Summary
حقن الدم الذاتي نموذج نزيف داخل المخ في الفئران الموصوفة في هذا البروتوكول يستخدم تقنية الحقن المزدوج لتقليل خطر ارتداد الدم تصل المسار الإبرة ، أي مضادات التخثر في نظام الضخ ، ويزيل كل المساحة الميتة والأنابيب القابلة للتوسيع في النظام.
Protocol
1. إعداد التجهيزات
- مسح أسفل الإطار التجسيمي ومضخة الإيثانول مع 75 ٪ للحد من التلوث الجرثومي.
- هاميلتون تعقيم المحاقن والإبر تنصهر السيليكا.
ملاحظة : إذا تم استخدام التعقيم الكيميائي ، يجب التأكد من شطف عدة مرات في ماء معقم قبل الاستعمال. - يمسح سطح الورقة شمع البارافين مع الايثانول 75 ٪ والسماح ليجف.
2. إعداد الماوس للحقن
ملاحظة : هل الفئران تسليمها إلى مرفق حيوانك 7 أيام على الأقل قبل الجراحة للسماح لهم للتأقلم مع البيئة الجديدة والحد من التوتر.
- وزن الماوس قبل العملية الأساسية.
- تحريض التخدير مع الأوكسجين 30 ٪ ، وأكسيد النيتروز بنسبة 70 ٪ و 4 ٪ لا تستجيب حتى Isoflurane لقرصة الذيل
- حقن الفأر مع البوبرينورفين 0.1mg/kg intraperitoneally لتسكين بعد العملية الجراحية
- حلق الرأس
- عيون معطف مع الفازلين المعقم
- إعداد مسح فروة الرأس مع betadine 3 × ، والسماح لتجف ثم فروة الرأس
- جعل 1 سم الشق السهمي خط الوسط من فروة الرأس باستخدام مشرط الجراحة المعقمة
ملاحظة : هناك شق سخية تسمح التعرض كاملة من معالم الجمجمة. - حلق 1 سم من السطح البطني الذيل التي تبدأ في 1 سم من القاعدة والتحضير مع betadine × 3 مناديل
- مكان الماوس على الإطار التجسيمي
ملاحظة : من المهم لضمان تأمين الماوس في الإطار مع سطح مواز مع قاعدة الجمجمة من الإطار ، مع التعرض ممتازة وbregma لا يقل عن 3 ملم على يمين bregma.
3. نزف داخل المخ لعملية جراحية
ملاحظات : خلال جراحة كامل الفأر هو تخدير مع الأوكسجين 30 ٪ ، وأكسيد النيتروز بنسبة 70 ٪ ، وIsoflurane 1-3 ٪ ، حافظت باستمرار عند 37 ± 0.5 درجة مئوية باستخدام الثرمستور التي تسيطر عليها سادة التدفئة ومراقبتها بواسطة ترمومتر المستقيم.
- إبرة معقمة نعلق على 27 غ من حقنة سم مكعب 1 في الإطار.
- ضبط ذراع التجسيمي حتى الإبرة هو بالضبط مدى bregma.
- ضبط ذراع بحيث الإبرة في +2.5 ملم الجانبي لbregma والسفلى لسطح الجمجمة.
- تدوير المحاقن يدويا لجعل ثقب لدغ على سطح الجمجمة أثناء تطبيق الحركة الهبوطية لطيف من الإطار مع الحرص على عدم ثقب الجمجمة تماما.
- إزالة الإبرة ، وثقب لدغ كاملة يدويا مع حقنة / إبرة
ملاحظة : إكمال لدغ حفرة باليد يسمح للاعتراف الفوري عندما يكون لديك مثقبة الجدول الداخلي من الجمجمة ويقلل خطر من دون قصد دفع الإبرة في حمة الدماغ. - جعل شق عرضي على السطح البطني الذيل باستخدام شفرة جراحية معقمة ، والسماح 2-3 قطرات كبيرة من الدم الشرياني أن أسقط ورقة شمع البارافين. ثم وقف النزيف بسرعة مع الضغط باستخدام شاش معقم.
- سحب الدم 17 ميكرولتر الى حقنة حقنة هاميلتون ومكان على المضخة.
- ضبط ذراع التجسيمي إلى نقطة من 5 درجات النسبية إعلامي لمحور عمودي.
- ضبط دقيق بحيث الذراع التجسيمي رأس الإبرة هو أكثر من ثقب في الجمجمة ولدغ ثم انخفاض إبرة 3.5 ملم.
- 2 انتظر دقيقة ثم سحب الإبرة 0.5 ملم (بحيث غيض هو 3 ملم العميق)
- انتظر 5 دقائق للسماح للدماغ حول إبرة إعادة توسيع وتقليل المخاطر من الدم refluxing يصل المسار الإدراج خلال إبرة الحقن.
- لضخ دماء 1 ميكرولتر / دقيقة 7.5 ميكرولتر.
- انتظر 5 دقائق للسماح للتخثر الدم الأولي والأنسجة تحدث تحولات للحد من ارتفاع في الضغط داخل الجمجمة.
- ضخ ما تبقى من 7.5 ميكرولتر في 1 ميكرولتر / دقيقة
- إبرة تسمح لتبقى في مكانها لمدة 25 دقيقة للسماح لتخثر الدم
ملاحظة : عدم انتظار نتيجة تخثر الدم في الدم سوف يصل refluxing موقع إبرة عندما سحب الإبرة - تسحب الإبرة ببطء وشطف مع الماء الساخن على الفور لمنع أي الدم المتبقي في الإبرة من التخثر ، وضمان إعادة استخدام الإبرة.
- إزالة الماوس من الإطار وإغلاق الشقوق الذيل وفروة الرأس مع الغراء الجراحية البيطرية.
- إيقاف التخدير.
- السماح الماوس لتوقظ في حين يجري باستمرار مع تحسنت حرية الحصول على الغذاء مبلل.
- عودة إلى قفص مع الماوس عندما تتزاحم مستيقظا تماما. مكان رطب بيليه الغذائية على الجزء السفلي من القفص لمساعدة الحيوانات في الحصول على الغذاء.
4. ممثل النتائج :
الشكل 1. الاكليل الجزء من الدماغ الماوس 15 دقيقة بعد عملية جراحية ICH. التضحية فورا بعد تفتيشه من الدماغ للنجاح ICH على أساس التفتيش الجسيمة لقسم الاكليلية في موقع إبرة الإدراج. واعتبرت أن نزيف تعقبها وصولا الى قاعدة الدماغ ، بزيادة المسار الإبرة الماضي الجسم الثفني ، أو في البطينين ناجحة وأنه تم القضاء على الماوس من كل التحليلات. عموما ICH succeوكانت معدلات SS 75-85 ٪ في 50 مع معدل وفيات الفئران 0 ٪.
الشكل 2. اسطوانة اختبار يوضح فالج غادر مباشرة بعد ICH العقد القاعدية. (أ) الخلفية الفأر نموذج ICH بعد الجراحة. لاحظ موضع forelimb فقط الحق على جدار الاسطوانة بعد أن غادر ICH العقد القاعدية. (ب) رسم بياني لنتائج اختبار اسطوانة 1 من فوج من الفئران بعد ICH عملية جراحية (ن = 5) مقارنة زائفة (ن = 4). وكان خدعة الفئران جميع الإجراءات عدا حقن الدم (تم إدراج إبرة في الدماغ). وضعت الماوس في كل أسطوانة قطرها 12 سم ، والزجاج واضحة ، ولاحظ لمدة 20 المؤخرات. وسجل الموضع الأولي للالأمامية على جدار الاسطوانة في الخلفية. لم تكن الحركات وسجل لاحقة (مثل التنقيب الوحشي) حتى الماوس عاد إلى الأرض وسجل العمق المقبل. تم حساب المؤشر وتجانب (مواضع # forelimb على الجانب الأيمن من الاسطوانة -- غادر # المواضع forelimb) / (يمين # + # # + اليسار على حد سواء) ، حيث 0 لا تشير إلى تفضيل forelimb و 1 أشارت كانت تستخدم فقط في حق forelimb .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا النموذج من نزيف داخل المخ جراحية في الفئران باستخدام ذاتي النتائج الدم في الشريان الذيل نموذجا استنساخه من النزف العفوي العقد القاعدية. نموذج ICH في الفئران تقدم ميزة توافر الحيوانات المعدلة وراثيا للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية ، ولكن صغر حجمها يجعل إجراءات جراحة الأعصاب أكثر صعوبة من الناحية الفنية في جو من الحيوانات.
نموذج كولاجيناز وحقن الدم نموذج ذاتي هما راسخة نماذج من التراث الثقافي غير المادي التجريبي. في حين أن نموذج كولاجيناز يقدم أسهل النزف الداخلي واستنساخه للغاية 2 ، ويمكن للبروتين البكتيريا تستخدم للحط من الغشاء القاعدي أي تأثير محتمل التحقيق في الاستجابات الالتهابية الفطرية. بالإضافة إلى ذلك ، تعطلت BBB - كولاجيناز يمكن أن تسهل وصول المخدرات بصورة غير طبيعية في الدماغ خلال التجارب (على سبيل المثال ، العصبية) الدوائية. نموذج ICH الوارفارين المصاحب كما تم مؤخرا تطوير 3 ، والذي يسمح لتوسيع التحقيق لهذا النزف فرعية من المرضى. فوائد نموذج حقن الدم الذاتي وتشمل وجود الأضرار الميكانيكية المرتبطة التأثير الشامل ، وهو نظام عقيم دون البروتينات الخارجية ، والقدرة على القضاء على منع تخثر الدم من أجل التحقيق في تخثر الدم الطبيعي والتهاب المسالك بعد النزف العفوي ، والسيطرة على حجم بديعة من نزف. منذ كل الفئران التي لديها حجم النزف نفسه ، يمكن دراسة آثار التدخلات العلاجية على حد سواء الأنسجة والنتائج الفنية بدقة مع أحجام عينة صغيرة نسبيا.
ووصف العملية الجراحية هنا مشابهة لغيرها من النماذج المنشورة باستخدام حقن الدم الذاتي (4-7) ، واستندت عدة خطوات في البروتوكول الموقع في هذه البروتوكولات التي تم نشرها. تحسينات كبيرة في هذه التقنية تشمل القضاء على جميع الأنابيب وتوسيع مساحة ميتة في النظام ، والتي يمكن أن تتداخل مع يحتمل أن القياس الدقيق لحجم حقن الدم ، والقضاء على جميع مضادات التخثر ، وحجم النزيف الكبير معتدلة بالمقارنة مع نماذج أخرى من غير - anticoagulated الدم. A ICH UL 15 في المتوسط 450 UL حسابات الكبار مخ الفأر لمدة 3 ٪ من حجم المخ. هذا هو مماثل تقريبا لICH 40 مل في الرجل ، على افتراض العادي الدماغ البالغ متوسط حجم 1400 مل. هذا الحجم ICH النتائج في قياس العجز العصبية التي تستمر على مدى أسبوعين لدراسة الانتعاش مع الحفاظ على معدل وفيات صفر ، وهو أمر له أهمية عملية عند استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا مكلفة.
وينبغي رؤية مباشرة للقضاء على هذه الجراحة الأخطاء الشائعة والمساعدة في تخفيف من التكرار. نأمل أن يترجم هذا الى مزيد من التحقيق في آليات الإصابة وتسريع تطوير علاجات محتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وتم تمويل العمل على زمالة من معهد للطب والعلاج بالحركة ، ومنحة تدريبية من معهد للطب والهندسة (T32HL007954) في جامعة ولاية بنسلفانيا ولام كوهين مارلين وجيروم H. Fleisch منح الباحث في جامعة كونيتيكت مركز صحي (LHS) ، والمعاهد الوطنية للصحة NS - 029331 (فاو).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
- Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 39, 3397-3404 (2008).
- Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
- Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion. Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).
- Wang, J., Fields, J., Doré, S. The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood. Brain Research. 1222, 214-221 (2008).
- Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages. Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).
