Summary
Nous décrivons une méthode peu invasive et indolore pour mesurer la force musculaire des membres postérieurs canine et de la réponse musculaire à répétition des contractions excentriques.
Abstract
Nous décrivons une méthode peu invasive et reproductible pour mesurer la force pelvienne canines musculaire des membres et de la réponse musculaire à répétition des contractions excentriques. Le membre pelvien d'un chien anesthésié est immobilisé dans un cadre stéréotaxique pour aligner le tibia à angle droit sur le fémur. Adhésif envelopper appose sa patte à une pédale montée sur l'arbre d'un servomoteur pour mesurer le couple. Stimulation nerveuse percutanée active les muscles des membres postérieurs de la patte soit poussée (extension) ou tirer (flex) contre la pédale de générer un couple isométrique. La stimulation percutanée du nerf tibial active muscles extenseurs tibiotarsienne. Répétée excentrique (allongement) des contractions sont induites dans les muscles fléchisseurs tibiotarsienne par stimulation percutanée du nerf tibial. Le protocole se compose d'un excentrique contraction initiale suivie d'une isométrique étirer forcé imposé par le servomoteur. La rotation efficace allonge le muscle alors qu'il contrats, par exemple, une contraction excentrique. Lors d'une stimulation des muscles fléchisseurs sont soumis à une vue isométrique 800 ms et 200 ms contraction excentrique. Cette procédure est répétée toutes les 5 sec. Pour éviter la fatigue, 4 min de repos qui suit toutes les 10 contractions avec un total de 30 contractions effectuées.
Protocol
1. La mise en place pour l'expérience
- Charger le contrôle dynamique de muscle (DMC) de logiciels.
- Mettez les instructions du fabricant physiologie rig suivante.
- Exécution du logiciel de DMC:
Il est supposé que le matériel est connecté à l'ordinateur qui exécute le logiciel DMC, et que le système est calibré. Le logiciel peut être révisée de temps en temps, par conséquent, des instructions sont fournies ci-dessous correspondant à la version actuelle du logiciel que nous utilisons. Lorsque le logiciel est ouvert, il est déjà en marche.
L'utilisateur peut d'abord écrire un protocole de DMC (par exemple, pour stimuler à 50 Hz pour 1,5 s pour produire un tétanos isométrique) et le protocole peuvent ensuite être sauvegardés pour un usage ultérieur. Nous utilisons deux protocoles standard: (1) Protocole contraction isométrique (par exemple, contraction ou le tétanos) et (2) excentriques extensible blessures protocole. Nous commençons avec le protocole contraction isométrique de la contraction. Afin d'optimiser la contraction, l'écran du moniteur sorties est utilisée; couple généré lors de la contraction peut être observé que les électrodes sont déplacés. Lorsque la réponse à contraction maximale est atteinte, les données sont recueillies par un retour à l'écran principal (sélectionnez Continuer) et en sélectionnant Begin et Terminé. Les fichiers sont enregistrés de la Save As fenêtre pop-up. Avec les électrodes maintenues dans la même position, le tétanos (50 Hz) est ensuite recueilli et sauvé. Lorsque tous les contractions isométriques sont terminées, l'excentrique extensible blessures protocole peut être chargé et exécuté. Parce qu'il ya une série de contractions d'être exécutés dans ce protocole (10 contractions), sur l'écran principal de la Course Un bouton est sélectionné pour révéler Run Tous statut. Maintenant lorsque Begin est sélectionnée, une course tous les protocoles fenêtre pop-up apparaît qui demande le nom du fichier racine et le répertoire dans lequel les fichiers doivent être sauvegardés. Ensuite, démarrez la série d'épreuves Protocole et Done sont sélectionnés pour initier le protocole excentrique. Les fichiers sont sauvegardés automatiquement dans le répertoire sélectionné.
2. Positionnement de l'animal dans l'appareil de la physiologie
- Soins aux animaux et l'utilisation du comité (ACUC) des lignes directrices doivent être suivies pour toutes les procédures impliquant des animaux.
- Anesthetize chien en utilisant une anesthésie par inhalation (comme l'isoflurane) selon le protocole approuvé. Vérifiez réflexe de clignement d'être sûr que l'animal est profondément anesthésié. CO 2 la surveillance, l'oxymétrie de pouls et la température doivent être étroitement surveillés pendant toute la procédure. Nous utilisons généralement le propofol pour l'induction suivie par sévoflurane pour l'anesthésie par inhalation.
- Raser les poils autour de l'étouffer latéraux (genou), où les électrodes de stimulation sera placé (c'est à dire, l'aspect latéral de la jambe commence à la tête du péroné à 2-3 cm en aval du grand trochanter.
- Chien de position sur la table la physiologie en décubitus dorsal avec le membre pelvien placé de sorte que le fémur et le tibia un angle droit, et le tibia est parallèle à la table. Soit la branche droite ou de gauche peuvent être testés.
- Avant de fixer à la patte de chien force à la pédale, vérifier pour s'assurer que la pédale de force est clair et sûr de tourner. Suivre la mise sous tension du gréement procédure pour la physiologie et d'activer la pédale. Remarque: la pédale de la force doit être "raide" lorsque l'utilisateur tente de le déplacer manuellement.
- Doucement reste la patte du chien dans la pédale; mesurer et enregistrer la longueur de la patte du chien à partir de l'axe central de rotation à la fin du chiffre latérale.
- Fixez la patte dans la pédale aide d'un élastique auto-adhésif envelopper.
3. Couple contraction isométrique (flexion tibiotarsienne)
- Suite à un contrôle de sécurité, connectez stériles monopolaire blindé de calibre 24 électrodes de stimulation à l'unité d'isolement de relance (UES).
- Réglez le stimulateur: sortie impulsion continue à 1 Hz (1 impulsion par seconde)
- Paramètres du logiciel: charger le protocole contraction isométrique (sur le protocole de chargement écran principal de sélection). Le bouton One Run devrait être visible à côté du bouton Begin. Cela garantit que le protocole est d'exécuter une seule fois.
- Avec les mains gantées, nettoyer la peau avec de l'alcool, et palper le nerf fibulaire commun juste en aval de la fibula latéral proximal. Avec un doigt marquant le territoire du nerf, insérer délicatement la cathode (noire) d'électrodes sous la peau et juste externes au périoste. L'électrode doit être placée parallèlement à la surface de la peau à une profondeur d'environ 2cm, suffisante pour empêcher l'électrode de se déplacer quand la main est retirée.
- Placez l'anode (rouge) d'électrodes sous la peau, parallèle et légèrement distale par rapport à l'électrode de cathode. Les deux électrodes doivent maintenant être interne à l'nerf fibulaire commun juste en aval de la tête du péroné.
- Activer la stimulationTor à 1 Hz. Observez les réactions contraction sur le moniteur. Faire de petits ajustements dans la position des électrodes pour obtenir l'amplitude plus grande contraction possible. L'électrode doit être entièrement retiré et remplacé dans trois à quatre tranches de ½ cm parallèlement au tibia à trouver la réponse le plus grand contraction. Ceci est une composante essentielle de la procédure et le plus grand soin doit être pris pour trouver la réponse la plus importante.
- Inscrire les réponses contraction en quittant l'écran du moniteur Sorties (sélectionnez Continuer), puis sélectionnez Terminé Begin et de collecter les données. Enregistrez le fichier avec le nom du fichier souhaité dans la Save As fenêtre pop-up. Eteignez le stimulateur.
4. Isométrique couple tétaniques (flexion tibiotarsienne)
- Sans déplacer les électrodes, modifier les paramètres stimulateur à 50 Hz pour 1,5 sec et activer la fonction de déclenchement externe. Cela permet au stimulateur à être activé par le logiciel.
- Les paramètres du logiciel: Le protocole de contraction isométrique même est utilisée pour recueillir la réponse tétaniques que pour la contraction. En supposant que les électrodes de stimulation n'ont pas été déplacés, Begin et Done sont sélectionnées pour produire le tétanos. Dans le protocole isométrique pour produire un tétanos, le stimulateur est déclenchée par le logiciel afin de maintenir la synchronisation correcte. Enregistrer la réponse tétaniques dans la Save As fenêtre pop-up.
5. Protocole excentrique
- Sans déplacer les électrodes, modifier les paramètres stimulateur: 50 Hz pour 1 sec (100V), et activer la fonction de déclenchement externe. Cela permet au stimulateur à être activé par le logiciel.
- Les paramètres du logiciel: charger le protocole étirer excentriques blessure, une commande au servomoteur pour tourner de 29 degrés (30 degrés est le maximum). Sélectionnez Exécuter tous. Sélectionnez Commencez, entrez le nom du fichier racine pour la série excentrique de fichiers et le dossier dans lequel ils doivent être sauvés. Sélectionnez Démarrer la série d'épreuves Protocole, puis sur Terminé pour lancer le protocole.
- Dans ce protocole le stimulateur est réglé pour être déclenché par le logiciel afin de maintenir la synchronisation correcte. Comme la réponse à chaque contraction excentrique apparaît sur l'écran, il est automatiquement sauvegardé.
- Une période de repos quatre minutes suit chaque série de dix contractions excentriques.
- Collecter un total de 30 contractions excentriques (trois séries de dix contractions; chaque ensemble séparé par une période de repos quatre minutes).
6. Couple contraction isométrique (extension tibiotarsienne)
- Répétez le protocole contraction ci-dessus, mais placer les électrodes perpendiculairement à la peau et proximale à l'emplacement des électrodes originales pour le protocole de flexion. Le nerf tibial est stimulé comme il caudalement cours et en aval dans le ventre du muscle gastrocnemious. Jumelés stimulant et électrodes de référence sont placés profondément dans la musculature caudale et juste en amont de l'étouffer. Le point approximatif de placement est long d'une ligne bissectrice de l'angle formé par 90o du grasset (genou). Parce que le nerf tibial est plus profond (et caudale) pour le nerf fibulaire commun, les électrodes doivent être placées dans plusieurs domaines afin d'obtenir les potentiels contraction optimale. Ceci est une composante essentielle de la procédure. Remarque: les tracés de couple pour tibiotarsienne contraction et de la tétanie apparaîtra inversée par rapport à la flexion tracés tibiotarsienne.
7. Isométrique couple tétaniques (extension tibiotarsienne)
- Sans déplacer les électrodes, modifier les paramètres stimulateur à 50 Hz pour 1,5 sec et activer la fonction de déclenchement externe. Cela permet au stimulateur à être activé par le logiciel.
- Les paramètres du logiciel à: 50 Hz pour 1,5 sec et activer la fonction de déclenchement externe. Cela permet au stimulateur à être activé par le logiciel.
- Les paramètres du logiciel: Le protocole de contraction isométrique même est utilisée pour le tétanos que pour la contraction. En supposant que les électrodes de stimulation n'ont pas été déplacés, Begin et Done sont sélectionnées pour produire le tétanos.
- Dans le protocole isométrique pour produire un tétanos, le stimulateur est déclenchée par le logiciel afin de maintenir la synchronisation correcte. Enregistrer la réponse tétaniques dans le menu déroulant Enregistrer fenêtre Fichier.
8. L'analyse des données
- Analyse dynamique des muscles (DMA) programme (Aurora scientifique) est utilisé pour obtenir le couple et les informations recueillies auprès de contraction temporelle, des contractions tétaniques et excentrique.
- Exécution du programme DMA: Le logiciel peut être révisée de temps en temps, par conséquent, des instructions sont fournies ci-dessous correspondant à la version actuelle du logiciel que nous utilisons. Lorsque le logiciel est ouvert, il DMA ne fonctionne pas. Pour activer le programme, sélectionnez le bouton flèche blanche dans le coin supérieur gauche. Le logiciel DMA a un certain nombre de fonctions, mais pour notre buts, seules quelques fonctions pertinentes seront décrites.
Charger un fichier à analyser:? Le fichier de données récentes Recharger ou de nouveaux fichiers de données fenêtre pop-up apparaît lorsque le programme DMA est démarré. Sélectionnez Nouveau, dans la prochaine fenêtre, sélectionnez Labview; dans la fenêtre suivante, sélectionnez le dossier approprié et le fichier; sélectionnez Ouvrir. Sélectionnez Supprimer Terrain Filter pour supprimer cette fenêtre. Entrez une fréquence de filtre dans la boîte de fréquence de coupure. Filtre de fréquence optimale devra être déterminée sur la base des données spécifiques à être évaluée. Comme exemple, nous utilisons 30 Hz pour nos réponses isométrique et 10 Hz pour les réponses excentriques. Sélectionnez l'option Utiliser le bouton données filtrées. Sous tracer des données, sélectionnez Groupe filtrée. Utilisez les deux barres de slide à la base pour développer l'affichage et de se déplacer dans le fichier. - Analyse Twitch (Fig 1): En supposant que le fichier est chargé et les étapes ci-dessus sont terminées, définir la position des curseurs: Il ya 3 curseurs: (1) bleu (2), jaune et (3) blanc. Pour tics isométriques et tetani ou d'autres contractions isométriques, le bleu est fixé à l'endroit où le couple monte à partir du couple de repos, le jaune est placée là où le couple retourne au couple de repos (c'est à dire après la phase de relaxation), le blanc est placé pour le droit de le curseur jaune (pas nécessaire). Les curseurs sont déplacés facilement avec le bouton gauche enfoncé sur la souris et en déplaçant le curseur choisi pour sa position souhaitée.
Effectuer l'analyse: Quand les curseurs sont positionnés, sélectionnez Ne Analyse musculaire, puis montrer des résultats. Sur le Muscle analysé les données Résultats fenêtre pop-up, un certain nombre de variables sont affichées telles que Force maximum; Groupe de référence; ½ temps de relaxation, etc Les données sont présentées pour la réponse du couple qui se trouve entre les curseurs 1 (bleu) et 2 (jaune ). Toutes ces variables ou de variables spécifiques peuvent être enregistrées dans un fichier de données, toutefois, ce processus n'est pas décrit ici. Si un journal de données n'est pas mis en place, les données devraient être enregistrées par la main. Sélectionnez Fermer la fenêtre pour revenir à l'écran principal. Sélectionnez Programme Exit pour fermer le DMA, puis sélectionnez la flèche blanche pour commencer l'analyse d'un nouveau fichier. - Tétanie analyse (figure 2): Les mêmes étapes que décrit ci-dessus pour la contraction.
- Analyse excentrique (fig 3): L'analyse excentriques nécessite davantage d'étapes pour configurer et utilise tous les 3 curseurs. Si la réponse de couple excentrique est négative (ie, les tracés de couple apparaissent dans le sens descendant), il peut être inversée en entrant -1 dans la zone de référence (cm ²) boîte (valeurs de couple sont inchangés) et sélectionnez Ne pas normaliser, le Bouton renverse pour indiquer les données ont été normalisées (dans ce cas, inversé). Entrez le Cut Off Fréquence désirée (par exemple, 10 Hz) et sélectionnez l'option Utiliser les données non filtrées pour inverser le bouton pour utiliser les données filtrées, maintenant les données filtrées seront utilisées pour l'analyse. Positionnez le curseur bleu à l'endroit où le couple isométrique commence à augmenter à partir du couple de repos, la position du curseur jaune à l'endroit où le couple étirement excentrique commence à augmenter à partir du plateau isométrique (voir figure ci-dessous), la position du curseur blanc où le couple retourne à repos du couple. Sélectionnez Ne Analyse musculaire, puis montrer des résultats. Sur les données Muscle analysé les résultats fenêtre pop-up, vous pouvez sélectionner les données entre les curseurs 1 (bleu) et 2 (jaune) pour les données de couple isométrique, ou entre les curseurs 2 (jaune) et 3 (blanc) pour les données de couple excentrique. Toutes ces variables ou de variables spécifiques peuvent être enregistrées dans un fichier de données, toutefois, ce processus n'est pas décrit ici. Si un journal de données n'est pas mis en place, les données devraient être enregistrées par la main. Sélectionnez Fermer la fenêtre pour revenir à l'écran principal. Sélectionnez Programme Exit pour fermer le DMA, puis sélectionnez la flèche blanche pour commencer l'analyse d'un nouveau fichier.
9. Les résultats représentatifs
- Twitch couple: la stimulation du nerf tibial (1 Hz) activé tics simples des muscles extenseurs du tibiotarsienne (Fig 1). Notez que l'axe des Y indique «force»; couple (le produit de la force et à distance) est calculé par l'utilisateur. Nous mesurons la longueur de la patte (de l'axe de rotation à la fin du chiffre latérale). Cette longueur est la distance (bras de levier) utilisé pour déterminer le couple (Nm).
- Isométrique couple tétaniques (extension tibiotarsienne): la stimulation du nerf tibial tétanisée tibiotarsienne muscles extenseurs (1,5 sec former des impulsions 50Hz). Nous avons utilisé un logiciel dynamique de l'ordinateur de contrôle musculaire (DMC, Aurora Scientific, Inc) pour contrôler le calendrier de stimulation et de capturer les réponses couple (Fig 2).
- Protocole Excentrique: Les contractions excentriques ont été menées dans les fléchisseurs tibiotarsienne. Percutanée nerf sciatique poplité externe stimultion activé une contraction initiale suivie par une rotation isométrique commune entraînant un allongement des muscles fléchisseurs activé (contraction excentrique; Fig 3) 6.
Figure 1. Placement du bleu (# 1), jaune (# 2) et blanc (# 3) pour analyser les curseurs un tic. Une capture d'écran représentant des logiciels DMA est indiqué pour l'extension tibiotarsienne contraction dans un environnement sain 13 chiens kg. Notez que pour une analyse ultérieure effectuée par le logiciel, les données sont exportées vers un tableur, et la force de sortie (indiqué dans la figure de la Force (g) peuvent être convertis en couple (Nm). Le couple est calculée par le produit de la force et distance de bras de levier (dans cette distance la longueur = mesuré à partir de l'axe de rotation de chiffres latéral de la patte).
Figure 2. Placement du bleu (# 1), jaune (# 2) et blanc (# 3) curseurs pour analyser un tétanos. Un écran représentant tiré du logiciel DMA est indiqué pour l'extension tétanie tibiotarsienne, même animal comme le montre la figure 1.
Figure 3. Placement du bleu (# 1), jaune (# 2) et blanc (# 3) pour analyser les curseurs d'un excentrique extensible blessures contraction. Une capture d'écran représentant des logiciels DMA est montré pour un seul excentrique extensible blessures de contraction dans un environnement sain 13 chiens kg. Le plateau initial (ligne verte) illustre la phase de la contraction isométrique. La phase isométrique est suivie par un excentrique (étirement) de phase comme illustré par le pic rapide de la ligne verte. Répétées contractions excentriques aboutissent généralement à une baisse constante de couple isométrique.
Discussion
Ce protocole est utilisé pour évaluer la fonction du muscle grand animal in vivo afin d'analyser, documenter et déterminer l'efficacité des interventions thérapeutiques ou pour documenter les caractéristiques biologiques de la progression de la maladie. 1-6 positionnement des animaux, le placement des membres et le placement des électrodes sont des variables clés que les résultats d'impact de manière significative. Dans une étude préliminaire, la moyenne de concentration alvéolaire (MAC) des valeurs pour l'isoflurane n'a pas affecté significativement les mesures de force (RO Schueler, Koch H, Kornegay JN, données inédites, 1993). Matériels et logiciels sont disponibles dans le commerce et les méthodes bien établies. 7, 1,2,8,4,9-11,6,12 Il est recommandé que les utilisateurs d'obtenir et d'utiliser le logiciel et le matériel décrit ci-dessus en suivant ce protocole.
Modifications: limitations du servomoteur actuelles comprennent la masse corporelle d'environ 23 kg et une longueur de patte de 20cm. Notez que la limite de couple est ~ 8 N-mètres pour le capteur de couple (modèle 310LR) décrites ici. Cette valeur peut être dépassée par des chiens normaux à 6 mois ou plus. D'éventuelles modifications à l'actuel protocole comprennent la mise à jour du logiciel et d'augmenter la plage de couple du transducteur. Aurora Scientific fabrique un dispositif de positionnement des membres pour les grands animaux qui peuvent être substitués pour le cadre stéréotaxique utilisé dans le protocole actuel. Cette méthode a été appliquée avec succès à d'autres modèles animaux, y compris les primates non-humains.
Disclosures
La production de cette vidéo article a été parrainé par Aurora Scientific, Inc
Acknowledgments
National Institutes of Health (NIH), Joshua Frase Fondation, Muscular Dystrophy Association (MDA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrodes | Teca | 25mmx26G | Disposable sterile monopolar needle electrodes |
| Stimulator | Grass Technologies | S88X | |
| Stimulus isolation unit | Grass Technologies | SIU-C | |
| Muscle lever system | Aurora Scientific | 310C-LR | Footplate option |
| Signal interface | Aurora Scientific | Series 604A | |
| Dynamic Muscle Control & Analysis Software | Aurora Scientific | Aurora Scientific | |
| PC/Monitor | Aurora Scientific | Windows XP computer | |
| Limb position device | Aurora Scientific | NA | Can be substituted for stereotactic frame |
| Table | Northstar Customs, LLC | NA | Custom made table |
| Flexible wrap for paw attachment to pedal | Andover | PetFlex(5cmx2m) | May be reused a time or two |
References
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