Summary
Wir beschreiben eine minimal-invasive und schmerzfreie Methode, Hunde Hinterlauf der Muskelkraft und der Reaktion auf wiederholte exzentrische Kontraktionen zu messen.
Abstract
Wir beschreiben eine minimal-invasive und reproduzierbare Methode zu Eckzahn Beckengliedmaße Muskelkraft und Reaktion auf wiederholte exzentrische Kontraktionen zu messen. Die Becken-Bein eines narkotisierten Hund ist in einem stereotaktischen Rahmen der Tibia im rechten Winkel zum Femur align immobilisiert. Adhesive wrap bringt die Pfote auf ein Pedal auf der Welle eines Servomotors an Drehmoment messen montiert. Perkutane Nervenstimulation aktiviert Beckengliedmaße Muskeln der Pfote, um entweder push (erweitern) oder ziehen (flex) gegen das Pedal, um isometrische Drehmoment erzeugen. Perkutane tibialis Stimulation aktiviert tibiotarsalen Streckmuskeln. Wiederholte Exzenter (Verlängerung) Kontraktionen werden in der tibiotarsalen Beugemuskeln durch perkutane peronaeus Stimulation induziert wird. Der exzentrische Protokoll besteht aus einer ersten isometrische Kontraktion durch eine erzwungene Dehnung durch den Stellmotor verhängt gefolgt. Die Rotation effektiv verlängert den Muskel, während es Verträge, zB einer exzentrischen Kontraktion. Während der Stimulation Beugemuskeln sind ein 800 msec isometrische und 200 msec exzentrischen Kontraktion unterworfen. Dieses Verfahren wird alle 5 Sekunden wiederholt. Um zu vermeiden, Müdigkeit, folgt 4 min ruhen alle 10 Kontraktionen mit einer Gesamtfläche von 30 Kontraktionen durchgeführt.
Protocol
1. Einrichten für das Experiment
- Laden Sie die Dynamische Muscle Control (DMC)-Software.
- Schalten Sie das Physiologie rig folgenden Anweisungen des Herstellers.
- Ausführen der DMC-Software:
Es wird davon ausgegangen, dass die Hardware auf dem Computer, der DMC-Software läuft angeschlossen ist, und dass das System kalibriert. Die Software kann von Zeit zu Zeit überarbeitet werden, daher Anweisungen sind nachfolgend die für die aktuelle Software-Version, die wir verwenden zur Verfügung gestellt. Wenn die Software geöffnet wird, ist es bereits ausgeführt.
Der Benutzer kann zunächst schreiben ein Protokoll in DMC (zB bei 50 Hz für 1,5 s zu stimulieren, um eine isometrische Tetanus zu erzeugen) und das Protokoll kann dann für die spätere Verwendung gespeichert werden. Wir verwenden zwei Standard-Protokolle: (1) isometrische Kontraktion Protokoll (zB Zucken oder Tetanus) und (2) exzentrisch Stretch-Verletzungen Protokoll. Wir beginnen mit der isometrischen Kontraktion Protokoll für die zucken. Zur Optimierung der zucken, wird die Monitor-Ausgänge Bildschirm verwendet; Drehmoment während des twitch erzeugt werden beobachtet, wie die Elektroden verschoben werden. Wenn die maximale Zuckung erreicht ist, werden die Daten, die von der Rückkehr zum Hauptbildschirm (wählen Sie Fortsetzen) und wählen Sie Start-und Fertig gesammelt. Die Dateien werden aus dem Save As Popup-Fenster gespeichert. Mit den Elektroden in der gleichen Position gehalten, ist eine Tetanus (50 Hz) dann gesammelt und gespeichert. Wenn alle isometrischen Kontraktionen abgeschlossen sind, kann der exzentrische Stretch-Verletzungen Protokoll geladen und ausgeführt werden. Da gibt es eine Reihe von Kontraktionen in diesem Protokoll ausgeführt werden (10 Kontraktionen), auf dem Hauptbildschirm der Run auf Knopfdruck gewählt zu offenbaren Run All-Status. Nun, wenn Begin gewählt ist, erscheint ein Run Alle Protokolle Pop-up Fenster, das fragt nach dem Root-Dateinamen und das Verzeichnis, in dem die Dateien gespeichert werden sollen. Dann, Start-Protokoll Series Test-und Fertig werden ausgewählt, um die exzentrische Protokoll initiieren. Die Dateien werden automatisch in das ausgewählte Verzeichnis gespeichert.
2. Positionierung des Tieres in der Physiologie rig
- Tiere in Pflege und Gebrauch Ausschuss (ACUC) Richtlinien müssen für alle Verfahren, die Tiere folgen.
- Anesthetize Hund mit Inhalationsnarkose (wie Isofluran) nach genehmigten Protokoll. Überprüfen Sie Blinkreflex sicher sein, dass das Tier tief narkotisiert ist. CO 2-Überwachung, Pulsoxymeter und Temperatur sollten während des gesamten Verfahrens zu überwachen. Wir verwenden in der Regel Propofol zur Induktion von Sevofluran zur Inhalationsanästhesie gefolgt.
- Shave das Haar um die seitlichen ersticken (Knie), wo der stimulierenden Elektroden platziert werden soll (dh der lateralen Seite der Extremität beginnend mit dem Fibulaköpfchen um 2-3 cm distal des Trochanter major.
- Position Hund auf die Physiologie Tisch in Rückenlage mit dem Beckengliedmaße, so dass die Ober-und Unterschenkels im rechten Winkel zu positionieren, und die Tibia parallel zur Tischplatte. Entweder rechts oder links des Körpers getestet werden.
- Vor Anbringen Hund Pfote zu Pedalkraft, überprüfen, um sicherzustellen, dass die Kraft Pedal klar und sicher zu drehen. Befolgen Sie die Stromversorgung über das Verfahren für die Physiologie rig und aktivieren Sie das Pedal. Hinweis: die Kraft Pedal sollte "steif", wenn der Benutzer versucht, ihn manuell zu bewegen.
- Sanft ruhen die Pfote des Hundes in das Fußpedal, messen und aufzeichnen der Länge der Hund die Pfote aus der Mitte der Drehachse bis zum Ende der seitlichen Stelle.
- Sichern Sie die Pfote in das Fußpedal mit elastischen selbsthaftend wickeln.
3. Isometrische zucken Drehmoment (tibiotarsalen Flexion)
- Nach einem Sicherheits-Check, schließen sterile abgeschirmt monopolare 24-Gauge-stimulierenden Elektroden auf den Stimulus Isolation Unit (SIU).
- Stellen Sie den Stimulator zu: kontinuierliche Impulsausgang mit 1 Hz (1 Impuls pro Sekunde)
- Software-Einstellungen: Legen Sie die isometrische Kontraktion Protokoll (auf dem Hauptbildschirm wählen Sie Load Protocol). Der Run auf Knopfdruck sichtbar sein soll neben dem Begin-Taste. Dadurch wird sichergestellt, das Protokoll ist nur einmal ausgeführt werden.
- Mit Handschuhen, reinigen Sie die Haut mit Alkohol, und palpieren der N. peronaeus nur distal der lateralen proximalen Fibula. Mit einem Finger Kennzeichnung im Bereich der Nerven, vorsichtig die Kathode (schwarz) Elektrode unter die Haut und gerade außerhalb der Knochenhaut. Die Elektrode sollte parallel zur Oberfläche der Haut in einer Tiefe von ca. 2 cm gelegt werden, ausreichen, um die Elektrode aus bewegt, wenn die Hand entfernt zu verhindern.
- Legen Sie die Anode (rot) Elektrode unter die Haut, parallel und leicht distal der Kathodenelektrode. Beide Elektroden sollten nun im Inneren des N. peronaeus direkt distal des Fibulaköpfchen.
- Aktivieren Sie die Stimulationtor bei 1 Hz. Beachten Sie die twitch Antworten auf dem Monitor. Machen Sie kleine Anpassungen in den Elektrodenpositionen zu erhalten größten zucken Amplitude möglich. Die Elektrode sollte vollständig entfernt werden und in drei Minuten vor vier ½ cm-Schritten parallel zur Tibia zu den größten Zuckungsantwort finden ersetzt. Dies ist eine kritische Komponente des Verfahrens und großer Sorgfalt zu treffen, um die größte Resonanz finden werden.
- Notieren Sie sich den zuckenden Antworten, indem Sie das Monitor-Ausgänge-Bildschirm (wählen Sie Fortsetzen), und wählen Sie dann Start und Fertig, um die Daten zu sammeln. Speichern Sie die Datei mit den gewünschten Dateinamen in das Save As Popup-Fenster. Schalten Sie den Stimulator.
4. Isometrische tetanische Drehmoment (tibiotarsalen Flexion)
- Ohne sich zu bewegen die Elektroden, ändern Sie den Stimulator-Einstellungen auf 50 Hz für 1,5 sec und ermöglichen den externen Trigger-Funktion. Dadurch kann der Stimulator von der Software aktiviert werden.
- Software-Einstellungen: Das gleiche isometrische Kontraktion Protokoll wird verwendet, um die tetanische Reaktion wie bei der Zuckung zu sammeln. Angenommen, der stimulierenden Elektroden nicht bewegt worden sind, Begin und Done werden ausgewählt, um die Tetanus zu erzeugen. In der isometrischen Protokoll zu einem Tetanus zu erzeugen, wird der Stimulator von der Software auf das richtige Timing zu halten ausgelöst. Speichern Sie die tetanische Reaktion in den Save As Popup-Fenster.
5. Exzentrische Protokoll
- Ohne sich zu bewegen die Elektroden, ändern Sie den Stimulator-Einstellungen auf: 50 Hz für 1 sec (100V), und aktivieren Sie den externen Trigger-Funktion. Dadurch kann der Stimulator von der Software aktiviert werden.
- Software-Einstellungen: Legen Sie die exzentrische Dehnung Verletzungen Protokoll, einen Befehl an den Servomotor bis 29 Grad (30 Grad ist das Maximum) zu drehen. Wählen Sie Run All. Wählen Sie Start, geben Sie das Root-Dateisystem Namen für den exzentrischen Reihe von Dateien und die Ordner, in dem sie gespeichert werden sollen. Wählen Sie Start-Protokoll Series Test, und dann auf Fertig, um das Protokoll zu initiieren.
- In diesem Protokoll der Stimulator wird sich durch die Software, um das richtige Timing zu halten ausgelöst werden. Als Antwort auf jede exzentrischen Kontraktion auf dem Bildschirm erscheint, wird diese automatisch gespeichert.
- A 4 Minuten Ruhezeit folgt jeder Satz von zehn exzentrische Kontraktionen.
- Sammle insgesamt 30 exzentrische Kontraktionen (drei Sätze von zehn Kontraktionen; jeder Satz von einem 4 Minuten Ruhezeit getrennt).
6. Isometrische zucken Drehmoment (tibiotarsalen Erweiterung)
- Wiederholen Sie die twitch-Protokoll oben, aber statt den Elektroden senkrecht zur Haut-und proximal der ursprünglichen Platzierung der Elektroden für die Flexion-Protokoll. Der N. tibialis stimuliert wird, wie es Kurse kaudal und distal im gastrocnemious Muskelbäuche. Anregend und Paired Referenzelektroden sind tief in die Muskulatur caudal gelegt und genau proximal der zu ersticken. Der ungefähre Zeitpunkt der Platzierung wird entlang einer Linie, die 90o Winkel der Kniegelenke (Knie) gebildet halbiert. Da der Nerv liegt tiefer (und caudal) der N. peronaeus, sollten die Elektroden in verschiedenen Bereichen gesetzt werden, um die optimale zucken Potenziale zu entlocken. Dies ist eine kritische Komponente des Verfahrens. Hinweis: Drehmoment Kurven für tibiotarsalen zucken und Tetanie wird relativ zu tibiotarsalen Flexion Kurven invertiert angezeigt.
7. Isometrische tetanische Drehmoment (tibiotarsalen Erweiterung)
- Ohne sich zu bewegen die Elektroden, ändern Sie den Stimulator-Einstellungen auf 50 Hz für 1,5 sec und ermöglichen den externen Trigger-Funktion. Dadurch kann der Stimulator von der Software aktiviert werden.
- Software-Einstellungen auf: 50 Hz für 1,5 sec und ermöglichen den externen Trigger-Funktion. Dadurch kann der Stimulator von der Software aktiviert werden.
- Software-Einstellungen: Das gleiche isometrische Kontraktion Protokoll ist für die Tetanus-wie für die twitch verwendet. Angenommen, der stimulierenden Elektroden nicht bewegt worden sind, Begin und Done werden ausgewählt, um die Tetanus zu erzeugen.
- In der isometrischen Protokoll zu einem Tetanus zu erzeugen, wird der Stimulator von der Software auf das richtige Timing zu halten ausgelöst. Speichern Sie die tetanische Reaktion in den Pop-up-Fenster Datei speichern.
8. Datenanalyse
- Dynamische Muskel-Analyse (DMA)-Programm (Aurora Scientific) wird verwendet, um das Drehmoment und zeitlichen Informationen aus zucken, tetanische und exzentrische Kontraktionen gesammelt zu erhalten.
- Das Ausführen des DMA-Programm: Die Software kann von Zeit zu Zeit überarbeitet werden, daher Anweisungen sind nachfolgend die für die aktuelle Software-Version, die wir verwenden zur Verfügung gestellt. Wenn der DMA-Software geöffnet wird es nicht läuft. So aktivieren Sie das Programm, wählen Sie den weißen Pfeil in der linken oberen Ecke. Der DMA-Software hat eine Reihe von Funktionen, aber für unsere Zweckes, nur ein paar relevante Funktionen beschrieben werden.
Legen Sie eine Datei zu analysieren: Die neu laden jüngsten Daten-Datei oder eine neue Datei Popup-Fenster erscheint, wenn der DMA-Programm gestartet. Wählen Sie Neu, im nächsten Fenster wählen Sie Labview, im nächsten Fenster wählen Sie den entsprechenden Ordner und Dateien, wählen Sie Öffnen. Wählen Sie Filter entfernen Plot, um dieses Fenster zu entfernen. Geben Sie einen Filter-Frequenz in der Cut-off Frequenz angezeigt. Optimal Filterfrequenz müssten auf der Grundlage der Daten zu beurteilen bestimmt werden. Als Beispiel verwenden wir 30 Hz für unsere isometrische Antworten und 10 Hz für den exzentrischen Reaktionen. Aktivieren Sie das gefilterte Daten-Taste. Wählen Sie unter Zeichnen von Daten, wählen Sie Gefilterte Force. Mit den beiden Schiebereglern am unteren Rand, um die Anzeige zu erweitern und bewegen sich durch die Datei. - Twitch-Analyse (Abb. 1): Angenommen, die Datei geladen wird und die obigen Schritte abgeschlossen sind, stellen Sie die Position des Cursors: Es gibt 3 Cursor: (1) blau, (2) gelb und (3) weiß. Für isometrische Zuckungen und tetani oder andere isometrische Kontraktionen, der blaue an der Stelle, wo Drehmoment erhöht sich von der Ruhe Drehmoment eingestellt, die gelb ist dort platziert, wo das Drehmoment kehrt Ruhe Drehmoment (dh nach der Phase der Entspannung), der weiß ist, platziert rechts neben der gelben Cursor (nicht erforderlich). Der Cursor sind leicht mit der linken Taste der Maus gedrückt und ziehen Sie den ausgewählten Cursor an die gewünschte Position bewegt.
Führen Sie die Analyse: Wenn der Cursor positioniert sind, wählen Sie Muscle Analysis, dann Show Results. Auf den analysierten Daten Muscle Ergebnisse up-Fenster Pop, gibt eine Reihe von Variablen wie Maximum Force angezeigt; Baseline Force; ½ Relaxationszeit, etc. Die Daten werden für die Drehmoment-Reaktionszeit, die zwischen Cursor 1 (blau) und 2 (gelb liegt vorgestellt ). Alle diese Variablen oder Variablen kann auf eine Daten-Datei protokolliert werden, aber dieser Prozess ist nicht beschrieben. Wenn ein Daten-Log nicht eingerichtet ist, müssten die Daten von Hand erfasst werden. Wählen Sie Fenster schließen, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren. Wählen Sie Exit-Programm, um die DMA zu schließen, und wählen Sie dann den weißen Pfeil auf die Analyse von einer neuen Datei beginnen. - Tetanie-Analyse (Abb. 2): Die gleichen Schritte wie oben für die twitch beschrieben.
- Exzentrisch-Analyse (Abb. 3): Der exzentrische Analyse erfordert mehrere Schritte zum Einrichten und nutzt alle 3 Cursor. Wenn der exzentrische Drehmoment Antwort ist negativ (dh, das Drehmoment Kurven erscheinen in der Richtung nach unten), kann es durch die Eingabe -1 in der Reference Area (cm ²) Box (Drehmomentwerte sind unverändert) invertiert werden, und wählen Sie nicht normalisieren, die Button kehrt, um anzuzeigen, die Daten wurden normalisiert (in diesem Fall invertiert). Geben Sie die gewünschte Grenzfrequenz (zB 10 Hz), und wählen Sie ungefilterte Daten auf die Schaltfläche, um gefilterte Daten Verwenden Sie umgekehrt, nun gefilterten Daten für die Analyse verwendet werden. Positionieren Sie den blauen Cursor an die Stelle, wo isometrische Drehmoment beginnt zu ruhen Drehmoment steigen, positionieren Sie den gelben Cursor an die Stelle, wo der exzentrische Dehnung Drehmoment beginnt, sich von der isometrischen Plateau (siehe Abbildung unten) steigen; Position der weißen Cursor an Drehmoment wieder Ruhe-Drehmoment. Wählen Sie Muscle Analysis, dann Show Results. Auf den analysierten Daten Muscle Ergebnisse Popup-Fenster können Sie die Daten zwischen Cursor 1 (blau) und 2 (gelb) für die isometrische Drehmoment Daten oder zwischen Cursor 2 (gelb) und 3 (weiß) für den exzentrischen Drehmoment Daten. Alle diese Variablen oder Variablen kann auf eine Daten-Datei protokolliert werden, aber dieser Prozess ist nicht beschrieben. Wenn ein Daten-Log nicht eingerichtet ist, müssten die Daten von Hand erfasst werden. Wählen Sie Fenster schließen, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren. Wählen Sie Exit-Programm, um die DMA zu schließen, und wählen Sie dann den weißen Pfeil auf die Analyse von einer neuen Datei beginnen.
9. Repräsentative Ergebnisse
- Twitch Drehmoment: Tibia Nervenstimulation (1 Hz) aktiviert einzelnen Zuckungen tibiotarsalen Streckmuskeln (Abb. 1). Beachten Sie, dass die Y-Achse "Kraft" bedeutet; Drehmoment (das Produkt aus Kraft und Weg) wird durch den Benutzer berechnet. Wir messen die Länge der Pfote (von der Drehachse bis zum Ende der seitlichen stellig). Diese Länge ist der Abstand (Hebelarm) verwendet werden, um das Drehmoment (Nm) zu bestimmen.
- Isometrische tetanische Drehmoment (tibiotarsalen Erweiterung): tibial Nervenstimulation tetanized tibiotarsalen Streckmuskeln (1,5 sec Zug von 50Hz Pulse). Wir verwendeten Dynamische Muscle Control-Computer-Software (DMC, Aurora Scientific, Inc.) auf die Stimulation Zeitsteuerung und Drehmoment Antworten (Abb. 2) zu erfassen.
- Exzentrische Protokoll: Der exzentrische Kontraktionen wurden in den tibiotarsalen Beuger durchgeführt. Perkutane peronaeus stimulATION aktiviert eine erste isometrische Kontraktion durch gemeinsame Rotation gefolgt verursacht Verlängerung der aktivierten Beugemuskeln (exzentrische Kontraktion; Abb. 3). 6
Abbildung 1. Platzierung des blauen (# 1), gelb (# 2) und Weiß (# 3) Cursor auf ein Zucken zu analysieren. Ein Vertreter Screenshot der DMA-Software ist für tibiotarsalen Erweiterung Zucken in einem gesunden 13 kg Hund gezeigt. Beachten Sie, dass für die spätere Analyse durch die Software durchgeführt, die Daten in eine Tabellenkalkulation, und die Kraft-Ausgang (gezeigt in der Figur als Force (g), um das Drehmoment (Nm). Drehmoment umgewandelt werden kann, ist durch das Produkt aus Kraft berechnet und gehen in den Export Hebelarm Abstand (in diesem Abstand = Länge von der Drehachse um seitliche Stelle der Pfote gemessen).
Abbildung 2. Platzierung des blauen (# 1), gelb (# 2) und Weiß (# 3) Cursor zu analysieren Tetanus. Ein Vertreter Bildschirm des DMA-Software Schuss ist für tibiotarsalen Erweiterung Tetanie, dasselbe Tier gezeigt, wie in Abb. 1 dargestellt.
Abbildung 3. Platzierung des blauen (# 1), gelb (# 2) und Weiß (# 3) Cursor, um einen exzentrischen Stretch-Verletzungen Kontraktion zu analysieren. Ein Vertreter Screenshot der DMA-Software ist für einen einzigen exzentrischen Stretch-Verletzungen Kontraktion in einem gesunden 13 kg Hund gezeigt. Die erste Plateau (grüne Linie) zeigt die isometrische Phase der Kontraktion. Die isometrische Phase wird durch eine exzentrische (Stretch)-Phase, wie durch die schnelle Spitzenleistung in der grünen Linie folgen. Wiederholte exzentrische Kontraktionen in der Regel in einem stetigen Rückgang der isometrischen Drehmoments führen.
Discussion
Dieses Protokoll wird verwendet, um große Tier Muskelfunktion in vivo zu analysieren, zu bewerten, dokumentieren und zu bestimmen Wirksamkeit der Behandlung Interventionen oder biologischen Eigenschaften des Fortschreitens der Erkrankung dokumentieren. 1-6 Tiere Positionierung, des Körpers Platzierung und die Platzierung der Elektroden sind wichtige Variablen, die erhebliche Auswirkungen auf Ergebnisse. In einer Vorstudie bedeuten alveolare Konzentration (MAC)-Werte für Isofluran hatte keinen signifikanten Einfluss Kraftmessungen (Schueler RO, Koch H, Kornegay JN, unveröffentlichte Daten, 1993). Hardware und Software sind kommerziell erhältlich und Methoden etabliert. 7, 1,2,8,4,9-11,6,12 Es wird empfohlen, dass Benutzer und erhalten die Software und Geräte beschrieben, wenn nach diesem Protokoll.
Änderungen: Einschränkungen des derzeitigen Servomotor gehören Körpermasse von ca. 23 kg und Pfote Länge von 20cm. Beachten Sie, dass das Drehmoment begrenzen ist ~ 8 N-Meter für die Drehmoment-Sensor (Modell 310LR) hier beschrieben. Dieser Wert kann durch normale Hunde nach 6 Monaten oder älter überschritten werden. Mögliche Änderungen an dem aktuellen Protokoll gehören die Aktualisierung der Software und den Drehmomentbereich des Wandlers zu erhöhen. Aurora Scientific stellt ein Glied Positioniereinrichtung für große Tiere, die für den stereotaktischen Rahmen in der aktuellen Protokoll ersetzt werden können. Diese Methode wurde erfolgreich auf andere Tiermodelle angewandt worden, einschließlich der nicht-menschlichen Primaten.
Disclosures
Die Produktion dieses Video-Artikel wurde von Aurora Scientific, Inc. gesponsert
Acknowledgments
National Institutes of Health (NIH), Joshua Frase Stiftung, Gesellschaft für Muskeldystrophie (MDA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrodes | Teca | 25mmx26G | Disposable sterile monopolar needle electrodes |
| Stimulator | Grass Technologies | S88X | |
| Stimulus isolation unit | Grass Technologies | SIU-C | |
| Muscle lever system | Aurora Scientific | 310C-LR | Footplate option |
| Signal interface | Aurora Scientific | Series 604A | |
| Dynamic Muscle Control & Analysis Software | Aurora Scientific | Aurora Scientific | |
| PC/Monitor | Aurora Scientific | Windows XP computer | |
| Limb position device | Aurora Scientific | NA | Can be substituted for stereotactic frame |
| Table | Northstar Customs, LLC | NA | Custom made table |
| Flexible wrap for paw attachment to pedal | Andover | PetFlex(5cmx2m) | May be reused a time or two |
References
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