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Neuroscience

La evaluación de madriguera, la construcción del nido, y el acaparamiento en ratones

doi: 10.3791/2607 Published: January 5, 2012

Summary

Madrigueras, nidos y el acaparamiento son las actividades típicas de la especie que los ratones que fácilmente realizan en el laboratorio. En este artículo se describe cómo se pueden sencilla ya buen precio evaluado. Estos protocolos son extremadamente sensibles a la cepa de ratón, las lesiones cerebrales y las enfermedades. Por otra parte, constituyen el "enriquecimiento ambiental" para los ratones, e incorporan el "refinamiento" aspecto de la "3 erres" 18.

Abstract

El deterioro de la capacidad de realizar "actividades de la vida diaria" (ADL) es una señal temprana de la enfermedad de Alzheimer (EA). Detección preclínica de comportamiento de los posibles tratamientos para la EA en la actualidad se centra principalmente en las pruebas cognitivas, que a menudo requiere equipo costoso y mucho tiempo experimentador. Sin embargo, la memoria episódica humana (el aspecto más afectados de la memoria en el año) es diferente a la memoria de los roedores, lo que parece ser en gran medida no episódica. Por lo tanto, las formas actuales de detección de tratamientos nuevos para el año AD en los roedores son intrínsecamente improbable que tenga éxito. Un nuevo enfoque para la detección preclínica sería caracterizar la ADL de los ratones. Por casualidad, varios ensayos como se han desarrollado recientemente en Oxford, y aquí los tres más sensible y bien caracterizados se presentan.

Madriguera fue desarrollado por primera vez en Oxford 13. Se desarrolló a partir de una necesidad de desarrollar un paradigma de acumulación de ratón. La mayoría de publicared paradigmas acumulación de roedores requiere una fuente de alimento distante a estar vinculada a la jaula por un pasadizo que conecta. Esto implicaría la modificación de la jaula de alojamiento, así como hacer un ratón a prueba de paso de conexión y fuente de alimento. Por lo tanto, se consideró si sería posible poner la fuente de alimento dentro de la jaula. Se encontró que si un contenedor se coloca en el suelo que fue vaciada por la mañana., Los pellets de alimentos, sin embargo, simplemente depositados en un montón a la entrada de contenedores, en lugar de colocarse en un lugar discreto lejos del recipiente, como era de esperar si los ratones eran verdaderamente acaparamiento ellos. Una inspección detallada mostró que los ratones estaban realizando excavaciones ("madriguera") los movimientos, no llevar las pastillas en la boca a un lugar seleccionado como lo harían si realmente los acaparamiento 6.

Pellets de alimentos no es un sustrato esencial para la madriguera; ratones tubos vacíos llenos de arena, grava, incluso ropa de cama sucias de su propia jaula. Másmás, se vacía un tubo lleno, incluso si uno vacío se coloca junto a él 8.

Varios protocolos de anidación existen en la literatura. El presente Oxford una simplifica el procedimiento y tiene un sistema de puntuación bien definido para la calidad de nido 5.

Un nuevo paradigma de acumulación se desarrolló más tarde en la que los ratones, en lugar de acumular de nuevo a la jaula real, se han adaptado a vivir en la "base" de un aparato de acaparamiento. Esta base estaba conectada a un tubo hecho de malla de alambre, el extremo distal de las cuales contenía la fuente de alimento. Este acuerdo resultó rendimiento comportamientos de acumulación de buenas, siempre y cuando los ratones se han adaptado a vivir en la "base" durante el día y sólo se les permite entrar en el tubo de acaparamiento en la noche.

Protocol

1. Excavación

1. Aparato

Varios diseños de contenedores fueron juzgados (por ejemplo una jarra de metal que pueda ser de fácil limpieza, pero los ratones se mostraban reacios a entrar en él). Con el tiempo se descubrió que un trozo de tubo de bajada de plástico (como conectada a los canalones de las casas) un poco elevado en un extremo para evitar el desplazamiento accidental (no intencionada) de pellets de alimentos y sellada en el otro extremo, fue un eficiente aparato. Burrows ahora se hacen de bajante de plástico, 68 mm de diámetro, cortados en longitudes de 20 cm de largo (Figura 1). Un extremo está sellado con un tapón de 12 mm de fibra de densidad media (MDF). (La protección respiratoria se recomienda cuando se trabaja con mdf). Para la limpieza e impermeabilización, un compuesto resistente al agua masilla adhesiva se puede aplicar a las superficies interior y exterior de la mdf, además de servir para pegar en el tubo de madriguera. Tornillos de la máquina (5 cm de largo) se utilizan para elevar el otro extremo of el tubo de 3 cm del suelo. Dos agujeros son perforados a 1 cm del extremo abierto del tubo de madriguera en un ángulo de 90 ° y los tornillos insertados y apretados 4.

El diámetro de las madrigueras es probablemente crítica, Schmid-Holmes et al 19 observaron que los ratones en la naturaleza "madriguera limpia" principalmente de tamaño similar al de nuestros seres madrigueras artificiales..

Figura 1

Figura 1. Un ratón en un tubo de madriguera.

2. Procedimiento

  1. Habituación
    Madriguera está normalmente espontánea, pero hay un elemento de aprendizaje determinado. El proceso de aprendizaje se ve reforzada por la facilitación social. Por lo tanto, colocar una madriguera llena toda la noche en la jaula grupo de ratones que luego de la prueba con un tratamiento. Cada madriguera se llena con 200 g de pellets de alimentos suministran generalmente en la dieta. (Esto se refiere a tque tipo denso comprimido de la dieta, y si un "ampliado" la dieta es en el uso de la madriguera llevará a cabo a menos de 200 g). Experimentadores deben tomar en consideración factores tales la hora de seleccionar un sustrato de madriguera.

    Si los ratones están en el racionamiento de alimentos (por ejemplo, para motivarlos a ejecutar una tarea de laberinto concurrente de aprendizaje) sustancias no alimenticias se pueden utilizar, por ejemplo, bolas de arcilla, tal como se utiliza en la línea de la superficie de la tierra en macetas de plantas de interior; guisante guijarros (piedras pequeñas ~ 1 cm de diámetro) y la arena. Guijarros y la arena del guisante, siendo tres veces más pesado que los pellets de alimentos, son sustitutos útiles para pellets de alimentos si los ratones están socavando muy vigorosamente, para evitar un "efecto techo".
  2. Línea de base
    Run (preferiblemente dos) de referencia de madriguera pruebas de 48 h, de la misma manera como se hace para realizar exámenes después del tratamiento propuesto. La prueba es óptima comenzó alrededor de 4 horas si los ratones se encuentran en una 0.700-1.900 h luz-oscuridad ciclo. Este es un momento delicadopara poner a prueba, ya que normalmente no se despierta en este momento y comienza a excavar más lentamente que si estuvieran bien en la fase de oscuridad y por lo tanto muy activo. Dos horas después del inicio, una "instantánea" de la medida se toma el peso de la comida enterrada, la madriguera se vacía en un recipiente tarado y pesado y los pellets reemplazado en la madriguera que se pone de nuevo en la jaula. Si el ratón está en la madriguera, sólo se vierte con cuidado y el contenido en el recipiente de pesada y vuelva a colocar el ratón en la jaula. El peso de madriguera a las dos horas se calcula mediante la resta de los 200 g. La lectura final que se adopte la mañana siguiente. El tiempo no es crítico ya que los ratones se han vuelto a dormir (a menudo en la madriguera) y están socavando ya no activa. Use la medición de 2 horas tomadas en el segundo intento para formar grupos equilibrados de rendimiento de referencia. Como madriguera aumenta con la práctica 17, una línea de base también ayuda a los ratones para llegar a asinto más establerendimiento Totic que revela los efectos del tratamiento mejor.
  3. Pruebas
    Para la prueba, después de los tratamientos se administran a los ratones se les da la prueba de madriguera exactamente el mismo que en la fase de línea de base. Si la prueba de madriguera se va a utilizar crónica, se recomienda que al menos 48 horas por separado las pruebas para evitar una disminución en el rendimiento debido a la sobre-exposición a la intervención.
  4. Nota
    No sustituya la comida enterrada en el piso de la jaula en la madriguera. Incluso si el ratón no se ha excavado nada, lleve a cabo el proceso de pesaje como lo haría si madriguera había ocurrido, la perturbación causada por el peso tiende a estimular el comportamiento, y los ratones que ya se han excavado algunos de los sustratos a menudo se iniciará madriguera con renovado vigor después de la proceso de pesada.

2. Resultados esperados

C57 ~ BL / 6 ratones por lo general excavan alrededor de 70 g en las primeras dos horas, y cerca de 200 gdurante la noche. Ratones del hipocampo lesionado a menudo excavan a menos de 5 g 11 (Figura 2). Enfermedad priónica inhibe madriguera 1,2, al igual que la administración de lipopolisacárido 20. Madriguera puede detectar priones (scrapie) la enfermedad a las 10-12 semanas después de la inyección de homogeneizado de cerebro enfermo, mientras que los signos clínicos sólo aparecen a las 22 semanas 13. (Figura 3). Madriguera ha demostrado ser sensible a las diferencias de cepa 15 y knock-out de potasio subunidades de los canales iónicos 10.

Figura 2

Figura 2. Peso de pellets de alimentos (mediana y rango intercuartil) excavado en dos horas por el control y ratones con lesiones del hipocampo. Esta última madriguera significativamente menor que los controles (P = 0,0001).

Figura 3

Figura 3. Peso de lapellets de alimentos (medio) enterradas durante la noche por el control y ratones infectados con scrapie. Madriguera aumenta (con prácticas) en los dos grupos de 7 a 10 semanas después de la inyección, pero desde la semana 12 la disminución de madriguera en el grupo de la tembladera y la diferencia entre los grupos se hace estadísticamente significativa (superior a dos errores estándar de la media).

3. Discusión

Hemos probado madriguera en otras especies de roedores - ratas, jerbos, hámsteres y los ratones espinosos Egipto 8. Todos, menos el último podría ser inducido a cantidades considerables madrigueras de sustratos terrestres tales como grava o arena, pero madriguera de pellets de comida era mucho menor, incluso después de una amplia experiencia con los materiales terrestres. La razón de esta diferencia de los ratones no se conoce. Después de este trabajo se ha hecho, se descubrió que los ratones espinosos egipcio de hecho no hacen madrigueras en la naturaleza, sino que pueden ocupar madrigueras de los jerbos, también la superficie de las hectáreas naturalesBitat es a menudo muy duras. Reciente observación en Nairobi mostraron que, en el Acomys género, el ratón de Wilson espinosa (Acomys wilsoni) y espinosa Percival ratón (Acomys percivali), que se excavan en la naturaleza, también excavado en el laboratorio.

4. Anidación

1. Aparato

Esta prueba se realiza en jaulas individuales, las mismas que utilizan para cavar son adecuados. Ropa de cama normal debe cubrir el suelo a una profundidad de 0,5 cm. (Variación en profundidad, y ropa de cama profunda, podría afectar a la construcción del nido). Cada caja se suministra con un "Nestlet", un cuadrado de 5 cm de algodón en rama presionado (Ancare).

2. Procedimiento

Los ratones se colocaron individualmente en las jaulas de anidación de aproximadamente una hora antes de la fase de oscuridad, y se evalúan los resultados a la mañana siguiente. Al igual que con madriguera, y por razones similares, el tiempo no es crítico.

3.Puntuación

Los nidos son evaluados en una escala de 5 puntos (Figuras 4-8), y la cantidad de untorn Nestlet también pesó 5.

  1. El Nestlet es en gran parte intacta (> 90% intacto).
  2. El Nestlet está parcialmente roto (50-90% permanece intacto).
  3. El Nestlet es sobre todo destrozado, pero a menudo no hay nido de identificación: <50% de los Nestlet permanece intacta, pero <90% se encuentra dentro de un cuarto de la zona de suelo de la jaula, es decir, el algodón no se recoge en un nido, pero la propagación alrededor de la jaula . Nota: El material a veces puede estar en un área de anidación en sentido amplio, pero la definición fundamental es que el 50-90% ha sido destrozado.
  4. Un nido de identificación, pero plano:> 90% de la Nestlet está roto, el material es recogido en un nido dentro de un cuarto del área de piso de la jaula, pero la jerarquía es plana, con paredes más altas que la altura del cuerpo del ratón (acurrucado en su lado) en menos del 50% de su circunferencia.
  5. A n (casi) perfectoest:> 90% de la Nestlet está roto, el nido es un cráter, con muros más altos que la altura del cuerpo del ratón en más del 50% de su circunferencia.

Cuando los criterios no están de acuerdo dividir la diferencia. Por ejemplo, un nido perfecto con una pieza de 0,7 g triturar anotaría 4.5.

Figura 4

Figura 4. Nido de puntuación 1

Figura 5

Figura 5. Nido de puntuación 2

Figura 6

Figura 6. Nido de puntuación de 3

Figura 7

Figura 7. Puntuación Nido 4

Figura 8

Figura 8. Scor Nidoe 5

4. Resultados esperados

Los varones y las hembras hacen sus nidos, ya que su propósito es la termorregulación, además de ser asociados con la reproducción. Para los ratones C57BL / 6, las puntuaciones de nido para hombres y mujeres están en el mismo rango, aunque no hemos hecho una comparación controlada en un solo experimento. La mayoría de los ratones C57BL / 6 puntuación de 4-5 en la construcción del nido, pero cuando el hipocampo está lesionado de la mediana de la puntuación sería de alrededor de 1.2, un puntaje de 3 es poco probable que se supere la velocidad (Figura 9). Anidación también ha demostrado ser sensible a las enfermedades priónicas en torno a las 10-12 semanas 1,2,16.

Figura 9

Figura 9. Puntuaciones Nest (mediana y rango intercuartil) de los ratones control y ratones con lesiones en el hipocampo dorsal, ventral y completa. Sólo los ratones lesionados muestran una inhibición completa de la anidación, por lo que los efectos de la dorsal selectiva y ventrregiones al parecer por debajo del umbral, sino aditivos.

5. Acaparamiento

1. Aparato

Una serie de "bases de su casa" están conectadas a tubos de malla de alambre, sellada de forma permanente en el extremo distal, donde los pellets de alimentos se colocan temporalmente y en el extremo proximal de un tapón de madera. Esto se utiliza para prevenir que los ratones entran los tubos antes de la adaptación a la base de operaciones ha occurred7.

El aparato (Figura 10) se puede hacer de varias maneras, siempre y cuando los principios básicos se cumplen. El nuestro consiste en una fila de 8 cajas de madera, cada uno de 30 x 13 x 15 cm con tapa de metacrilato transparente. Cada uno viene con una botella de agua, y tiene un agujero en la parte posterior en la que el tubo de atesoramiento es push-instalado. Los tubos son de plástico negro, 10 cm de largo, 40 mm de diámetro, unido a un tubo de malla de alambre, 45 cm de largo, 4 cm de diámetro, para formar una longitud total de 50 cm. La malla está compuesta por 13 plazas mm,y es un rollo doble con las mallas mal alineada para hacer los agujeros en la malla más pequeños y evitar caer a través de los alimentos pellets. Si 6 mm de malla cuadrada está disponible este es un material mejor que un rollo sería suficiente. El extremo distal del tubo, donde los pellets de alimentos se colocan, se cierra. El extremo proximal está sellado con un tapón de madera desmontable.

Figura 10

Figura 10. Ratones en los tubos de acaparamiento

2. Procedimiento

  1. Por lo general, el acaparamiento es muy variable la primera vez y algunos ratones no pueden acumular en absoluto. El acaparamiento, como la madriguera, mejora con la práctica. Por lo tanto, donde el diseño experimental que permite, sesiones de línea de base son los mejores administra antes de que se administre el tratamiento. Claramente, esto no es práctico si la variable independiente es innata, como con un (no condicional) ratón mutante o cuando las pruebas distintas cepas de ratón.
  2. Un ratón se pone encada caja temprano en el día a habituarse a ella. La caja cuenta con un túnel de cartón que ha estado en la jaula grupo base real para al menos una noche, también una generosa porción de las camas sucias, para hacerlo sentir como "en casa". El acceso al tubo de acaparamiento se evita hasta la noche con un tapón de madera. 100 g de alimentos pellets (una mezcla de grandes y pequeñas) se coloca en el extremo distal del tubo de acumulación (por verter en el otro extremo con el tubo en posición vertical). Para asegurarse de que el ratón es ligeramente hambre antes de que comiencen las pruebas, el cuadro de casa no cuenta con los alimentos.
  3. Justo antes del comienzo de la fase oscura, quite el tapón de madera para permitir el acceso del ratón en el tubo de acaparamiento. A la mañana siguiente (de nuevo, el tiempo no es crítico) recoger y sopesar todas las bolitas de comida que se han acumulado en el cuadro base.

6. Resultados esperados

Utilizando C57BL mujeres / 6 ratones, el importe medio acumulado sería de alrededor de50-70 g. Lesiones del hipocampo fuertemente suprimir hoarding11, mientras que las lesiones corteza prefrontal tienen sólo un efecto débil 12 (Figura 11).

Figura 11

Figura 11. Peso de pellets de alimentos acaparados por el control y la corteza prefrontal medial lesionado de ratones (mediana y rango intercuartil). A pesar de las medianas difieren considerablemente, la alta variabilidad en los controles significa que el resultado está lejos de ser estadísticamente significativa (P = 0,3).

Discussion

Estas pruebas son muy sencillos de ejecutar, pero los tamaños del efecto son muy grandes, que les hace extremadamente sensibles a los tratamientos, las diferencias de tensión, etc ajustarse a la "refinamiento" aspecto de Russell y Burch 3 Rs "18. De hecho, un buen desempeño en las pruebas de madriguera, como parece ser indicativo de una buena salud general de los animales. Por lo tanto, esto podría ser una buena prueba para la evaluación del bienestar animal.

La importancia de enriquecimiento ambiental para los roedores de laboratorio es bien conocida en estos días. Suministro de material de anidamiento es ahora una práctica estándar en las casas de muchos animales, y esto es fácil de hacer. El entusiasmo con que excavan madrigueras los ratones hace un enriquecimiento potencial excelente, pero por desgracia, un "auto-recarga" madriguera de lo que sería una forma práctica de siempre que ello no ha sido aún desarrollado. Si los ratones encontrar acaparamiento enriquecer aún no ha sido determinada.

_content "> Un inconveniente es que los datos generados por estas pruebas por lo general no paramétrico (no en la distribución de Gauss), de manera apropiada estadística no paramétrica se necesitan para analizar, por ejemplo, el de Mann-Whitney para las comparaciones por pares, Kruskal- Wallis ANOVA para los datos de varios grupos. Si los diseños de medidas repetidas se utilizan, ya que no hay prueba de ANOVA adecuado para datos no paramétricos, los resultados se pueden transformar, por ejemplo, la raíz cuadrada o procedimientos de registro para que se adecuen a una distribución más normal .

Las mediciones de los aparatos pueden ser ligeramente diferentes a los especificados en el texto (muy útil para los experimentadores EE.UU.), pero las grandes diferencias se deben evitar. Sin embargo, en algunos casos, otros experimentadores pueden encontrar diferentes construcciones funcionan mejor que las que se describen aquí.

Como para todas las mediciones del comportamiento, los ratones deben ser probados para ver si sus niveles de actividad son normales, como la inactividad, obviamente, tendrá un detrimental efecto sobre las especies típicas de los comportamientos. Cuando la tembladera de los ratones infectados mostraban deterioro de madriguera y de anidación, sus niveles de actividad eran normales (probado en un aparato de campo abierto). De hecho, un periodo de hiperactividad se produce alrededor de 2-4 semanas después de estos comportamientos típicos de la especie son los primeros impedimentos 2.

El deterioro fuertes producidos por las lesiones del hipocampo en la madriguera, nidificación y el acaparamiento, todos los cuales son típicos de la especie comportamientos, complementa las deficiencias en el aprendizaje espacial y memory9 que están tan bien establecidos los efectos de estas lesiones. Parece que son equivalentes a las alteraciones en las actividades de la vida diaria, tan característica de la EA 14.

Estas pruebas típicas de la especie y puede llegar a ser de gran utilidad en la detección preclínica de los tratamientos para el Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas 14. En muchos de los trastornos del cerebro humano una capacidad de pérdida o reducción para llevar a cabo la víspera de lo normaltareas ryday es tan importante como otras características de la enfermedad como el deterioro cognitivo. En particular, esta pérdida puede requerir la participación de los cuidadores y la gran carga socioeconómica esto tan a menudo impone.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

El Wellcome Trust para proporcionar fondos de acceso abierto a la Universidad de Oxford. Robert Deacon es un miembro del grupo de Oxford OXION, financiado por el Wellcome Trust conceder WT084655MA.

References

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