Summary
Аутологичных модель инъекции крови внутримозгового кровоизлияния у мышей, описанные в этом протокол использует двойные технику инъекции, чтобы минимизировать риск рефлюкс крови до иглы трек, не антикоагулянтов в насосной системе, и уничтожает все мертвое пространство и сильфонные трубки в системе.
Protocol
1. Подготовка оборудования
- Протрите стереотаксической рамы и насоса с 75% этанола, чтобы минимизировать бактериального загрязнения.
- Стерилизовать Гамильтон шприц и иглу плавленого кварца.
Примечание: Если химической стерилизации используют, не забудьте промыть несколько раз в стерильной воде перед использованием. - Протрите поверхность парафина вощеной бумагой с 75% этанола и дать высохнуть.
2. Подготовка мыши для инъекций
Примечание: У мышей поставленный к вашему животному объекта по меньшей мере 7 дней до операции, чтобы дать им возможность привыкнуть к новой среде и снизить уровень стресса.
- Взвесьте мышь для дооперационной базовой линии.
- Вызвать анестезии с 30% кислорода, 70% Закись азота и 4% изофлюрана пока не реагируют на хвост щепотку
- Inject мышь с бупренорфин 0.1mg/kg внутрибрюшинно для послеоперационного обезболивания
- Бритье головы
- Пальто глаза стерильным вазелином
- Подготовка кожи головы с бетадин х 3 салфетки, затем позволяют сушить кожу головы
- Сделать 1 см средней линии сагиттального разреза кожи волосистой части головы использованием стерильного хирургического скальпеля
Примечание: щедрые разреза позволит полной экспозиции черепа ориентиры. - Бритье 1 см вентральной поверхности хвоста, начиная с 1 см от основания и подготовить с бетадин х 3 салфетки
- Место мыши на стереотаксической кадра
Примечание: Важно обеспечить мыши надежно установлен в раме с поверхности черепа параллельно с базой раму, с отличной экспозиции брегмы и не менее 3 мм справа от брегмы.
3. Внутримозговые кровоизлияния хирургии
Примечание: В течение всей операции под наркозом мышь с 30% кислорода, 70% закиси азота и 1-3% изофлюрана, постоянно поддерживается на уровне 37 ± 0,5 ° С с использованием термистора контролируемых грелку и контролируется ректального термометра.
- Прикрепить стерильной иглой 27 г на 1 куб шприц на раме.
- Отрегулируйте стереотаксической руку, пока игла точно над брегмы.
- Отрегулируйте руку так, чтобы игла находится в 2,5 мм бокового брегмы и ниже к поверхности черепа.
- Вручную повернуть шприц, чтобы сделать заусенцев отверстие на поверхности черепа, применяя нежное движение вниз кадров, стараясь не полностью перфорировать черепа.
- Удалите иглу и полной заусенцев отверстие вручную с помощью шприца / иглы
Примечание: Завершение заусенцев отверстие вручную позволяет немедленное признание, когда у вас есть перфорированные внутренней таблице черепа и минимизирует риск случайного нажатия иглу в мозг паренхимы. - Сделать поперечный разрез на брюшной поверхности хвоста стерильные хирургические лезвия и позволяет 2-3 крупные капли артериальной крови падают на парафин вощеной бумагой. Затем быстро остановить кровотечение с давлением, используя стерильную марлю.
- Вывод 17 мкл крови в шприце Hamilton и место шприц на насос.
- Отрегулируйте стереотаксической руку к точке 5 ° медиально по отношению к вертикальной оси.
- Тщательно регулировать стереотаксической руку так, чтобы кончик иглы находится над заусенцев отверстие в черепе и опустите иглу 3,5 мм.
- Подождите 2 минуты, затем снять иглы 0,5 мм (так, чтобы наконечник 3 мм глубиной)
- Подождите 5 минут, чтобы дать мозгу повторно расширить вокруг иглы и свести к минимуму риск образования кровяных кипячении до трека иглы во время инъекции.
- Inject крови 1 мкл / мин в течение 7,5 мкл.
- Подождите 5 минут, чтобы дать начальное свертывания крови и тканей сдвиги происходят, чтобы минимизировать повышение уровня внутричерепного давления.
- Inject оставшиеся 7,5 мкл на 1 мкл / мин
- Разрешить иглы остаются на месте в течение 25 минут, чтобы дать для свертывания крови
Примечание: Невыполнение ждать свертывания крови может привести к крови до кипячения сайт иглы при снятии иглы - Медленно извлеките иглу и сразу же промыть горячей водой, чтобы предотвратить любой остаточной крови в иглу от свертывания и обеспечению повторного использования иглы.
- Удалить мыши из кадра и закрыть хвоста и головы разрезы с ветеринарными хирургического клея.
- Выключите анестезии.
- Позвольте мыши, чтобы пробудить в то же время непрерывно нагревается со свободным доступом к смоченной пищи.
- Вернуться мыши клетку с однопометников, когда окончательно проснулся. Место влажный корм гранул на дне клетки, чтобы помочь животным в доступе к продовольствию.
4. Представитель результаты:
Рисунок 1. Корональные части мозга мышей через 15 минут после операции ICH. Сразу же после жертву мозг проверяется на ICH успеха, основанного на валовые проверки корональных секции в месте введения иглы. Кровотечения, которые выследили в основании головного мозга, что на иглу трек прошлом мозолистого тела, или в желудочки были признаны неудачными, и что мышь была исключена из всех анализов. Целом ICH succeсс ставки были 75-85% в 50 мышей с 0% смертности.
Рисунок 2. Цилиндр тестирования демонстрирует левый гемипарез после правого базальных ганглиев ICH. () Пример мыши задний после операции ICH. Обратите внимание на размещение только правой передней лапы на стенки цилиндра после левого базальных ганглиев ICH. (B) График 1 цилиндр тестирования результаты когорта мышей после ICH хирургии (п = 5) по сравнению с мнимой (п = 4). Шам мыши имели все процедуры, кроме крови инъекции (игла вставляется в мозг). Каждая мышь была помещена в 12-см в диаметре ясно стеклянный цилиндр и наблюдали в течение 20 тылы. Первичное размещение на передние стенки цилиндра был забит в тылу. Последующие движения (например, боковые разведка) не забил пока мышь вернулась на землю и на следующий задней забил. Латерализации индекс рассчитывается как (# правой передней лапы размещения на стороне цилиндра - # левой передней лапы размещения) / (# + # право левый + # и другое), где 0 не показал предпочтение передних конечностей и 1 указывается только правой передней лапы был использован .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это хирургический шаблон внутримозгового кровоизлияния у мышей использовании аутологичных результаты артерии кровь в хвост воспроизводимые модели спонтанного базальных ганглиев кровоизлияния. Модель ICH у мышей имеет то преимущество, наличие трансгенных животных для исследования патофизиологии, однако их небольшой размер делает нейрохирургических процедур технически более сложной, чем в более крупных животных.
Модель коллагеназы и аутологичных модель инъекции крови два устоявшихся моделей экспериментальных ICH. В то время как коллагеназа модель предлагает более простой процедурой и высокой воспроизводимостью кровоизлияние 2, бактериальный белок использовать для деградации базальной мембраны могут потенциально эффект любого расследования врожденных воспалительной реакции. Кроме того, коллагеназа-нарушена BBB может облегчить неестественно наркотиков доступ к мозгу во время фармакологические (например, нейропротекция) экспериментов. Варфарин связанных ICH модель также недавно были разработаны 3, которая позволяет исследовать кровоизлияния расширения для этой группы пациентов. Преимущества модели инъекции аутологичных крови, включают наличие механических повреждений, связанных с масс-эффекта, стерильные системы без экзогенных белков, возможность исключить антикоагулянтов с целью изучения природных коагуляции и воспаления путей после спонтанного кровотечения, и изысканные контроль над размером от кровоизлияния. Так как все мыши имеют одинаковый размер кровотечение, эффект терапевтических вмешательств по обе ткани и функциональные результаты могут быть изучены с точностью, с относительно небольшими размерами выборки.
Хирургическая процедура, описанная здесь похожа на других опубликованных моделей, использующих инъекции аутологичных крови (4-7), и несколько шагов в нашем протоколе были основаны на этих опубликованных протоколов. Значительные улучшения в этой технике включают ликвидацию всех сильфонные трубки и мертвое пространство в системе, которые потенциально могли бы помешать точного измерения объема крови, инъекции, ликвидация всех антикоагулянтов, и умеренно большие кровоизлияния объем по сравнению с другими моделями, не -антикоагулянтом крови. 15 мкл ICH в среднем 450 мкл взрослого мозга мыши составляет 3% от объема мозга. Это примерно сопоставимо с 40 мл ICH в человеке, предполагая, что нормальный средний объем мозга взрослого составляет 1400 мл. Этот объем ICH результаты в измеримых неврологического дефицита, которые сохраняются в течение двух недель для изучения восстановления при сохранении нулевой смертности, которая имеет практическое значение при использовании дорогих трансгенных животных.
Прямая визуализация эта операция должна устранить распространенные ошибки и помощь в легкости тиражирования. Надеемся, что это приведет к дальнейшему расследованию механизмы повреждения и ускорения развития потенциальных терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа финансировалась стипендию от Института трансляционной медицины и терапии, а также обучение грант от Института медицины и техники (T32HL007954) при Университете Пенсильвании и Марлен Л. Коэн и Джером H. Fleisch ученого грант на Университет штата Коннектикут Центр Здоровья (LHS) и NIH NS-029331 (FAW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
- Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 39, 3397-3404 (2008).
- Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
- Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion. Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).
- Wang, J., Fields, J., Doré, S. The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood. Brain Research. 1222, 214-221 (2008).
- Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages. Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).
