Competitiva Ensaios Homing para Estudar Gut trópico-Migração de Células T

Summary

Competitiva homing experimentos permitem avaliar diretamente as propriedades migratória de duas populações celulares diferentes em um único rato. Aqui nós ilustrar este procedimento através da comparação da migração de ex-vivo gerado gut trópico-versus non-gut células T trópico.

Abstract

A fim de exercer sua função linfócitos necessidade de deixar o sangue e migram para diferentes tecidos no organismo. Adesão dos linfócitos às células endoteliais e extravasamento de tecido é um processo de várias etapas controladas por diferentes moléculas de adesão (receptores homing) expressa em linfócitos e seus ligantes respectivos (addressins) exibidos em células endoteliais ^{1 2.} Mesmo que a função desses receptores de adesão pode ser parcialmente estudou ex vivo, o teste final para sua relevância fisiológica é avaliar o seu papel durante na adesão de linfócitos vivo e migração. Duas estratégias complementares têm sido utilizados para esse fim: microscopia intravital (IVM) e experimentos homing. Embora IVM tem sido essencial para definir a contribuição precisa de receptores de adesão específicos durante a cascata de adesão em tempo real e em diferentes tecidos, IVM é demorado e trabalhoso, que muitas vezes requer o desenvolvimento de sofisticadas técnicas cirúrgicas, que necessita de isolamento antes de homogêneo populações de células e permite a análise de apenas um órgão, tecido / a qualquer momento. Pelo contrário, competitiva experimentos homing permitir a comparação direta e simultânea na migração de duas (ou mais) em subpopulações de células com o mouse mesmo e eles também permitem a análise de muitos tecidos e de um elevado número de células no mesmo experimento.

Aqui nós descrevemos o protocolo competitivo clássica homing usado para determinar a vantagem / desvantagem de um tipo de célula dado a casa para tecidos específicos, em comparação com uma população de células controle. Escolhemos para ilustrar as propriedades migratórias do intestino trópico-versus células não gut trópico-T, porque a mucosa intestinal é a superfície maior corpo em contato com o ambiente externo e também é o tecido extra-linfóides com os requisitos definidos pelo melhor migratórias . Além disso, trabalhos recentes determinou que a vitamina A, ácido all-trans retinóico metabólito (RA) é o principal mecanismo molecular responsável pela indução de receptores específicos gut-adesão (integrinas receptor de quimiocina a4b7and CCR9) em linfócitos. Assim, podemos facilmente gerar um grande número de gut-tropical e não gut trópico de linfócitos ex vivo pela ativação de células T na presença ou ausência de RA, respectivamente, o que pode ser finalmente utilizado nos experimentos competitivos homing descrito aqui.

Protocol

1. Geração ex vivo de células T gut-homing e controle (ver Figura 1)

1. Isolar esplenócitos por mashing um baço de camundongos de tipo selvagem. Volte a suspender as células em suspensão PBS e centrifugar por 5 'a 400 x g. Remover o sobrenadante e lise das células vermelhas do sangue pela ressuspensão do pellet celular em 4 ml de tampão de lise ACK por 2-3 minutos. Depois disso, adicione 5 ml de PBS. Centrifugar por 5 'a 400 xg e remover o sobrenadante.
2. Ressuspender esplenócitos total em 1 x 10 ⁶ / mL em IMDM + 10% FBS + 50 mM 2-mercaptoetanol + penicilina / estreptomicina (IMDM completa). Separar as células em dois grupos, um dos quais são complementados com RA (ou sintético RAR-agonistas, tais como Am80 ou Am580) para uma concentração final de 100-200 nM ^3. Células T ativadas na presença de RA ou RAR-agonistas vai upregulate a4b7and CCR9 e vai se tornar células do intestino trópico-T, enquanto que as células T ativadas sem RA vai se tornar as células T de controle.
3. Adicionar 1,5-2,0 mL da suspensão de células em cada poço de uma placa de 24 poços previamente revestidas com anti-CD3 (10 mg / ml) e anti-CD28 (10 mg / ml) e incubar a 37 ° C em 5% de CO ₂ (para o revestimento da placa de adicionar 500 ml / poço de anti-CD3-CD28, mais anti em PBS e incubar por 2 horas a 37 ˚ C e depois lave duas vezes com 2 ml PBS).
4. A fim de evitar a superestimulação das células T, após 2-3 dias de transferência das suspensões de células em um novo sem revestimento placa de 24 cavidades. Incubar por mais de 2-3 dias. Dependendo da densidade e proliferação celular a mídia pode tornar-se ácido (amarelo), caso em que pode ser necessário para substituir a metade da mídia com IMDM completa fresco. Colheita das células após 4-5 dias (contando do dia 0).
5. Típico rendimentos finais são 1-2 x 10 ⁶ células T efectoras / poço. Portanto, um mínimo de 12/09 poços de cada células do intestino trópico-T e células T de controle deve ser banhado, a fim de acabar com 10-20 x 10 ⁶ células T por condição.

2. Análise de gut-homing receptores nas células T ativadas

Após 4-5 dias de cultura, devemos observar uma alta expressão de receptores gut-homing a4b7and CCR9 em células T ativadas na presença de agonistas RA ou RAR, enquanto que as células T de controle deve expressar níveis muito baixos destas ^quatro receptores.

Citometria de fluxo análise (FACS).

1. Coletar entre 0,2-0,5 x10 ⁶ células e centrifugar por 5 min a 300 g a 4 ° C.
2. Incube com anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) e anti-CD8-PerCP por 15 min a 4 ° C no escuro.
3. Após a incubação, centrifugar por 5 min a 300 g 4 ° C. Lavar e ressuspender as células em tampão de coloração e análise por FACS.

3. T rotulagem celular com células trackers CFSE e CMTMR

1. Manter todas as soluções a 37 ° C antes de começar. Lavar as células do intestino-trópico T (a4b7 ^alta CCR9 ^Alta) e células controle T (a4b7 ^{Baixo / Neg} CCR9 ^{Baixo / Neg)} duas vezes com PBS para remover o soro. Ajuste a concentração de células T para 10-15 x 10 ⁶ / mL em PBS.
2. Adicionar CFSE (carboxifluoresceína succinimidyl éster) ou CMTMR (clorometil-benzoil-amino-tetrametilrodamina) fluoróforos para qualquer gut-trópico T e células T de controle para uma concentração final de 5 mm e 10 mm, respectivamente, gentilmente vortex e incubar por 20 min em 37 ° C. Recomenda-se trocar o bulas no mesmo ou em um experimento separado, a fim de excluir potenciais efeitos intrínsecos de fluoróforos em T migração celular.
3. Após a incubação, saciar com um volume de FBS e incubar por 1-5 min à temperatura ambiente. Diluir 10 vezes com PBS quente e centrifugar por 5 min a 300 g. Lave duas vezes com PBS e ressuspender em IMDM completa.
4. Idealmente, 10-20 x 10 ⁶ células de cada população T deve ser misturado na proporção de 1:1 e, em seguida, centrifugado a 300 xg por 5 min. Finalmente, voltar a suspender as células em 200-250 mL de PBS quente e injetar através da veia da cauda.
5. Para calcular a taxa de entrada exata (de preferência perto de 1) salvar 5-10 ml da suspensão de células injetadas e diluir com 300 mL de PBS e analisar por FACS.

4. Análise de células T homing

Embora os ratos podem ser analisados ​​em vários pontos do tempo (entre 1 h e vários dias após a injeção de células T), homing das células do intestino trópico-T é o melhor documentado entre 12-24 h após a injecção. Pontos mais tempo, aumentar os potenciais efeitos de outras variáveis ​​que afetam a célula final números / índices, como a apoptose de células T e saída de células T do tecido. Depois de os ratos são sacrificados, suspensões de células de vários tecidos devem ser isolados, sem demora, a fim de diminuir a morte celular, que pode afetar o rendimento final e resultados. Tecidos de interesse são o intestino delgado, cólon, baço, linfonodos, placas de Peyer, fígado, pulmões e sangue. Se oinjetaram células T são bona fide células do intestino trópico-T, devem casa, em média 5-10 vezes melhor (ou superior) para a mucosa do intestino delgado em relação ao controle de células T. No entanto, outros tecidos, como sangue e do baço, não deve apresentar uma migração de células T preferencial. Isolamento de linfócitos da lâmina própria intestinal eo compartimento intra-epitelial tem sido descrito anteriormente ^5.

1. Coloração FACS: As amostras são ressuspenso dependendo do número de células coletadas, com uma densidade não superior a 3,0 x 10 ⁶ células / ml. Se congênitas CD45.1 ⁺ ou ⁺ Thy1.1 ratos foram usados ​​como receptores, as células são corados com o marcador correspondente congênitas (por exemplo, ou CD45.2 Thy1.2) combinado com algum marcador de linhagem (por exemplo, TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 ⁺ / CD45.2 ^+).
2. Durante a análise do FACS, as células são fechadas no marcador congênitas (por exemplo, CD45.1) e, em seguida, os marcadores de linhagem específica (por exemplo, CD4/CD8) e analisadas para as relações entre CMTMR e células CFSE positivo.
3. Os dados é geralmente expressa como o Índice de Homing (HI), que é calculado como a relação CFSE / CMTMR (ou CMTMR / CFSE) em cada tecido dividido pela relação de entrada correspondente (veja abaixo). Se a relação de entrada é muito próximo de 1, então as razões de tecido será equivalente à HI.

HI = CFSE _{tecido tecido} / CMTMR: _Entrada CFSE _input / CMTMR

De sangue também devem ser analisados ​​a fim de determinar se as duas populações de células T são igualmente representados na circulação ou se uma população de células T está diminuído relação ao outro (por exemplo, prendendo preferencial nos pulmões / fígado ou por viabilidade diminuída). Isso pode acontecer quando se comparam as células de memória T naïve ou descansando contra recentemente activado células T efetoras, já que este último pode ser preso em maior medida nos pulmões. Se o HI no sangue é significativamente diferente de 1, pode-se normalizar HI nos tecidos pelo HI no sangue. Sangue pode ser obtido através de punção cardíaca de ratos anestesiados (com Avertin ou isofluorano eutanásia antes) e devem ser lisadas por duas vezes com tampão ACK antes de o utilizar para a coloração FACS.

Normalização de sangue = HI _{Sangue tecido} / HI

5. Resultados representante

Camundongos destinatário (Thy1.1 ⁺⁾ foram euthanized18h injeção de células post. Suspensões de células foram gerados a partir do baço, linfonodos periféricos (PLN), linfonodos mesentéricos (MLN) e lâmina própria do intestino delgado (LP). Depois que as células foram coradas para Thy1.2 e CD8 e depois analisados ​​por FACS pela passagem de células viáveis ​​Thy1.2 ⁺ CD8 ^+, que finalmente foram analisadas para a relação entre as células CMTMR ⁺ (células T gut-trópico) e CFSE ⁺ (células de controlo T) dividido pela relação de entrada. Os resultados podem ser exibidos como mostrado na Figura 2, em que pode ser apreciado que as células do intestino trópico e controle T homed igualmente para o baço (HI perto para 1, indicada por uma linha vermelha). Em contraste, as células do intestino trópico-T migraram cerca de 10 vezes mais eficiente para o LP em relação ao controle de células T.

Figura 1:. Diagrama mostrando a geração e rotulagem de gut-tropical e não-gut células T trópico células T são isolados de camundongos do tipo selvagem e activado com anti-CD3/anti-CD28 e na presença ou ausência de 100-200 nM todos - trans ácido retinóico (AR). Depois de 4-5 dias RA-tratados células T adquirir a expressão de receptores do intestino homing CCR9 e a4b7. Então, as células do intestino trópico e controle T são diferencialmente marcada com CFSE ou CMTMR, lavado, misturado na proporção de 1:1 e injetado em um rato destinatário através da veia da cauda. Algumas células marcadas são usadas para determinar a relação de entrada CFSE / CMTMR (deve ser próximo a 1).

Figura 2:. Mice Exemplo de análise homing analisados ​​12-18 h pós-injeção de células T e suspensões única célula são obtidos a partir dos órgãos de interesse. As células são corados com anti-Thy1.2 (marcador congênitas) mais anti-CD8 ⁺ e depois Thy1.2 células T CD8 ⁺ são analisados ​​para a relação entre CMTMR ⁺ e ⁺ CFSE células em cada tecido por FACS. O tecido CMTMR / CFSE índices são normalizados pela entrada relação CMTMR / CFSE para obter os índices de homing (HI). Neste ⁺ CMTMR exemplo e CFSE células são ⁺ gut-tropical e as células T efetoras controle, respectivamente.

Discussion

Apesar de experimentos homing fornecer informações valiosas sobre a migração de populações de células totais em qualquer dado tecido, ele deve ser mantido em mente que estes ensaios não analisam diretamente adesão endotelial e, portanto, não discriminar em qual etapa (s) da adesão de várias etapas cascata (tethering / rolamento, ativação ou furar) um determinado receptor homing está agindo. O padrão ouro para definir o papel específico dos receptores de homing na cascata de adesão é de microscopia intravital (IVM), na qual cada fluorescente etiquetado células T (ou outras células ou até mesmo contas fluorescente etiquetado) são diretamente observados interagindo com células endoteliais em tempo real. No entanto, IVM é demorado, exige anestesia mouse, implica trabalhoso procedimentos cirúrgicos e necessidades de isolamento antes de um grande número de populações de células puro e homogêneo para a rotulagem e injeção. Além disso, alguns tecidos, como o sistema nervoso central (SNC) e do timo, são de difícil acesso para IVM. Finalmente, os preparativos IVM requerem imobilização do tecido que é difícil de alcançar em alguns órgãos / tecidos, como fígado, pulmões e intestino (para uma discussão detalhada sobre IVM ver ref. ^6).

Por outro lado, as experiências homing são relativamente fáceis de configurar, que pode ser feito competitivamente por co-injeção de duas populações de células diferencialmente rotulados T, e permitem que a análise simultânea de múltiplos tecidos / órgãos e populações de células em um único experimento por FACS . Em uma experiência competitiva homing o objetivo é determinar o que é a migração relativa de uma população de células T que diz respeito a uma outra população de células (diferencialmente rotulados) T em diferentes tecidos. Como os resultados são expressos como HI, as análises não requerem contagens de células absolutas e os resultados não são afetadas pelo número de injetaram células T, pelo número de isolados / analisados ​​células T em cada tecido ou por eventuais diferenças de animais / órgãos tamanho.

Estas vantagens não obstante, deve-se ter em mente que experimentos homing competitiva não fornecem informações sobre a magnitude real da migração de células T em cada tecido. Na verdade, HI pode ser muito enganador em tecidos com a migração de células T muito pobres e da qual as células T muito poucos podem ser detectados por FACS, como no cólon não-inflamadas ou SNC (poucos eventos de células T que pode representar contaminação sanguínea pode resultar em grandes variações no HI). Como regra geral, HI deve ser usado somente quando um número suficiente de eventos são detectados por FACS, para que pelo menos uma das populações de células T rotulado pode ser claramente identificada em um dado tecido.

Finalmente, experimentos competitivos homing e cálculos HI deve ser idealmente complementada com célula absoluta contagem de células T (geralmente expressa como o número de células T em um tecido por 1 x 10 ⁶ total de células injetadas T). No entanto, a determinação do número absoluto de células T em cada tecido é demorado e sua confiabilidade / reprodutibilidade dependerá técnica de injeção cuidadosa para assegurar que a maioria das células T são injetadas por via intravenosa e no isolamento de células T eficiente de cada tecido.

Em resumo, temos descrito competitiva experimentos homing entre gut-tropical e células T de controle. No entanto, este método pode ser aplicado a muitas outras células linfóides (por exemplo, T ingênuo ou ativados e células B, T _REG, etc) e também para não-linfóides células (por exemplo, DC células-tronco, etc.) Assim, experimentos homing fornecer uma ferramenta simples, versátil e poderoso para estudar a migração celular in vivo.

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercapt–thanol.

ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).

PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).

Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.

T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.

Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.

Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).