Estes testes típicos da espécie pode muito bem provar ser de grande utilidade na triagem pré-clínicos para tratamentos do mal de Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas 14. Em muitas doenças cérebro humano uma capacidade perda ou redução para realizar véspera normaistarefas ryday é tão importante como outras características da doença, como comprometimento cognitivo. Particularmente, esta perda pode exigir o envolvimento dos cuidadores e da grande fardo socioeconômico este tantas vezes impõe.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Wellcome Trust para a concessão de financiamento de Acesso Livre à Universidade de Oxford. Robert Deacon é um membro do grupo de Oxford OXION, financiado pelo Wellcome Trust conceder WT084655MA.

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