Summary
このプロトコルで説明されているマウスの脳内出血の自家血注入モデルでは、針のトラックまでの血液逆流、ポンプシステムにおける無抗凝固剤のリスクを最小限に抑えるために二重注入の技術を使用し、システム内のすべてのデッドスペースと拡張可能なチューブを排除。
Protocol
1。機器の準備
- 細菌汚染を最小限に抑えるために75％エタノールで定位フレームとポンプを拭う。
- ハミルトンシリンジとフューズドシリカニードルを滅菌する。
注：化学物質の滅菌が使用されている場合は、使用前に滅菌水で数回洗浄してください。 - 75％エタノールでパラフィンワックスペーパーの表面を拭き、乾燥させてください。
2。注射のためのマウスの準備
注意：それらが新しい環境に順応し、ストレスを軽減できるように、少なくとも7日間手術前に、動物施設に供給されるマウスを持っている。
- 術前のベースラインのためのマウスの重量を量る。
- テールピンチに応答するまで、イソフルラン30％酸素、70％亜酸化窒素、および4％で麻酔を誘発する
- 術後鎮痛のためにブプレノルフィン0.1mg/kg腹腔内にマウスを注入する
- 頭皮を剃る
- 無菌石油ゼリーでコーティングの目
- betadine × 3ワイプと頭皮を準備して、頭皮が乾燥することができます
- 滅菌外科用メスを使用して頭皮の1cm正中矢状切開を加えます
注：寛大な切開が頭蓋骨のランドマークの完全な露出をできるようになります。 - ベースから1cmとbetadineで準備× 3ワイプを開始する尾の腹側表面の1cmを剃る
- 定位フレームの上にマウスを置きます
注：これは、マウスが優れたブレグマの曝露とブレグマの右に3 mm以上で、フレームのベースと頭蓋骨の平行の表面でフレームに固定されるようにすることが重要です。
3。脳内出血の手術
注：全体の手術中にマウスが連続して37℃に維持イソフルラン30％酸素、70％亜酸化窒素、および1-3％、± 0.5℃のサーミスタ制御の加熱パッドを使用し、直腸温度計によって監視で麻酔です。
- フレームに1 ccシリンジに滅菌27グラムの針を取り付けます。
- 針が正確にブレグマ以上になるまで、定位固定アームを調整します。
- その針はブレグマの外側と頭蓋骨の表面に低い2.5ミリメートルになるようにアームを調整します。
- 手動で完全に頭蓋骨に穴をしないフレームテイクケアの穏やかな下方への移動を印加しながら頭蓋骨の表面にバリ穴を作るために注射器を回転させる。
- 注射器/注射針を使用して手動で針と完全なバリ穴を削除します。
注：あなたが頭蓋骨と誤って脳実質に針を押すのを最小限に抑えるリスクの内部表を穴あきがある場合、手作業でバリ穴を完了するには、即時認識することができます。 - 滅菌外科用ブレードを用いて尾の腹面に横切開を行い、動脈血の2-3大滴はパラフィンワックスペーパーの上に落ちるように。その後すぐに滅菌ガーゼを用いて、圧力で出血を止める。
- ポンプでハミルトンシリンジと場所のシリンジに17μLの血液を撤回。
- ポイント5に定位固定アームを調整して°の垂直軸に対して内側に相対的。
- 針のその先端が頭蓋骨のバリ穴と、下部針3.5ミリメートルを超えているので、慎重に定位固定アームを調整する。
- 2分後、針0.5mmの撤退を待つ（ように先端が深さ3mmである）
- 脳は、針の周りに再展開し、注入時の針挿入のトラックを還流血液の危険性を最小限にするように5分間待ちます。
- 7.5μLの血液1μL/分を注入する。
- 初期の血液凝固を可能にすると組織の変化のために頭蓋内圧の上昇を最小限に抑えるために発生する5分待ってください。
- 1μL/分で、残りの7.5μLを注入
- 針は、血液凝固を可能にするために25分のための場所の中に残さないように
注：血液凝固を待つに失敗すると、針を引き出す時に血液が針の挿入部位を還流につながる - ゆっくりと針を撤回し、直ちに凝固から針での残留血液を予防し、針の再利用性を確保するためにお湯で洗い流してください。
- フレームからマウスを削除し、獣医外科的接着剤で尾と頭皮切開を閉じてください。
- 麻酔の電源を切ります。
- 継続的に食物を湿らせて自由にアクセスできるように暖めている間に目覚めさせるマウスすることができます。
- 完全に目覚め同腹でケージにマウスを返します。食料へのアクセスに動物を助けるためにケージの底部に水分のある食品ペレットを置きます。
4。代表的な結果：
図1 15分ICHの手術後のマウス脳の冠状断面。直ちに脳を犠牲にした後は、針の挿入部位での冠状断面の総点検に基づいて、ICHの成功のために検査した。脳梁過去針のトラックまで、または心室に、脳の基底部にダウン追跡出血が失敗したとみなされ、そのマウスは、すべての分析から除外した。全体的なICH succeSS率が0％の死亡率で50匹に75から85パーセントでした。
図2。シリンダーテストでは、右大脳基底核のICHの後に左片麻痺を示しています。 ICHの手術後の（A）サンプルマウスの背面。左大脳基底核のICH後のシリンダーの壁にのみ右前肢の配置に注意してください。 （B）シャム（N = 4）と比較してICH手術（n = 5）は後のマウスのコホートから円筒試験1の結果のグラフを。偽のマウスは、血液の注射（針を脳に挿入された）を除いてすべての手順を持っていた。各マウスは、12 cmの直径の透明ガラス製のシリンダーに入れ、20後部のために観察された。シリンダーの壁に前肢の初期配置はリアごとに採点した。マウスが地面に戻り、次の後部がゴールするまで、後続の動きは（例えば横方向探査など）採点されていなかった。側性指数は、（シリンダーの側面に＃右前肢の配置 - ＃左前肢のプレースメント）として算出した（＃右+＃左+＃両方）/、0は右前肢が使用されたのみ示されているも前肢優先と1を示していない場所。
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Discussion
自発的な基底核出血の再現可能なモデルで自家尾動脈の血液の結果を使用してマウスの脳内出血のこの外科的モデル。マウスにおけるICHのモデルは、病態生理を調査するためにトランスジェニック動物の可用性の利点を提供しているが、その小さなサイズが大きい動物よりも脳神経外科手術はより技術的に困難になります。
コラゲナーゼのモデルと自家血注入モデルは、実験的な無形文化遺産の二つよく確立されたモデルです。コラゲナーゼのモデルは簡単に手順や再現性の高い出血2を提供しているが、基底膜を分解するために使用される細菌タンパク質は、潜在的に生得的な炎症反応の任意の調査に影響ことができます。さらに、BBBが不自然に薬理学的（例えば、神経保護）実験中に脳への薬へのアクセスを容易にすることができるコラゲナーゼは、破壊。ワルファリン関連ICHのモデルはまた、最近では患者のこのサブセットの出血の拡大の検討を可能にする3、開発されている。自家血注入モデルの利点は、質量効果、外因性タンパク質のない滅菌システム、自発的な出血後の自然な凝固と炎症の経路を調査するために抗凝固療法を排除する能力、およびサイズ以上の絶妙なコントロールに関連付けられている機械的損傷の存在が含まれています出血の。すべてのマウスが同じ出血の大きさを持っているので、組織と機能的転帰の両方の治療的介入の効果は比較的小さいサンプルサイズと精度で研究することができる。
ここで説明する外科手術は、自家血注入（4-7）を使用して、他の論文に掲載されたモデルに似ており、我々のプロトコルのいくつかのステップは、これらの公開されたプロトコルに基づいていた。この技術の大幅な改善は、潜在的に非の他のモデルに比べて血液の注入、すべての抗凝固剤の排除、そして適度に大出血量の体積の正確な測定を妨げることができるシステム内のすべての拡張可能なチューブとデッドスペースの排除を、含んで抗凝固剤の血液。脳の体積の3％の平均450 uLの成体マウスの脳のアカウントで15 ULのICH。これは男性の40 mLのICHにほぼ匹敵する、と仮定して通常の平均的な成人の脳容積は1400 mLです。高価なトランスジェニック動物を使用する際に実用的に重要であるゼロ死亡率を、維持しながら回復の研究のために2週間にわたって持続する測定可能な神経学的欠損のこのICH量は結果。
この手術の直接の可視化は、複製の容易さでよくある間違いや援助を排除する必要があります。うまくいけば、これは、傷害の機構にさらなる調査に翻訳し、潜在的な治療薬の開発を加速します。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
作業は、トランスレーショナル医学と治療のための研究所からのフェローシップ、およびペンシルベニア大学で医学と工学（T32HL007954）研究所から訓練助成金とマレーネL.コーエンとでジェロームH. Fleisch学者グラントによって資金を供給されたコネチカット大学保健センター（LHS）とNIH NS - 029331（FAW）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
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