Summary
Nós descrevemos um método minimamente invasivo e indolor para medir a força muscular canina hindlimb e resposta muscular a repetidas contrações excêntricas.
Abstract
Nós descrevemos um método minimamente invasivo e reprodutível para medir a força muscular canina pélvica membro e resposta muscular a repetidas contrações excêntricas. O membro pélvico de um cão anestesiado é imobilizado em uma moldura estereotáxica para alinhar a tíbia em um ângulo direito ao fêmur. Adesiva wrap apõe a pata para um pedal montado no eixo de um servomotor para medir torque. Percutânea estimulação do nervo ativa músculos dos membros pélvicos da pata, quer push (ampliar) ou puxar (flex) contra o pedal para gerar torque isométrico. Percutânea estimulação do nervo tibial ativa músculos extensores tibiotársica. Repetidos excêntrico (alongamento) contrações são induzidas nos músculos flexores tibiotársica por estimulação do nervo peroneal percutânea. O protocolo consiste de um excêntrico contração isométrica inicial seguido de um estiramento forçado imposto pelo servomotor. A rotação efetivamente alonga o músculo ao mesmo tempo que os contratos, por exemplo, uma contração excêntrica. Durante a estimulação dos músculos flexores são submetidos a um 800 e 200 ms isométrica contração excêntrica msec. Este procedimento é repetido a cada 5 segundos. Para evitar a fadiga, 4 min resto segue a cada 10 contrações com um total de 30 contrações executadas.
Protocol
1. Criação para o experimento
- Carregar o software de controle dinâmico Muscle (DMC).
- Poder-se as instruções do fabricante rig fisiologia seguinte.
- Executar o software DMC:
Supõe-se que o hardware é conectado ao computador que executa o software DMC, e que o sistema é calibrado. O software poderá ser revisto de tempos em tempos, portanto, são fornecidas instruções abaixo relevantes para a versão atual do software que usamos. Quando o software é aberto, ele já está em execução.
O usuário pode escrever um protocolo inicialmente no DMC (por exemplo, para estimular a 50 Hz para 1,5 s para produzir uma tétano isométrica) e do protocolo pode então ser guardado para uso posterior. Nós usamos dois protocolos padrão: (1) protocolo de contração isométrica (contração por exemplo, ou tétano) e (2) protocolo de lesão por estiramento-excêntrico. Começamos com o protocolo de contração isométrica para a contração muscular. Para otimizar a contração muscular, o Monitor de tela de Saídas é usado; torque gerados durante a contração pode ser observada como os eletrodos são movidos. Quando a resposta contração máxima é atingida, os dados são coletados, retornando à tela principal (selecione Continue) e selecionando Begin e Feito. Os arquivos são salvos da Salvar como janela pop-up. Com os eletrodos mantido na mesma posição, um tétano (50 Hz) é então recolhida e guardada. Quando todas as contrações isométricas são concluídas, o protocolo de lesão por estiramento excêntrico pode ser carregado e executado. Porque há uma série de contrações para ser executado neste protocolo (10 contrações), na tela principal do Run Um botão é selecionado para revelar Run All status. Comece agora, quando é selecionada, uma Run Todos os protocolos janela pop-up aparece que pede o nome do arquivo eo diretório raiz na qual os arquivos serão salvos. Então, Start Protocolo de teste Series e Feito são selecionados para iniciar o protocolo de excêntrico. Os arquivos são salvos automaticamente para o diretório selecionado.
2. Posicionamento do animal na plataforma de fisiologia
- Cuidados com os animais e uso comissão (ACUC) orientações devem ser seguidas por todos os procedimentos que envolvem animais.
- Anestesiar cão usando anestesia inalatória (como o isoflurano) de acordo com protocolo aprovado. Verifique blink reflex para ter certeza de que o animal é anestesiado profundamente. CO 2 de monitoramento, oximetria de pulso e temperatura devem ser cuidadosamente monitorizados durante todo o procedimento. Normalmente usamos propofol para a indução seguida por sevoflurano em anestesia inalatória.
- Raspar o cabelo em torno do joelho laterais (joelho), onde os eletrodos estimulantes serão colocados (isto é, o aspecto lateral do início do membro na cabeça da fíbula para 2-3 cm distal ao trocanter maior.
- Cão posição na tabela fisiologia em decúbito dorsal com o membro pélvico posicionado de modo que o fêmur ea tíbia fazer um ângulo reto, ea tíbia é paralela à mesa. Ou o pé direito ou esquerdo pode ser testada.
- Antes de ligar pata do cão para forçar a pedal, de verificação para garantir que o pedal força é claro e seguro para rodar. Siga o procedimento para ligar o equipamento fisiologia e ativar o pedal. Nota: o pedal de força deve ser "dura" quando o usuário tenta movê-lo manualmente.
- Suavemente resto pata do cachorro no pedal; medir e registrar o tempo de pata do cão a partir do eixo centro de rotação até o fim do dígito lateral.
- Segura a pata no pedal usando o envoltório auto-aderente elástica.
3. Twitch torque isométrico (flexão tibiotársica)
- Sequência de um controlo de segurança, ligue monopolar blindado estéril calibre 24 eletrodos estimulante para a unidade de isolamento do estímulo (SIU).
- Definir o estimulador para: saída de pulso contínuo a 1 Hz (1 pulso por segundo)
- Configurações de software: Carregue o protocolo de contração isométrica (na principal protocolo de carga na tela de seleção). O botão One Run deve estar visível ao lado do botão Iniciar. Isso garante que o protocolo é executado apenas uma vez.
- Com as mãos enluvadas, limpe a pele com álcool, e palpar o nervo fibular comum apenas distal da fíbula lateral proximal. Com um dedo marcando a área do nervo, insira cuidadosamente o cátodo eletrodo (preto) sob a pele e apenas externos ao periósteo. O eletrodo deve ser colocado paralelamente à superfície da pele a uma profundidade de cerca de dois centímetros, o suficiente para evitar que o eletrodo de mover-se quando a mão é removida.
- Coloque o eletrodo ânodo (vermelho) sob a pele paralelas e ligeiramente distal ao eletrodo cátodo. Ambos os eletrodos deve agora estar no interior do nervo fibular comum apenas distal à cabeça da fíbula.
- Ativar a estimulaçãotor a 1 Hz. Observe as respostas contração no monitor. Fazer pequenos ajustes nas posições de eletrodo para obter a maior amplitude possível contração. O eletrodo deve ser completamente removido e substituído em 03:57 incrementos de ½ cm paralela à tíbia para encontrar a resposta maior contração. Este é um componente crítico do procedimento e um grande cuidado deve ser tomado para encontrar a maior resposta.
- Gravar as respostas twitch saindo do monitor tela Saídas (selecione Continuar), em seguida, selecione Begin e Feito para coletar os dados. Salve o arquivo com o nome do arquivo desejado no Salvar como janela pop up. Desligue o estimulador.
4. Torque tetânica isométrica (flexão tibiotársica)
- Sem mover os eletrodos, altere as configurações estimulador de 50 Hz por 1,5 segundos e permitir que a função de gatilho externo. Isso permite que o estimulador para ser ativado pelo software.
- Configurações do software: O protocolo de contração isométrica mesmo é usado para coletar a resposta tetânica como para a contração muscular. Assumindo que os eletrodos estimulantes não foram movidos, Begin e Feito são selecionados para produzir o tétano. No protocolo isométrico para produzir uma tétano, o estimulador é acionado pelo software para manter o timing correto. Salvar a resposta tetânica em Salvar como janela pop up.
5. Protocolo excêntrico
- Sem mover os eletrodos, altere as configurações estimulador para: 50 Hz por 1 segundo (100V), e habilitar a função de gatilho externo. Isso permite que o estimulador para ser ativado pelo software.
- Configurações de software: Coloque o protocolo lesão excêntrica trecho, um comando para o servomotor para girar 29 graus (30 graus é o máximo). Todos selecione Executar. Selecione Iniciar, digite o nome do arquivo de raiz para a série excêntrica de arquivos ea pasta em que estão para ser salvo. Selecione Iniciar Protocolo de teste Series, e então Feito para iniciar o protocolo.
- Neste protocolo o estimulador está previsto para ser acionado pelo software para manter o timing correto. Como a resposta a cada contração excêntrica aparece na tela, ele é automaticamente salvo.
- Um período de repouso quatro minutos segue cada conjunto de dez contrações excêntricas.
- Coletar um total de 30 contrações excêntricas (três séries de dez contrações; cada conjunto separado por um período de descanso de quatro minutos).
6. Twitch torque isométrico (extensão tibiotársica)
- Repita o protocolo de contração acima, mas colocar os eletrodos perpendiculares à pele e proximal à colocação dos eletrodos original para o protocolo de flexão. O nervo tibial é estimulado como cursos caudalmente e distalmente dentro do ventre muscular gastrocnemious. Emparelhado estimulante e eletrodos de referência são colocados no fundo do caudal musculatura e bem próximo ao joelho. O ponto aproximado de colocação é ao longo de uma linha que corta o ângulo de 90 º formado pela sufocar (joelho). Porque o nervo tibial é mais profundo (e caudal) para o nervo fibular comum, os eletrodos devem ser colocados em diversas áreas para eliciar os potenciais twitch ideal. Este é um componente crítico do processo. Nota: traçados torque de contração tibiotársica e tetania aparece invertida em relação ao traçado de flexão tibiotársica.
7. Torque tetânica isométrica (extensão tibiotársica)
- Sem mover os eletrodos, altere as configurações estimulador de 50 Hz por 1,5 segundos e permitir que a função de gatilho externo. Isso permite que o estimulador para ser ativado pelo software.
- Configurações de software para: 50 Hz por 1,5 segundos e permitir que a função de gatilho externo. Isso permite que o estimulador para ser ativado pelo software.
- Configurações do software: O protocolo de contração isométrica mesmo é usado para o tétano como para a contração muscular. Assumindo que os eletrodos estimulantes não foram movidos, Begin e Feito são selecionados para produzir o tétano.
- No protocolo isométrico para produzir uma tétano, o estimulador é acionado pelo software para manter o timing correto. Salvar a resposta tetânica no pop up janela Salvar Arquivo.
8. Análise de dados
- Dinâmica muscular programa de análise (DMA) (Aurora Científica) é usado para obter o torque e informações temporais coletados de contração muscular, contrações tetânicas e excêntrico.
- Executar o programa de DMA: O software poderá ser revisto de tempos em tempos, portanto, são fornecidas instruções abaixo relevantes para a versão atual do software que usamos. Quando o software é aberto DMA não está em execução. Para ativar o programa, selecione o botão de seta branca no canto superior esquerdo. O software DMA tem uma série de funções, mas para o nosso propósitos, apenas algumas funções relevantes serão descritas.
Carregar um arquivo para analisar: O Atualizar arquivo de dados recentes ou arquivo de dados nova janela pop-up aparece quando o programa de DMA é iniciado. Selecione Novo; na próxima janela, selecione Labview; na próxima janela, selecione a pasta apropriada e arquivo; selecione Abrir. Selecione Remover Plot filtro para remover esta janela. Introduzir uma frequência de filtro na caixa de freqüência de corte. Freqüência do filtro ideal teria que ser determinado com base nos dados específicos a serem avaliados. Como exemplo, usamos 30 Hz para as nossas respostas isométrica e 10 Hz para as respostas excêntrico. Selecione o botão Use filtrada dados. Em Dados Plot, seleccione Força filtrada. Use as duas barras de deslizamento na parte inferior para expandir a exibição e mover-se através do arquivo. - Análise de contração (Fig. 1): Supondo que o arquivo é carregado e os passos acima forem concluídos, definir a posição dos cursores: Há 3 cursores: (1) azul, (2) e amarela (3) branca. Para contrações isométricas e tetani ou outras contrações isométricas, o azul é definido no ponto em que o binário sobe do torque de descanso, o amarelo é colocado onde o torque retorna ao torque de repouso (ou seja, após a fase de relaxamento), o branco é colocado para à direita do cursor amarelo (não necessária). Os cursores são facilmente mudou-se com o botão esquerdo do mouse pressionado e arrastar o cursor selecionado para a posição desejada.
Realizar a análise: Quando os cursores são posicionados, selecione fazer uma análise do músculo, em seguida, mostrar resultados. Sobre os dados dos resultados analisados Muscle janela pop-up, um número de variáveis são exibidos, tais como Força Máxima; Força de linha de base; ½ tempo de relaxamento, etc Os dados são apresentados para a resposta de torque, que se situa entre os cursores 1 (azul) e 2 (amarelo ). Todas estas variáveis ou variáveis específicas podem ser registradas em um arquivo de dados, no entanto, esse processo não é descrito aqui. Se um log de dados não está configurado, os dados teriam de ser gravado com a mão. Selecione Janela Fechar para retornar à tela principal. Selecione Programa Sair para fechar o DMA, e selecione a seta branca para começar a análise de um novo arquivo. - Tetania análise (Fig. 2): Os mesmos passos como descrito acima para a contração muscular.
- Análise excêntrico (Fig. 3): A análise excêntrico requer mais etapas de montar e usa todos os três cursores. Se a resposta torque excêntrico é negativo (isto é, o torque aparecem traçados no sentido descendente), pode ser invertido, inserindo -1 na área de referência (cm ²) caixa (valores de torque são inalterado) e selecione Não normalize, o botão inverte para indicar os dados foram normalizados (neste caso, invertido). Digite o Cut Off Freqüência desejada (por exemplo, 10 Hz) e selecione Usar dados não filtrado para reverter o botão usar dados filtrados, agora dados filtrados serão utilizados para a análise. Posicione o cursor azul no ponto onde o torque isométrico começa a subir a partir de torque repouso; posicionar o cursor amarelo no ponto onde o torque de alongamento excêntrico começa a subir a partir do planalto isométrica (veja figura abaixo), a posição do cursor branco onde retorna ao torque descansando torque. Selecione fazer uma análise do músculo, depois no botão Mostrar Resultados. Dados sobre o Muscle analisaram os resultados janela pop-up, você pode selecionar os dados entre os cursores 1 (azul) e 2 (amarelo) para os dados de torque isométrico, ou entre os cursores 2 (amarelo) e 3 (branco) para os dados de torque excêntrico. Todas estas variáveis ou variáveis específicas podem ser registradas em um arquivo de dados, no entanto, esse processo não é descrito aqui. Se um log de dados não está configurado, os dados teriam de ser gravado com a mão. Selecione Janela Fechar para retornar à tela principal. Selecione Programa Sair para fechar o DMA, e selecione a seta branca para começar a análise de um novo arquivo.
9. Resultados representante
- Twitch torque: estimulação do nervo tibial (1 Hz) ativado twitches única de músculos extensores tibiotársica (Fig. 1). Note que o eixo Y indica "força"; torque (o produto da força e distância) é calculado pelo usuário. Nós medimos o comprimento da pata (a partir do eixo de rotação até o fim do dígito lateral). Este comprimento é a distância (braço de alavanca) usado para determinar torque (Nm).
- Torque tetânica isométrica (extensão tibiotársica): estimulação do nervo tibial tetanized tibiotársica músculos extensores (1,5 seg trem de pulsos de 50hz). Usamos dinâmicas Muscle software de computador de Controle (DMC, Aurora Scientific, Inc.) para controle de tempo e estímulo para captar as respostas de torque (Fig. 2).
- Protocolo excêntrico: As contrações excêntricas foram realizadas nos flexores tibiotársica. Percutânea do nervo peroneal Stimulation ativada uma contração isométrica inicial seguido de rotação conjunta causando alongamento dos músculos flexores ativado (contração excêntrica; Fig. 3) 6.
Figura 1. Colocação do azul (# 1), amarelo (# 2) e branco (# 3) cursores para analisar uma contração muscular. A captura de tela representante do software DMA é mostrado para contração de extensão tibiotársica em um cão saudável kg 13. Observe que, para posterior análise realizada pelo software, os dados são exportados para uma planilha, ea produção de força (como mostrado na figura como Force (g) pode ser convertida em Torque torque (Nm). É calculado pelo produto da força e alavanca de distância do braço (nesta distância = comprimento medido em relação ao eixo de rotação para dígito lateral da pata).
Figura 2. Colocação do azul (# 1), amarelo (# 2) e branco (# 3) cursores para analisar um tétano. Uma tela de tiro representante do software DMA é mostrado para tibiotársica animais extensão tetania, mesmo como mostrado na figura 1.
Figura 3. Colocação do azul (# 1), amarelo (# 2) e branco (# 3) cursores para analisar uma contração lesão por estiramento-excêntrico. A captura de tela representante do software DMA é mostrado para uma única contração lesão por estiramento-excêntrica em um cão saudável kg 13. O planalto inicial (linha verde) ilustra a fase isométrica da contração. A fase isométrica é seguido por uma fase (stretch) excêntrica, como ilustrado pelo pico rápido na linha verde. Repetidas contrações excêntricas normalmente resultam em um declínio constante no torque isométrico.
Discussion
Este protocolo é usado para avaliar a função muscular grandes animais in vivo para analisar, documentar e determinar a eficácia de intervenções de tratamento ou para documentar características biológicas de progressão da doença. 1-6 posicionamento Animal, colocação dos membros e colocação dos eletrodos são variáveis-chave que resulta um impacto significativo. Em um estudo preliminar, a concentração alveolar médio (MAC) valores para o isoflurano não afetou significativamente as medidas de força (Schueler RO, Koch H, Kornegay JN, dados não publicados, 1993). Hardware e software estão disponíveis comercialmente e métodos bem estabelecidos. 7, 1,2,8,4,9-11,6,12 É recomendável que os usuários obter e utilizar o software e equipamentos descritos acima, quando após esse protocolo.
Modificações: limitações do servomotor atuais incluem massa corporal de cerca de 23 kg e comprimento de 20 cm de pata. Note-se que o limite de torque é de aproximadamente 8 metros de N-para o transdutor de torque (modelo 310LR) descrito aqui. Este valor pode ser excedido por cães normal em seis meses ou mais. Possíveis modificações ao protocolo atuais incluem a atualização do software e aumentar a faixa de torque do transdutor. Aurora Científico fabrica um dispositivo de posicionamento dos membros de animais de grande porte que pode ser substituído para o quadro estereotáxico usados no protocolo atual. Este método tem sido aplicado com sucesso a outros modelos animais, incluindo primatas não-humanos.
Disclosures
A produção deste vídeo-artigo foi patrocinado pela Aurora Scientific, Inc.
Acknowledgments
National Institutes of Health (NIH), Joshua Frase Foundation, Muscular Dystrophy Association (MDA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrodes | Teca | 25mmx26G | Disposable sterile monopolar needle electrodes |
| Stimulator | Grass Technologies | S88X | |
| Stimulus isolation unit | Grass Technologies | SIU-C | |
| Muscle lever system | Aurora Scientific | 310C-LR | Footplate option |
| Signal interface | Aurora Scientific | Series 604A | |
| Dynamic Muscle Control & Analysis Software | Aurora Scientific | Aurora Scientific | |
| PC/Monitor | Aurora Scientific | Windows XP computer | |
| Limb position device | Aurora Scientific | NA | Can be substituted for stereotactic frame |
| Table | Northstar Customs, LLC | NA | Custom made table |
| Flexible wrap for paw attachment to pedal | Andover | PetFlex(5cmx2m) | May be reused a time or two |
References
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