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Immunology and Infection

Um Procedimento de 1,5 horas para a Identificação de Enterococcus Espécies Diretamente de hemoculturas

doi: 10.3791/2616 Published: February 10, 2011

Summary

Um protocolo rápido para a identificação directa de Enterococcus faecalis e Enterococcus outras espécies a partir de uma hemocultura positiva usando um ácido nucléico Peptide fluorescentes em ensaio de hibridização in situ (FISH PNA).

Abstract

Enterococos são uma causa comum de bacteremia com E. faecalis sendo a espécie predominante seguida pela E. faecium. Porque a resistência à ampicilina e vancomicina em E. faecalis ainda é incomum em relação à resistência em E. faecium, o desenvolvimento de testes rápidos permitindo a diferenciação entre as espécies de enterococos é importante para a terapêutica adequada e vigilância da resistência. O E. faecalis OE teste FISH PNA (AdvanDx, Woburn, MA) usa espécie-específica de ácidos nucleicos peptídeo (PNA) sondas de fluorescência em formato de hibridização in situ e oferece um tempo para resultados de 1,5 horas e o potencial de fornecer informações importantes para a espécie-específicos o tratamento. Estudos multicêntricos foram realizados para avaliar o desempenho do E. 1,5 horas faecalis / OE procedimento FISH PNA em comparação com o procedimento de ensaio originais 2,5 horas e aos métodos de bacteriologia padrão para a identificação de enterococos diretamente de uma garrafa de sangue positivo cultura.

Protocol

1. Coleta e Preparação

  1. Coleta de sangue venoso de pacientes com suspeita de sepse e colocar em duas BACTEC (BD, Sparks, MD) garrafas de cultura de sangue, uma aeróbica e anaeróbica um, juntos, constituído por um conjunto de hemocultura.
  2. Coloque as garrafas no instrumento BACTEC 9240 a 35 ° C.
  3. Incubar até que o instrumento é acionado em alarme devido ao crescimento de organismos no frasco de cultura de sangue.
  4. Remover garrafa do instrumento hemocultura.

2. Preparação de reagentes antes da coloração

  1. Prepare a solução de lavagem adicionando 4 mL de solução de lavagem 60x seguido por 240 mL de água deionizada ou destilada fresca diretamente para o prato de coloração.
  2. Coloque o prato coloração nos 55 ° C banho-maria para aquecer.
  3. Armazenar os restantes concentrar a 2-8 ° C.
  4. Remover o meio de montagem do frigorífico e à temperatura ambiente.

3. Coloração Gram

  1. Agite suavemente o frasco de hemocultura.
  2. Usando uma agulha e seringa ou um aparelho de subcultura, remoção de sangue (cerca de 5 mL) da garrafa e coloque em um tubo de rosca estéril tampado.
  3. Usando uma pipeta estéril, coloque uma gota grande de sangue em uma lâmina de vidro.
  4. O ar seco do slide e fixar em metanol por 10 segundos.
  5. Permitir que deslize para o ar seco.
  6. Fazer a coloração Gram no filme de sangue para determinar a morfologia do organismo em crescimento no frasco de cultura de sangue.
  7. Usando uma lente de imersão em óleo, slides. Cocos Gram positivos em pares e cadeias curtas observada na coloração de Gram é mais consistente com espécies de Enterococcus.
  8. Este resultado Gram, em seguida, dirige a seleção do próprio kit sonda FISH PNA a ser usado para identificação bacteriana. Esta cultura de sangue serão coradas pela E. faecalis / OE PNA FISH mancha.

4. FISH PNA Stain

  1. Misture o tubo contendo o sangue gentilmente agitando antes da preparação de esfregaço.
  2. Coloque uma gota de solução de fixação sobre o bem de uma lâmina de microscópio FISH PNA.
  3. Transfira 10 mL ou uma pequena gota do tubo com a hemocultura positiva para a solução de fixação e misture delicadamente para emulsionar.
  4. Fixar os esfregaços pelo aquecimento por 20 min. a 55 ° C em uma placa de aquecimento.

5. Material de controlo de qualidade

Um positivo e outro negativo lâmina de controlo de qualidade devem ser testados com cada lote de slides para a coloração.

  1. Use E. faecalis / OE Controle Slides comprado de AdvanDx para esse fim ou preparar esfregaços de culturas líquidas de cepas de referência de E. faecalis e E. faecium como controle positivo quer em slides separados ou misturados em um slide e Staphylococcus spp ou Streptococcus spp como material de Controlo Negativo.

Os resultados QC deve ser capaz de monitorar as condições de ensaio adequadas, particularmente aquelas que afetam rigor hibridação e penetração da parede celular, uma vez que a metodologia PNA é projetado para otimizar a penetração da parede celular

6. Hibridização

  1. Adicione uma gota de E. faecalis / OE PNA para o bem na lâmina de microscópio com o esfregaço.
  2. Adicionar lamela. Evite bolhas de ar.
  3. Incubar por 30 ± 5 min. a 55 ± 1 ° C na placa de aquecimento
  4. Após lugar de incubação, as lâminas em porta corrediça

7. Lavar rigorosos

  1. Transportadora deslize mergulhar na solução de lavagem pré-aquecido a 55 ° C e remova cuidadosamente a lamínula. Muitas vezes, a lamela desliza suavemente agitando o slide na solução de lavagem. Ocasionalmente, a lamela deve ser delicadamente empurrado para fora com uma pinça.
  2. Incubar na solução de lavagem para 30 ± 5 min. a 55 ± 1 ° C.
  3. Remover as lâminas da solução de lavagem
  4. Permitir que o slide para o ar seco

8. Montagem

  1. Adicione uma gota de meio de montagem a cada slide
  2. Adicionar lamela. Evite bolhas de ar.
  3. Examine a lâmina em um microscópio de fluorescência dentro de 2 horas.
  4. Não exponha os slides para direcionar a luz do sol ou outras fontes de luz forte, pois isso pode levar a extinção de fluorescência.

9. Interpretação dos Resultados

O microscópio de fluorescência usado para exame de slides deve ser equipada com o Filtro de Banda AdvanDx dupla e um objetivo de petróleo 60x ou 100x. Os slides QC deve ser examinado primeiro a confirmar que a hibridização ocorreu. E. faecalis deve aparecer como verde brilhante cocos fluorescentes em vários campos de vista e os E. faecium aparecerá como vermelho brilhante cocos. Não enterococos lâmina de controlo deve aparecer nonfluorescent. Após a confirmação do sistema nos controles, as lâminas paciente pode ser examinado. No início, o sangue film aparecerá avermelhada, mas o vermelho e verde cocos será bastante aparente.

Figura 1
Figura 1. Exemplos representativos de verde-positivo E. faecalis (à esquerda), o vermelho positivo E. faecium (meio) e negativos (direita) de teste.

10. Resultados representante

Três instituições foram incluídos em um estudo clínico multicêntrico avaliando este PNA FISH mancha e comparando um protocolo de 2,5 horas com o protocolo encurtado 1,5 hora que acaba de ser revistos. Um total de 152 cocos Gram positivos de rotina em pares e correntes (GPC) garrafas de cultura positiva de sangue foram incluídos nos estudos. Houve 100% (152/152) concordância entre os resultados da modificação e do procedimento do ensaio original de E. faecalis / OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis; 33/33 enterococos e outros 78/78 GPC outros (Tabela 1). Este método de coloração tinha extraordinária sensibilidade e especificidade durante este ensaio clínico (Tabela 2).

Métodos de rotina E. faecalis / OE PNA Procedimento Padrão FISH E. faecalis / OE Procedimento PNA FISH curto
E. faecalis 41 41 (Verde Positivo) 41 (Verde Positivo)
E. faecium 27 27 (Red Positivo) 27 (Red Positivo)
E. casseliflavus 2 2 (Red Positivo) 2 (Red Positivo)
E. gallinarum 2 2 (Red Positivo) 2 (Red Positivo)
Outros Enterococcus spp. 2 2 (Red Positivo) 2 (Red Positivo)
S. pneumoniae 17 17 (negativo) 17 (negativo)
S. viridans 33 33 (negativo) 33 (negativo)
S. mitis 1 1 (negativo) 1 (negativo)
S. pyogenes 3 3 (negativo) 3 (negativo)
S. bovis 2 2 (negativo) 2 (negativo)
S. salivarius 1 1 (negativo) 1 (negativo)
S. sanguinis 2 2 (negativo) 2 (negativo)
S. agalagtae 7 7 (negativo) 7 (negativo)
Outros Streptococcus spp. 7 7 (negativo) 7 (negativo)
Abiotrophia spp. 3 3 (negativo) 3 (negativo)
Peptostrepococcus spp. 2 2 (negativo) 2 (negativo)
Total 152 152/152
100% de concordância
152/152
100% de concordância

Tabela 1. Listagem de bactérias testados usando tanto o padrão (2.5hr) e rápida protocolo (1,5 h).

E.faecalis sensibilidade Outros sensibilidade Enterococcus spp. Especificidade
100% (41/41)
IC 95% (93,0-100)
100% (33/33) 33/33
IC 95% (91,3-100)
100% (78/78)
IC 95% (96,2-100)

Tabela 2. Sensibilidade e Especificidade do protocolo de 1,5 horas FISH PNA.

Discussion

O E. faecalis / OE teste FISH PNA para Enterococcus pode fornecer identificação de 2-3 dias mais cedo do que métodos de cultura padrão. O procedimento abreviado para o ensaio (1,5 hourr) fornece a identificação rápida que pode ser usado para uma melhor abordagem terapêutica antimicrobiana e evolução de pacientes. Um estudo para apoiar esta foi realizada por Forrest, et al. (6). Mais de dois anos consecutivos a partir de 2005, o laboratório de microbiologia cocos Gram positivos identificados em pares e cadeias em crescimento em garrafas de cultura de sangue convencionais por métodos microbiológicos e, em 2006, adicionando a E. faecalis / OE FISH PNA. Além disso, um algoritmo de tratamento desenvolvido pela equipe instituições antimicrobianos (AMT) para efetivamente utilizar os dados PNA FISH gerado pelo laboratório em tempo hábil. Desfecho primário avaliado foi o tempo de cultura de sangue sorteio para a implementação da terapêutica antimicrobiana eficaz antes e depois de FISH PNA foi instituído no fluxo de trabalho laboratórios. Gravidade da doença local, paciente e terapia antimicrobiana empírica foram medidos. Um total de 224 pacientes com bacteremia hospitalar adquirida enterococos foram avaliados com 129 no período pré-intervenção e 95 no período FISH PNA. FISH PNA identificados E. faecalis 3 dias mais cedo do que as culturas convencionais (1,1 vs 4,1 dias, p <0,001). FISH PNA identificados E. faecium em média 2,3 dias mais cedo (1,1 vs 3,4 dias, p <0,001) e foi associado à redução estatisticamente significativa no tempo de se iniciar a terapêutica eficaz (1,3 vs 3,1 dias, p <0,001) e diminuição 30 dias mortalidade (26% vs 45%, p = 0,04). Este grupo concluiu que o E. faecalis / OE teste FISH PNA em conjunto com um algoritmo de tratamento AMT resultou em início precoce da terapia empírica antimicrobiano apropriado para pacientes com adquiridas no hospital E. faecium bacteremia.

  1. Reagentes não deve ser utilizado após a data de validade impressa nos rótulos e reagentes não devem ser modificados de qualquer forma. Eles devem permanecer na geladeira quando não em uso ou podem perder a potência.
  2. Garrafas de cultura de sangue precisam ser homogeneizado antes da amostragem.
  3. É importante para não permitir que a ponta frasco conta-gotas para tocar um esfregaço de sangue, porque isso pode causar a contaminação cruzada de material entre os slides, ou causar contaminação do reagente.
  4. Verifique se o banho de água eo bloco de aquecimento são mantidos em constante a 55 ° C.
  5. Não use outros filtros que o filtro Dual Band ou cores não serão claramente discernida.
  6. Não use lâminas de microscópio diferente do Lâminas de microscopia ou hibridização não irá ocorrer.
  7. É importante que o microscópio está funcionando corretamente. Verifique se a lâmpada do microscópio é aprovado dentro do número de horas de uso.
  • Algumas espécies raras de ocorrência Enterococcus não são detectados pela sonda PNA hibridação de espécies de Enterococcus, tais como E. asinii, E.dispar, haemoperoxidus E., cecorum E., columbae E., saccharolyticus E., E. e E solitarius . sulfurosos.
  • Moraviensis E. é identificado como E. faecalis devido a semelhanças seqüência.
  • Algumas cepas de Streptococcus anginosus produzir uma fluorescência verde falso positivo devido a semelhanças seqüência.
  • Garrafas de cultura VersaTREK sangue não foram avaliados durante os estudos clínicos. O desempenho para detectar E. faecalis e Enterococcus spp outros. com garrafas de cultura VersaTREK sangue é desconhecido.
  • Autofluorescência falso positivo verde pode ocorrer se um padrão FITC filtro é usado em vez do filtro Dual Band.
  • Resultados falso-negativos podem ocorrer com pouca freqüência devido ao crescimento misto ou por erro na técnica de ensaio.
  • O tipo e condição da instrumentação utilizada vai influenciar a aparência visual da imagem obtida. A fluorescência pode varydue com o tipo de microscópio de empregados, a fonte de luz eo nível de rRNA nas células
  • Isolamento em meios sólidos é necessária para diferenciar crescimento misturado com outros organismos e identificar hemocultura positiva gerando um resultado negativo.
  • O produto não foi validado com outras amostras de hemoculturas.

Disclosures

A produção deste vídeo-artigo foi patrocinado pela AdvanDx. Benjamin Cristal é um empregado de AdvanDx, que faz com que as ferramentas e os reagentes utilizados neste artigo.

Acknowledgments

Estudos foram patrocinados pela AdvanDx.

Materials

Reagents

E. faecalis/– PNA FISH is comprised of the following kit components:

  • Fixation Solution Fixation Solution 3 mL phosphate-buffered saline with detergent.
  • E. faecalis/– PNA E. faecalis/– PNA 1.5 mL PNA probes in hybridization. solution. Contains 30% formamide.
  • 60x Wash Solution 60x Wash Solution 50 mL Tris-buffered saline with detergent
  • Mounting Medium Mounting Medium 3 mL photobleaching inhibitor in Glycerol
  • Quality control slides
  • AdvanDX

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References

  1. Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes. Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. 42rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, San Diego, (2002).
  2. Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures. Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. 103rd Annual Meeting of American Society, 2003, Washington DC, (2003).
  3. Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes. Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. 104th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2005, New Orleans, LA, (2005).
  4. Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH & C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles. Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, (2006).
  5. Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications. Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, (2006).
Um Procedimento de 1,5 horas para a Identificação de<em> Enterococcus</em> Espécies Diretamente de hemoculturas
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Morgan, M. A., Marlowe, E., Novak-Weekly, S., Miller, J., Painter, T., Salimnia, H., Crystal, B. A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2616, doi:10.3791/2616 (2011).More

Morgan, M. A., Marlowe, E., Novak-Weekly, S., Miller, J., Painter, T., Salimnia, H., Crystal, B. A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2616, doi:10.3791/2616 (2011).

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