Конкурентные Homing Анализы по изучению тропических Гут-Т-клеток миграции

Summary

Конкурентные самонаведения эксперименты позволяют непосредственно оценки миграционных свойства двух различных клеточных популяций в одной мыши. Здесь мы проиллюстрируем эту процедуру путем сравнения миграции бывших естественных генерируемых кишки тропических против не-клетках кишечника тропических T.

Abstract

Для того, чтобы осуществлять свои функции лимфоцитов нужно выходить из крови и мигрировать в различные ткани в организме. Лимфоцитов адгезией к эндотелиальных клеток и тканей экстравазации это многоэтапный процесс контролируется различных молекул адгезии (самонаведения рецепторы), выраженные на лимфоциты и их лигандами (addressins), представленные на эндотелиальные клетки ^{1 2.} Хотя функция этих рецепторов адгезии может быть частично изучен бывших естественных условиях, конечным критерием для их физиологическое значение заключается в оценке их роли в процессе в естественных лимфоцитов адгезии и миграции. Два дополнительных стратегии были использованы для этой цели: прижизненной микроскопии (IVM) и самонаводящиеся экспериментов. Хотя IVM было важно определить точный вклад специфические рецепторы адгезии во время адгезии каскада в режиме реального времени и в различных тканях, IVM это много времени и трудоемкий, он часто требует разработки сложных хирургических методов, необходимо предварительное выделение однородных клеточных популяций и позволяет анализ только одной ткани / органа в любой момент времени. В отличие от конкурентных самонаведения экспериментов позволяют прямой и одновременного сравнения в миграции из двух (или даже больше) ячейки подмножеств в той же мыши, и они также позволяют анализа многих тканей и большое количество клеток в одном эксперименте.

Здесь мы опишем классической конкурентной самонаведения протокол, используемый для определения преимуществ / недостатков данного типа клеток на главную конкретных тканей по сравнению с популяцией клеток контроля. Мы выбрали для иллюстрации миграционных свойств кишки по сравнению с тропическими без кишки тропических Т-клеток, так как слизистая оболочка кишечника является крупнейшим поверхности тела в контакте с внешней средой, и это также экстра-лимфоидной ткани с лучшими определенные миграционные требования . Кроме того, недавние работы установили, что витамин метаболит полностью транс-ретиноевой кислоты (РА) является основной молекулярный механизм, ответственный за склонение кишки специфическую адгезию рецепторов (интегрин a4b7and хемокинов рецептор CCR9) на лимфоцитах. Таким образом, можно легко генерировать большое количество кишки тропических и не тропических кишки лимфоциты исключая виво путем активации Т-клеток в присутствии или отсутствии РА, соответственно, может быть, наконец, используемые в конкурентной самонаведения экспериментах, описанных здесь.

Protocol

1. Ex естественных поколения кишки самонаведения и управления Т-клеток (см. рисунок 1)

1. Изолировать от спленоцитов затирания один из селезенки мышей дикого типа. Ресуспендируют клетки суспензии в PBS и центрифуги для 5 'при 400 х г. Удалить супернатант и лизировать эритроциты крови ресуспендированием осадок клеток в 4 мл ACK буфера для лизиса в течение 2-3 минут. После этого, добавьте 5 мл PBS. Центрифуга для 5 'при 400 мкг и удалите супернатант.
2. Ресуспендируют общего спленоцитов на 1 х 10 ⁶ / мл в IMDM + 10% FBS + 50 мМ 2-меркаптоэтанол + пенициллина / стрептомицина (полное IMDM). Отдельные клетки на две группы, одна из которых дополняется РА (или синтетические RAR-агонисты, такие как Am80 или Am580) до конечной концентрации 100-200 нм ^3. Т-клетки активируются в присутствии РА или RAR-агонистов будет upregulate a4b7and CCR9 и станет кишки тропических Т-клетки, в то время как Т-клетки активируются без РА станут контрольными клетками T.
3. Добавить 1.5-2.0 мл клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночного планшета ранее покрытых анти-CD3 (10 мг / мл) и анти-CD28 (10 мг / мл) и инкубируют при 37 ° С в 5% CO ₂ (для покрытия пластин добавить 500 мл / лунку анти-CD3 плюс анти-CD28 в ФБР и инкубировать в течение 2 часов при температуре 37 ˚ С и затем промыть в два раза с 2 мл PBS).
4. Для того чтобы избежать перевозбуждения T клетки, через 2-3 дня передачи клеточных суспензий в новую без покрытия 24-луночного планшета. Инкубировать дополнительные 2-3 дня. В зависимости от плотности и пролиферации клеток СМИ может стать кислоты (желтый), и в этом случае может быть необходимо заменить половину средств массовой информации со свежими полный IMDM. Урожай клеток после 4-5 дней (считая с первого дня 0).
5. Типичные окончательный урожай 1-2 х 10 ⁶ эффекторных Т-клеток / лунку. Таким образом, минимум 9-12 скважин каждого кишки тропических Т-клеток и контроль Т-клетки должны быть покрыты для того, чтобы в конечном итоге с 10-20 х 10 ⁶ Т-клеток в состоянии.

2. Анализ кишки самонаведения рецепторы на активированных Т-клеток

После 4-5 дней культуры мы должны соблюдать высокий уровень экспрессии кишки самонаведения рецепторов a4b7and CCR9 на Т-клетки активируются в присутствии РА или RAR агонисты, в то время как контроль Т-клетки должны выразить очень низкий уровень этих рецепторов ^4.

Проточная цитометрия (FACS) анализа.

1. Сбор между 0,2-0,5 x10 ⁶ клеток и центрифуги в течение 5 мин при 300 г при 4 ° C.
2. Инкубируйте с анти-CD4-FITC, анти-a4b7-PE (BD Biosciences), анти-CCR9 АПК (eBiosciences) и анти-CD8-PercP в течение 15 мин при 4 ° С в темноте.
3. После инкубации, центрифуги в течение 5 мин при 300 г 4 ° C. Вымойте и ресуспендирования клеток в окрашивании буфера и анализировать по СУИМ.

3. Т-клеток маркировки с трекеров CFSE и CMTMR ячейки

1. Держите все решения при температуре 37 ° C, прежде чем начать. Вымойте кишки тропических Т-клеток (a4b7 ^{Высокая} CCR9 ^{Высокий)} и контроль Т-клеток (a4b7 ^{Низкий / Neg} CCR9 ^{Низкий / Neg)} два раза PBS для удаления сыворотки. Отрегулируйте Т концентрация клеток до 10-15 х 10 ⁶ / мл в PBS.
2. Добавить CFSE (карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфир) или CMTMR (хлорметил-бензоил-амино-tetramethylrhodamine) флуорофоров либо кишки тропических Т и контроль Т-клеток в конечной концентрации 5 мм и 10 мм соответственно, мягко вихря и инкубировать 20 мин при 37 ° C. Рекомендуется, чтобы поменять маркировок в том же или в отдельном эксперименте, чтобы исключить потенциальные внутренние эффекты флуорофоров по миграции Т-клеток.
3. После инкубации, утолить с 1 объемом FBS и выдержать в течение 1-5 мин при комнатной температуре. Развести в 10 раз теплой PBS и центрифуги в течение 5 мин при 300 g. Промыть два раза PBS и ресуспендируют в полной IMDM.
4. В идеале, 10-20 х 10 ^{6 клеток} каждой популяции Т следует смешать в соотношении 1:1, а затем центрифугировали при 300 мкг в течение 5 мин. Наконец, ресуспендирования клеток в 200-250 мл теплой PBS и вводят через хвостовую вену.
5. Чтобы вычислить точное соотношение вход (в идеале близок к 1) сохранить 5-10 мл клеточной суспензии вводили и разводят 300 мл ФСБ и анализировать по СУИМ.

4. Анализ Т-клеток самонаведения

Хотя мыши могут быть проанализированы в различных точках времени (от 1 часа до нескольких дней после инъекции клеток T), самонаводящихся кишечника-тропных Т-клетки лучше документально между 12-24 ч после инъекции. Более моменты времени рост потенциального влияния других факторов, влияющих на окончательный числа клеток / коэффициенты, такие как Т апоптоз клеток и T выхода клеток из ткани. После мышей эвтаназии, клеточные суспензии из нескольких тканей должны быть изолированы без промедления, чтобы уменьшить гибель клеток, которые могут повлиять на конечный урожай и результаты. Ткани, представляющих интерес, тонкой кишки, толстой кишки, селезенки, лимфатических узлов, патчи Пейера, печени, легких и крови. Есливводили Т-клетки являются добросовестными кишки тропических Т-клетки, то они должны дома в среднем в 5-10 раз лучше (или выше) слизистой оболочки тонкой кишки по сравнению с контролем Т-клеток. Однако в других тканях, таких как кровь и селезенки, не должны показывать льготных миграции Т-клеток. Выделение лимфоцитов из кишечной собственная пластинка и интраэпителиальной отсеке было описано ранее ^5.

1. FACS окрашивания: Образцы ресуспендируют в зависимости от количества клеток собирается, при плотности не превышает 3,0 х 10 ⁶ клеток / мл. Если congenic CD45.1 ⁺ или ⁺ Thy1.1 мышей были использованы в качестве получателей, клетки окрашивали соответствующие congenic маркер (например, CD45.2 или Thy1.2) в сочетании с некоторой линии маркера (например, TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 ⁺ / CD45.2 ^+).
2. В ходе анализа FACS, клетки закрытого на congenic маркер (например CD45.1), а затем на специфические маркеры линии (например, CD4/CD8) и проанализированы для отношений между CMTMR и CFSE положительных клеток.
3. Данных, как правило, выражается в виде индекса самонаведения (HI), который рассчитывается как соотношение CFSE / CMTMR (или CMTMR / CFSE) в каждой ткани, деленное на соответствующее отношение вход (см. ниже). Если входной коэффициент очень близок к 1, то ткань отношений будет эквивалентна HI.

HI = CFSE _ткани / CMTMR _ткани: CFSE _ввода / CMTMR _вход

Кровь также должны быть проанализированы, чтобы определить, является ли как Т клеточных популяций в равной степени представлены в обращении, или если один Т-клеточной популяции снижается по отношению к другим (например, путем льготного захвата в легких / печени или снижением жизнеспособности). Это может произойти при сравнении наивным или отдыха Т-клеток памяти в сравнении с недавно активированных эффекторных Т-клеток, так как последняя может оказаться в ловушке в большей степени, в легких. Если HI в крови значительно отличается от 1, можно нормализовать HI в тканях HI в крови. Кровь может быть получена с помощью пункции сердца у мышей под наркозом (с авэртин или isofluorane до эвтаназии) и должна быть в два раза лизировали с ACK буфера перед его использованием для окрашивания СУИМ.

Кровь нормализации = HI _ткани / HI _крови

5. Представитель Результаты

Мыши-реципиенты (Thy1.1 ⁺⁾ были euthanized18h сообщение инъекции клеток. Суспензии клеток были получены из селезенки, периферических лимфатических узлов (PLN), брыжеечных лимфатических узлов (МЛН) и малых propia пластинки кишечника (LP). После этого клетки были окрашены для Thy1.2 и CD8, а затем анализируют FACS по литниковой на жизнеспособные Thy1.2 ⁺ CD8 ⁺ клеток, которые в итоге были проанализированы на соотношение между CMTMR ⁺ клетки (кишечник-тропных Т-клетки) и CFSE ⁺ клеток (контроль Т-клетки), разделенное на входной коэффициент. Результаты могут быть представлены как показано на рисунке 2, в которой он может быть понятно, что кишка-тропных и управления сетевыми Т-клеток в равной степени селезенки (HI близко ТО1, обозначается красной линией). В отличие от этого, кишечник-тропных Т-клетки мигрировали в 10 раз более эффективно, чтобы LP по сравнению с контролем Т-клеток.

Рисунок 1. Схема поколения и маркировки кишки тропических и не-клетках кишечника тропических Т Т-клетки, изолированные от мышей дикого типа и активированный с anti-CD3/anti-CD28 и в присутствии или отсутствии 100-200 нМ все - транс-ретиноевой кислоты (РА). После 4-5 дней лечения РА-Т-клетки приобретают выражение кишки самонаведения рецепторов CCR9 и a4b7. Затем кишки тропических и контроль Т-клетки являются дифференциально помечены CFSE или CMTMR, промывают, смешанных в соотношении 1:1 и вводят получателя мышь через хвостовую вену. Некоторые меченых клеток используются для определения CFSE / CMTMR вход отношение (должна быть близка к 1).

Figure2. Пример самонаведения анализ Мыши проанализированы 12-18 часов после инъекции Т клетки и клеточные суспензии одного получены от органов, представляющих интерес. Клетки окрашивали анти-Thy1.2 (congenic маркер), а также анти-CD8, а затем Thy1.2 ⁺ CD8 ⁺ Т-клеток, анализируются для отношения CMTMR ⁺ и CFSE ^{+ клеток} в каждой ткани СУИМ. Ткани CMTMR / CFSE соотношения затем нормированы Входной CMTMR / CFSE соотношение получить самонаведения индексов (HI). В этом примере ⁺ CMTMR и CFSE ⁺ клетки кишечника-тропных и контроля эффекторных Т-клеток, соответственно.

Discussion

Хотя самонаведения эксперименты дают очень ценную информацию о миграции от общего числа клеточных популяций в той или иной ткани, следует иметь в виду, что эти тесты не непосредственно анализировать эндотелиальной адгезии и, следовательно, не являлись дискриминационными по какой этап (ы) многоступенчатая адгезии каскад (связывание / прокат, активация или спекание) данного самонаведения рецептор действует. Золотым стандартом для определения специфической роли самонаведения рецепторов в адгезии каскада прижизненной микроскопии (IVM), в котором отдельные флуоресцентно меченных Т-клетки (или других клеток или даже флуоресцентно меченных бусы) являются непосредственным наблюдением взаимодействия с эндотелиальных клеток в реальном времени. Тем не менее, IVM требует много времени, требует мыши анестезии, предполагает трудоемкий хирургических процедур и потребностей до изоляции большого количества чистой и однородной популяции клеток для маркировки и введения. Более того, некоторые ткани, такие как центральная нервная система (ЦНС) и вилочковой железы, являются труднодоступными для IVM. Наконец, IVM подготовка требует иммобилизации ткани, которую трудно достичь в некоторых органах / тканях, таких как печень, легкие и кишечник (для детального обсуждения IVM см. ссылку. ^6).

С другой стороны, самонаводящихся эксперименты относительно легки в настройке, они могут быть сделаны на конкурентной основе совместного инъекционного два дифференциально помечены Т клеточные популяции, и они позволяют одновременное рассмотрение нескольких тканей / органов и клеточных популяций в одном эксперименте по FACS . В конкурентной самонаведения эксперименте целью является определить, что является относительным миграция один Т-клеточной популяции по отношению к другому (дифференциально помечены) Т клеточной популяции в различных тканях. Поскольку результаты выражаются в HI, анализы не требуют абсолютного подсчета клеток и результаты не зависит от количества вводимого Т-клетки, по числу изолированных / проанализированы Т-клеток в каждой ткани или возможные различия у животных / органов размер.

Эти преимущества несмотря на это, следует иметь в виду, что конкурентное самонаведения эксперименты не предоставляют информацию о фактической величине Т миграции клеток в каждой ткани. На самом деле, HI может вводить в заблуждение в тканях с очень плохой миграции Т-клеток и от которого очень мало Т-клетки могут быть обнаружены путем FACS, например, в не-воспаленной толстой кишки или ЦНС (несколько Т-клеток события, которые могут представлять крови загрязнение может приведет к огромным изменениям HI). Как правило, HI следует использовать только при наличии достаточного числа событий обнаруживаются СУИМ, так что по крайней мере один из меченых популяций Т-клеток может быть четко indentified в данной ткани.

Наконец, конкурентоспособность самонаведения экспериментов и HI расчеты должны быть идеально дополняется с абсолютной подсчета клеток Т-клеток (как правило, выражается в виде количества Т-клеток в ткани за 1 х 10 ⁶ общего вводили Т-клетки). Однако, определение абсолютного количества Т-клеток в каждой ткани есть много времени и ее надежность / воспроизводимости результатов будет зависеть от тщательного технику инъекции заверить, что большинство Т-клетки вводятся внутривенно и по эффективному Т изолятор из каждой ткани.

Таким образом, мы описали конкурентной самонаведения экспериментов между кишкой тропических и контрольными клетками T. Однако этот метод может быть применен ко многим другим лимфоидных клеток (например, наивные или активированные Т и В-клетки, Т _REG и др.), а также не-лимфоидных клеток (например, округ Колумбия, стволовые клетки, и т.д.). Таким образом, самонаводящиеся эксперименты дают простой, универсальный и мощный инструмент для изучения миграции клеток в живом организме.

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercapt–thanol.

ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).

PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).

Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.

T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.

Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.

Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).