Ein 1,5 Stunden-Verfahren für die Identifizierung von Enterococcus Spezies direkt aus Blutkulturen

Summary

Eine schnelle Protokoll für die direkte Identifizierung von Enterococcus faecalis und Enterococcus anderen Arten aus eine positive Blutkultur mit einem Peptidnucleinsäuren Fluoreszenz in situ Hybridisierung Assay (PNA FISH).

Abstract

Enterokokken sind eine häufige Ursache von Bakteriämie mit E. faecalis wird die vorherrschende Spezies von E. faecium gefolgt. Da die Resistenz gegen Ampicillin und Vancomycin in E. faecalis noch selten auf Widerstand in E. faecium verglichen wird, ist die Entwicklung von Schnelltests erlauben die Differenzierung zwischen Enterokokken-Spezies für eine angemessene Therapie und Überwachung von Resistenzen gegen wichtig. Die E. faecalis OE PNA FISH-Test (AdvanDx, Woburn, MA) verwendet Spezies-spezifische Peptid-Nukleinsäure (PNA)-Sonden in einem Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Format und bietet eine Zeit, um Ergebnisse von 1,5 Stunden und das Potenzial, wichtige Informationen für artspezifische Behandlung. Multicenter-Studien wurden durchgeführt, um die Leistung des 1,5 Stunden E. bewerten faecalis / OE PNA FISH-Verfahren auf den ursprünglichen 2,5 Stunden Testdurchführung und Standard Bakteriologie Methoden zur Identifizierung von Enterokokken direkt von einer positiven Blutkultur Flasche verglichen.

Protocol

1. Probenentnahme und Vorbereitung

1. Sammeln venösen Blut von Patienten mit Sepsis Verdacht und legte sich in zwei BACTEC (BD, Sparks, MD) Blutkulturflaschen, eine aerobe und eine anaerobe, zusammen mit einem Blut Kultur gesetzt.
2. Legen Flaschen in die BACTEC 9240 Instrument bei 35 ° C.
3. Inkubieren, bis das Gerät in den Alarmzustand wegen des Wachstums der Organismen in der Blutkulturflasche ausgelöst wird.
4. Entfernen Flasche aus der Blutkultur Instrument.

2. Vorbereitung der Reagenzien vor dem Färben

1. Bereiten Sie die Waschlösung durch Zugabe von 4 ml 60x Waschlösung von 240 ml frisch destilliertem Wasser direkt auf die Färbung Dish gefolgt.
2. Legen Sie die Färbung Gericht in der 55 ° C Wasserbad zu erwärmen.
3. Bewahren Sie die restlichen Konzentrat bei 2-8 ° C.
4. Entfernen Sie die Eindeckmedium aus dem Kühlschrank und auf Raumtemperatur erwärmt.

3. Gram-Färbung

1. Vorsichtig schwenken die Blutkulturflasche.
2. Mit einer Nadel und Spritze oder eine Subkultivierung Apparat, entfernen Sie das Blut (ca. 5 ml) aus der Flasche und in eine sterile Schraube Röhrchen.
3. Mit einer sterilen Pipette, stellen Sie einen großen Tropfen Blut auf einen Objektträger.
4. An der Luft trocknen schieben und fixieren in Methanol für 10 Sekunden.
5. Lassen Sie gleiten an der Luft trocknen.
6. Führen Sie eine Gram über die Blut-Film Fleck, um die Morphologie des Organismus wächst in der Blutkulturflasche bestimmen.
7. Mit einer Ölimmersion, Diashows. Gram-positive Kokken in Paaren und kurzen Ketten auf die Gram-Färbung zu beobachten ist am ehesten mit Enterococcus Spezies.
8. Das Gram-Färbung Ergebnis treibt dann die Auswahl der richtigen PNA FISH-Sonde Kit für Identifizierung von Bakterien verwendet werden. Diese Blutkultur wird gebeizt mit der E. werden faecalis / OE PNA FISH-Färbung.

4. PNA FISH Stain

1. Mischen Sie die Röhrchen mit dem Blut vorsichtig durch Schwenken vor Abstrich Vorbereitung.
2. Geben Sie einen Tropfen der Lösung Fixation auf das Wohl eines PNA FISH Objektträger.
3. Transfer 10 ul oder einen kleinen Tropfen aus der Tube mit der positiven Blutkultur auf die Fixation Solution und vorsichtig mischen, um zu emulgieren.
4. Fix die Flecken durch Erhitzen für 20 min. bei 55 ° C auf einer Heizplatte.

5. Quality Control Material-

Eine positive und eine negative Qualitätskontrolle schieben muss jede Charge von Folien für die Färbung getestet werden.

1. Verwenden Sie E. faecalis / OE Objektträger gekauft AdvanDx für diesen Zweck oder bereiten Abstriche aus flüssigen Kulturen Referenz Stämme von E. faecalis und E. faecium als positive Kontrolle entweder auf separaten Folien oder gemischt auf einer Folie und Staphylococcus spp oder Streptococcus spp als negative Kontrolle Material.

Die QC-Ergebnisse sollten in der Lage, für eine angemessene Prüfbedingungen, insbesondere in den Hybridisierungsstringenz und Zellwand Eindringen zu überwachen, da PNA-Methodik wurde entwickelt, um Zellwand Eindringen optimieren

6. Hybridisierung

1. Einen Tropfen E. faecalis / OE PNA, die auch auf dem Objektträger mit dem Abstrich.
2. Add Deckglas. Vermeiden Sie Luftblasen.
3. Inkubieren für 30 ± 5 min. bei 55 ± 1 ° C auf Heizplatte
4. Nach der Inkubation Objektträger in Spannplatte

7. Strenge Wash

1. Tauchen Objektträgerhalter in den vorgeheizten Waschlösung bei 55 ° C und entfernen Sie vorsichtig das Deckglas. Oft gleitet das Deckglas ab, indem Sie vorsichtig Schütteln der Folie in der Waschlösung. Gelegentlich muss das Deckglas vorsichtig geschoben werden Sie mit einer Pinzette.
2. Inkubieren in der Waschlösung für 30 ± 5 min. bei 55 ± 1 ° C.
3. Entfernen Sie die Folien aus der Waschlösung
4. Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen

8. Montage

1. Einen Tropfen Eindeckmedium auf jeder Folie
2. Add Deckglas. Vermeiden Sie Luftblasen.
3. Untersuchen Sie die Folie auf einem Fluoreszenzmikroskop innerhalb von 2 Stunden.
4. Setzen Sie die Dias dem Sonnenlicht oder anderen starken Lichtquellen direkt, da dies zu Fluoreszenzlöschung führen kann.

9. Interpretation der Ergebnisse

Die Fluoreszenz-Mikroskop für Dia-Prüfung verwendet werden, müssen mit dem AdvanDx Dual-Band-Filter und ein 60x oder 100x Öl-Objektiv ausgestattet werden. Die QC Dias sollte zunächst geprüft werden, um zu bestätigen, dass die Hybridisierung entstanden sind. E. faecalis sollte so hell grün fluoreszierende Kokken in mehrere Felder der Ansicht angezeigt werden und die E. faecium wird als leuchtend rote Kokken erscheinen. Non-Enterokokken Steuerschieber erscheinen soll nichtfluoreszierenden. Nach der Bestätigung des Systems in der Kontrollgruppe, kann der Patient gleitet untersucht werden. Auf den ersten Blut film erscheint rötlich, aber die leuchtend rot und grün Kokken werden ganz offensichtlich.

Abbildung 1. Repräsentative Beispiele für grün-positive E. faecalis (links), rot positive E. faecium (Mitte) und negative (rechts) Testergebnisse.

10. Repräsentative Ergebnisse

Drei Institutionen wurden in einer multizentrischen klinischen Studie zur Evaluierung dieser PNA FISH-Färbung und Vergleich einer 2,5 Stunden Protokoll, um die verkürzte 1,5 Stunden Protokoll, das soeben Bewertung einbezogen. Ein insgesamt 152 Routine grampositive Kokken in Paaren und Ketten (GPC) positive Blutkultur Flaschen wurden in die Studien einbezogen. Es gab 100% (152/152) Vereinbarung zwischen den Ergebnissen der modifizierten und dem ursprünglichen Testverfahren für E. faecalis / OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis; 33/33 anderen Enterokokken und 78/78 anderen GPC (Tabelle 1). Diese Färbemethode hatte exquisite Sensitivität und Spezifität in dieser klinischen Studie (Tabelle 2).

	Routine-Methoden	E. faecalis / OE PNA FISH Standard-Vorgehensweise	E. faecalis / OE PNA FISH Short Procedure
E. faecalis	41	41 (Grüne Positive)	41 (Grüne Positive)
E. faecium	27	27 (Red Positive)	27 (Red Positive)
E. casseliflavus	2	2 (Red Positive)	2 (Red Positive)
E. gallinarum	2	2 (Red Positive)	2 (Red Positive)
Andere Enterococcus spp.	2	2 (Red Positive)	2 (Red Positive)
S. pneumoniae	17	17 (Negative)	17 (Negative)
S. viridans	33	33 (Negative)	33 (Negative)
S. mitis	1	1 (Negative)	1 (Negative)
S. pyogenes	3	3 (Negative)	3 (Negative)
S. bovis	2	2 (Negative)	2 (Negative)
S. salivarius	1	1 (Negative)	1 (Negative)
S. sanguinis	2	2 (Negative)	2 (Negative)
S. agalagtae	7	7 (Negative)	7 (Negative)
Andere Streptococcus spp.	7	7 (Negative)	7 (Negative)
Abiotrophia spp.	3	3 (Negative)	3 (Negative)
Peptostrepococcus spp.	2	2 (Negative)	2 (Negative)
Gesamt	152	152/152 100% Zustimmung	152/152 100% Zustimmung

Tabelle 1. Listing von Bakterien getestet sowohl mit dem Standard (2,5 Stunden) und Rapid (1,5 h)-Protokoll.

Empfindlichkeit E.faecalis	Empfindlichkeit Andere Enterococcus spp.	Spezifität
100% (41/41) 95% CI (93,0 bis 100)	100% (33/33) 33/33 95% CI (91,3 bis 100)	100% (78/78) 95% CI (96,2 bis 100)

Tabelle 2. Sensitivität und Spezifität der 1,5 Stunden PNA FISH-Protokoll.

Discussion

Die E. faecalis / OE PNA FISH-Assay für Enterokokken können Identifizierung 2-3 Tage früher als Standard-Kultur-Methoden liefern. Die verkürzte Verfahren für den Test (1,5 hourr) ermöglicht eine schnelle Identifikation, die für einen besseren Ansatz, um eine antimikrobielle Therapie und Outcome der Patienten eingesetzt werden können. Eine Studie, dies zu unterstützen wurde von Forrest et al. (6) durchgeführt. In zwei aufeinanderfolgenden Jahren, beginnend im Jahr 2005 die mikrobiologischen Labor identifiziert Gram-positive Kokken in Paaren und Ketten wachsen in Blutkulturflaschen von konventionellen mikrobiologischen Methoden und in 2006 Hinzufügen der E. faecalis / OE PNA FISH. Zusätzlich ist ein Therapie-Algorithmus durch die Organe antimikrobielle Team (AMT) entwickelt, um effektiv zu nutzen die PNA FISH-Daten durch das Labor in zeitnah generiert. Der primäre Endpunkt war die Zeit beurteilt aus Blutkultur auf die Umsetzung von wirksamen antimikrobiellen Therapie ziehen vor und nach der PNA FISH wurde in den Labors Workflow eingeleitet. Die Schwere der Krankheit, Patienten Lage und empirische antimikrobielle Therapie gemessen wurden. Insgesamt 224 Patienten mit im Krankenhaus erworbenen Enterokokken Bakteriämie wurden mit 129 in der Pre-Interventionszeitraum und 95 in der PNA FISH Zeitraum ausgewertet. PNA FISH identifiziert E. faecalis 3 Tage früher als bei herkömmlichen Kulturen (1,1 vs 4,1 Tage, p <0,001). PNA FISH identifiziert E. faecium eine mediane 2,3 Tage früher (1,1 vs 3,4 Tage, p <0,001) und wurde mit statistisch signifikante Reduktion in der Zeit der Einleitung wirksame Therapie (1,3 vs 3,1 Tage, p <0,001) und sank 30 Tage Sterblichkeit (26% vs 45%, p = 0,04). Diese kam zu dem Schluss, dass die E. faecalis / OE PNA FISH-Test in Verbindung mit einem AMT Therapie-Algorithmus führte zu einer frühzeitigeren Einleitung einer entsprechenden empirischen antimikrobiellen Therapie bei Patienten mit im Krankenhaus erworbenen E. faecium Bakteriämie.

1. Reagenzien dürfen nicht verwendet werden, nachdem die Verfallsdaten auf den Etiketten und Reagenzien aufgedruckt ist, soll in keiner Weise modifiziert werden können. Sie sollten in den Kühlschrank, wenn sie nicht in Gebrauch bleiben, oder sie konnten Potenz verlieren.
2. Blutkulturflaschen müssen vor der Probenahme vermischt werden.
3. Es ist wichtig, nicht zulassen, dass die Tropfflasche Spitze zu einem Blutausstrich zu berühren, da dies eine Kreuzkontamination von Material zwischen den Folien verursachen kann, oder eine Verunreinigung des Reagenz.
4. Stellen Sie sicher, das Wasserbad und Heizblock bei einer konstanten 55 ° C gehalten werden
5. Verwenden Sie keine Filter als die Dual-Band-Filter oder die Farben nicht klar zu erkennen.
6. Verwenden Sie keine Objektträger andere als die Mikropräparate oder Hybridisierung findet nicht statt.
7. Es ist wichtig, dass das Mikroskop richtig funktioniert. Stellen Sie sicher, das Mikroskop Lampe ist innerhalb der genehmigten Anzahl von Stunden für die Nutzung.

• Einige seltene vorkommende Enterococcus Spezies sind nicht von der PNA-Sonde hybridisieren anderen Enterococcus Spezies wie E. asinii, E.dispar, E. haemoperoxidus, E. cecorum, E. columbae, E. saccharolyticus, E. solitarius und E erkannt . schwefligen.
• E. moraviensis als E. identifiziert faecalis durch Sequenz Ähnlichkeiten.
• Einige Stämme von Streptococcus anginosus produzieren ein falsches Grün positive Fluoreszenz durch Sequenz Ähnlichkeiten.
• VersaTREK Blutkulturflaschen wurden während der klinischen Studien untersucht. Die Leistung von E. erkennen faecalis und andere Enterococcus spp. mit VersaTREK Blutkulturflaschen ist unbekannt.
• Falsch positive grüne Autofluoreszenz kann auftreten, wenn ein Standard-FITC-Filter wird anstelle des Dual-Band-Filter verwendet.
• Falsch negative Ergebnisse können selten auftreten aufgrund gemischter Wachstum oder aufgrund eines Fehlers in Assay-Technik.
• Die Art und Zustand der Instrumente verwendet werden, Einfluss auf die visuelle Erscheinung des Bildes erhalten. Die Fluoreszenz kann auf die Art von Mikroskop eingesetzt, der Lichtquelle und der Ebene der rRNA in den Zellen varydue
• Isolation auf festen Medien ist notwendig, um gemischte Wachstum mit anderen Organismen zu unterscheiden und die positive Blutkulturen was zu einem negativen Ergebnis zu identifizieren.
• Das Produkt ist nicht mit Exemplaren, die keine Blutkulturen validiert.

Materials

Reagents E. faecalis/– PNA FISH is comprised of the following kit components: Fixation Solution Fixation Solution 3 mL phosphate-buffered saline with detergent. E. faecalis/– PNA E. faecalis/– PNA 1.5 mL PNA probes in hybridization. solution. Contains 30% formamide. 60x Wash Solution 60x Wash Solution 50 mL Tris-buffered saline with detergent Mounting Medium Mounting Medium 3 mL photobleaching inhibitor in Glycerol Quality control slides AdvanDX