Summary
Beschrijven we een minimaal-invasieve en pijnloze methode om honden achterbeen spierkracht en spier reactie op de herhaalde excentrische contracties te meten.
Abstract
Beschrijven we een minimaal-invasieve en reproduceerbare methode om honden bekken ledematen spierkracht en spier reactie op de herhaalde excentrische contracties te meten. Het bekken onderdeel van een verdoofde hond is geïmmobiliseerd in een stereotactisch frame om de tibia lijnen in een rechte hoek ten opzichte van het dijbeen. Lijm wrap brengt de poot aan een pedaal gemonteerd op de as van een servomotor aan koppel te meten. Percutane zenuwstimulatie activeert bekken been spieren van de poot om ofwel push (uitbreiden) of trek (flex) tegen op het pedaal om isometrische koppel te genereren. Percutane nervus tibialis stimulatie activeert tibiotarsal extensor spieren. Herhaalde excentrieke (verlenging) contracties worden geïnduceerd in de tibiotarsal flexor spieren door percutane peroneus stimulatie. De excentrieke protocol bestaat uit een initieel isometrische contractie, gevolgd door een gedwongen stretch opgelegd door de servomotor. De rotatie verlengt effectief de spier terwijl deze contracten, bijvoorbeeld, een excentrieke contractie. Tijdens de stimulatie flexor spieren worden onderworpen aan een 800 msec isometrische en 200 msec excentrieke contractie. Deze procedure wordt herhaald om de 5 sec. Om te voorkomen dat vermoeidheid, 4 min. rest volgt elke 10 contracties met een totaal van de uitgevoerde 30 contracties.
Protocol
1. Zich voor het experiment
- Laad de Dynamic Muscle Control (DMC)-software.
- Het opstarten de aanwijzingen van de fysiologie rig volgende fabrikant.
- Het uitvoeren van de DMC-software:
Er wordt vanuit gegaan dat de hardware is aangesloten op de computer waarop de software draait DMC, en dat het systeem is gekalibreerd. De software kan worden herzien van tijd tot tijd, daarom instructies onderstaande relevant zijn voor de huidige versie van de software die we gebruiken. Wanneer de software wordt geopend, wordt het al wordt uitgevoerd.
De gebruiker kan in eerste instantie schrijven van een protocol in de DMC (bijvoorbeeld om op 50 Hz te stimuleren voor 1,5 s tot een isometrische tetanus produceren) en het protocol kan vervolgens worden opgeslagen voor later gebruik. We maken gebruik van twee standaard protocollen: (1) isometrische contractie protocol (bijvoorbeeld trillen of tetanus), en (2) excentrieke stretch-letsel protocol. We beginnen met de isometrische contractie protocol voor de twitch. Voor het optimaliseren van de twitch, is de Monitor Uitgang scherm gebruikt; koppel gegenereerd tijdens de twitch kan worden waargenomen als de elektroden worden verplaatst. Wanneer de maximale twitch respons is bereikt, worden de gegevens verzameld door terug te keren naar het hoofdscherm (selecteert u Doorgaan) en het selecteren van Begin en Gereed. Bestanden worden gered van de Opslaan als pop-up venster. Met de elektroden aangehouden in dezelfde positie, is een tetanus (50 Hz) dan verzameld en opgeslagen. Als alle isometrische contracties zijn voltooid, kan de excentrieke stretch-letsel protocol worden geladen en uitgevoerd. Omdat er een serie van contracties uit te voeren in dit protocol (10 contracties), op het hoofdscherm van de Run een knop is geselecteerd om te onthullen Alle status Run. Nu bij Begin is geselecteerd, een Run alle protocollen pop-up venster verschijnt dat vraagt om het root-bestandssysteem naam en de map waarin de bestanden moeten worden opgeslagen. Dan, Start Protocol Series Test en Klaar zijn geselecteerd om de excentrieke protocol te starten. De bestanden worden automatisch opgeslagen in de geselecteerde Directory.
2. Positionering van het dier in de fysiologie rig
- Dier zorg en het gebruik commissie (ACUC) richtlijnen moet worden gevolgd voor alle procedures met betrekking tot dieren.
- Verdoven hond met behulp van inhalatie-anesthesie (zoals isofluraan) volgens goedgekeurde protocol. Controleer knipperen reflex om er zeker van dat het dier is diep verdoofd. CO 2 monitoring, pulsoximetrie en de temperatuur nauwlettend gecontroleerd te worden gedurende de gehele procedure. Wij gebruiken meestal de propofol voor inductie gevolgd door sevofluraan voor inhalatie anesthesie.
- Scheer het haar rond de laterale knie (knie), waar de stimulatie-elektroden worden geplaatst (dat wil zeggen, de laterale aspect van de ledematen te beginnen bij de fibulaire kop tot 2-3 cm distaal van de trochanter major.
- Plaats hond op de fysiologie tafel in dorsale decubitus met het bekken ledematen zodanig geplaatst dat de femur en de tibia een rechte hoek te maken, en het scheenbeen is parallel aan het tafelblad. Of de rechter of linker ledematen kan worden getest.
- Voorafgaand aan het vastmaken hond poot om pedaalkracht, controleren om te verzekeren dat de kracht pedaal is duidelijk en veilig te draaien. Volg de procedure voor het inschakelen van de fysiologie rig en activeer het pedaal. Let op: de kracht pedaal moeten worden "stijf" wanneer de gebruiker probeert om handmatig te verplaatsen.
- Voorzichtig rest van de hond poot in het voetpedaal, meten en registreren van de lengte van poot van de hond van het centrum rotatie-as tot het einde van de laterale cijfer.
- Zet de poot in de voet pedaal met behulp van elastiek zelfklevende wrap.
3. Isometrische twitch koppel (tibiotarsal flexie)
- Na een veiligheidscontrole, sluit steriele afgeschermde monopolaire 24-gauge stimulatie-elektroden op de stimulus isolatie-eenheid (SIU).
- Stel de stimulator: continue puls uitgang op 1 Hz (een puls per seconde)
- Software-instellingen: Laad het isometrische contractie protocol (op het hoofdscherm selecteer Laden Protocol). De Run een knop zichtbaar moet zijn naast de Begin knop. Dit zorgt ervoor dat het protocol is slechts een keer uitgevoerd.
- Met handschoenen aan, maak de huid schoon met alcohol, en palperen de gemeenschappelijke peroneus net distaal van de laterale proximale fibula. Met een vinger markering op het gebied van de zenuw voorzichtig Plaats de kathode (zwart) elektrode onder de huid en net buiten het periost. De elektrode moet parallel worden geplaatst aan het oppervlak van de huid op een diepte van ongeveer 2 cm, voldoende om de elektrode te voorkomen dat het verplaatsen wanneer de hand wordt verwijderd.
- Plaats de anode (rood) elektrode onder de huid, parallel en iets distaal van de kathode-elektrode. Beide elektroden moeten nu intern in de gemeenschappelijke peroneus net distaal van de fibula hoofd.
- Activeer de stimulatietor op 1 Hz. Let op de krampreacties op de monitor. Maak kleine aanpassingen in de elektrode posities te verkrijgen van de grootste twitch amplitude mogelijk. De elektrode moet volledig worden verwijderd en vervangen in drie tot vier stappen van ½ cm parallel aan de tibia naar de grootste spierrespons te vinden. Dit is een cruciaal onderdeel van de procedure en grote zorg moeten worden genomen om de grootste respons te vinden.
- Noteer de krampreacties door het verlaten van het Monitor Uitgang scherm (selecteert u Doorgaan) en selecteer Begin en Gereed om de gegevens te verzamelen. Sla het bestand met de gewenste bestandsnaam in het Opslaan als pop-up venster. Schakel de stimulator.
4. Isometrische tetanische koppel (tibiotarsal flexie)
- Zonder het verplaatsen van de elektroden, wijzigt u de stimulator instellingen 50 Hz voor 1,5 sec en kan de externe trigger-functie. Hierdoor kan de stimulator worden geactiveerd door de software.
- Software-instellingen: De zelfde isometrische contractie protocol wordt gebruikt om de tetanische respons verzamelen als voor de twitch. Ervan uitgaande dat de stimulatie-elektroden niet zijn verplaatst, Begin en Gereed zijn geselecteerd om de tetanus te produceren. In de isometrische protocol om een tetanus te produceren, is de stimulator geactiveerd door de software om de juiste timing te houden. Sla de tetanische reactie in het Opslaan als pop-up venster.
5. Eccentric protocol
- Zonder het verplaatsen van de elektroden, wijzigt u de stimulator instellingen: 50 Hz voor 1 sec (100V), en schakel de externe trigger-functie. Hierdoor kan de stimulator worden geactiveerd door de software.
- Software-instellingen: Laad de excentrieke stretch letsel protocol, een opdracht om de servomotor tot 29 graden (30 graden is het maximum) te draaien. Selecteer Run All. Selecteer Begin, voer het root-bestandssysteem naam voor de excentrieke reeks van bestanden en de map waarin ze worden opgeslagen. Selecteer Start Protocol Series test, en vervolgens op Gereed om het protocol te starten.
- In dit protocol de stimulator is ingesteld om te worden geactiveerd door de software om de juiste timing te houden. Als de reactie op elke excentrieke contractie op het scherm verschijnt, wordt deze automatisch opgeslagen.
- Een vier minuten rustperiode volgt elke set van tien excentrische contracties.
- Verzamel een totaal van 30 excentrische contracties (drie sets van tien contracties; elke set gescheiden door een vier minuten rust periode).
6. Isometrische twitch koppel (tibiotarsal extensie)
- Herhaal de bovenstaande twitch-protocol, maar plaats de elektroden loodrecht op de huid en proximaal van de originele elektrode plaatsing voor de flexie-protocol. De tibiale zenuw wordt gestimuleerd als het cursussen caudaal en distaal in de gastrocnemious spier buiken. Het stimuleren van gekoppeld en referentie-elektroden diep geplaatst in de spieren caudale en net proximaal van de knie. De geschatte punt van plaatsing is langs een lijn die de 90 ° hoek gevormd door de knie (knie) tweeën deelt. Omdat de nervus tibialis dieper ligt (en caudaal) om de gemeenschappelijke peroneus zenuw, moeten de elektroden worden geplaatst op verschillende gebieden om de optimale twitch mogelijkheden te lokken. Dit is een cruciaal onderdeel van de procedure. Let op: koppel traces voor tibiotarsal twitch en tetanie zal ten opzichte van tibiotarsal flexie tracings lijken omgekeerd.
7. Isometrische tetanische koppel (tibiotarsal extensie)
- Zonder het verplaatsen van de elektroden, wijzigt u de stimulator instellingen 50 Hz voor 1,5 sec en kan de externe trigger-functie. Hierdoor kan de stimulator worden geactiveerd door de software.
- Software-instellingen op: 50 Hz voor 1,5 sec en kan de externe trigger-functie. Hierdoor kan de stimulator worden geactiveerd door de software.
- Software-instellingen: De zelfde isometrische contractie protocol wordt gebruikt voor het tetanus als voor de twitch. Ervan uitgaande dat de stimulatie-elektroden niet zijn verplaatst, Begin en Gereed zijn geselecteerd om de tetanus te produceren.
- In de isometrische protocol om een tetanus te produceren, is de stimulator geactiveerd door de software om de juiste timing te houden. Sla de tetanische respons in de pop-up venster Bestand opslaan.
8. Data-analyse
- Dynamische spier analyse (DMA) programma (Aurora Scientific) wordt gebruikt om het koppel en temporele informatie verzameld van twitch, tetanische en excentrische contracties te krijgen.
- Het uitvoeren van het DMA-programma: De software kan worden herzien van tijd tot tijd, daarom instructies onderstaande relevant zijn voor de huidige versie van de software die we gebruiken. Wanneer de DMA-software wordt geopend is niet actief. Om het programma activeren, selecteert u de witte pijl knop in de linkerbovenhoek. De DMA-software heeft een aantal functies, maar voor ons doels, zal slechts een paar relevante functies worden beschreven.
Laad een bestand te analyseren: De vernieuwen recente gegevens bestand of een nieuw bestand pop-up venster verschijnt wanneer de DMA-programma wordt gestart. Selecteer Nieuw, in het volgende venster te selecteren Labview, in het volgende venster selecteert u de juiste map en het bestand, selecteer Openen. Selecteer Verwijder Filter Plot om dit venster te verwijderen. Voer een filter frequentie in de Cut-off frequentie box. Optimale filter frequentie zou moeten worden bepaald op basis van de specifieke gegevens die moeten worden beoordeeld. Als voorbeeld gebruiken we 30 Hz voor onze isometrische reacties en 10 Hz voor de excentrieke reacties. Schakel het selectievakje gefilterde gegevens te klikken. Klik onder Selecteer Plot Data, selecteert u Gefilterd Force. Gebruik de twee schuifbalken aan de onderkant om het display uit te breiden en door het bestand te verplaatsen. - Twitch analyse (afb. 1): Ervan uitgaande dat het bestand is geladen en de bovenstaande stappen zijn voltooid, stelt u de positie van de cursors: Er zijn 3 cursors: (1) blauw (2) geel en (3) wit. Voor de isometrische samentrekkingen en tetani of andere isometrische contracties, is de blauwe vastgesteld op het punt waar het koppel stijgt van de rust koppel; de gele is geplaatst waar het koppel terugkeert naar rust koppel (dat wil zeggen, na de rust fase), de witte is geplaatst om het recht van de gele cursor (niet nodig). De cursors zijn gemakkelijk te verplaatsen met de linkermuisknop ingedrukt op de muis en het slepen van de geselecteerde cursor naar de gewenste positie.
Voer de analyse uit: Wanneer de cursors zijn geplaatst, selecteert u Muscle Analyse, daarna Bekijk Resultaten. Op de geanalyseerde gegevens Muscle Resultaten pop-up venster, zijn een aantal variabelen worden weergegeven, zoals maximale kracht, Baseline Force, ½ Ontspanning Tijd, etc. De gegevens worden gepresenteerd voor het koppel antwoord dat ligt tussen cursors 1 (blauw) en 2 (geel ). Al deze variabelen of specifieke variabelen kunnen worden vastgelegd in een gegevensbestand, maar dat proces is niet hierin beschreven. Als een data log niet is ingesteld, dan zou de gegevens moeten worden vastgelegd met de hand. Selecteer Venster sluiten om terug te keren naar het hoofdscherm. Selecteer Afsluiten Programma om de DMA te sluiten en selecteer vervolgens de witte pijl de analyse van een nieuw bestand te beginnen. - Tetanie analyse (afb. 2): De dezelfde stappen als hierboven beschreven voor de twitch.
- Eccentric analyse (afb. 3): De excentrieke analyse vereist meer stappen te zetten en gebruikt alle 3 cursors. Als de excentrieke koppel antwoord negatief is (dat wil zeggen, het koppel traces verschijnen in de neerwaartse richting), kan het omgekeerd worden door het invoeren van -1 in het referentiegebied (sq cm) box (koppel waarden zijn ongewijzigd) en selecteert u niet normaliseren; de -toets keert om aan te geven de gegevens zijn genormaliseerd (in dit geval, omgekeerde). Voer de gewenste Cut Off frequentie (bijvoorbeeld 10 Hz) en selecteer Gebruik ongefilterde gegevens om de knop om gefilterde gegevens omdraaien gebruiken, nu gefilterde gegevens zullen worden gebruikt voor de analyse. Plaats de blauwe cursor op het punt waar isometrische koppel begint te stijgen van rust koppel; positie van de gele cursor op het punt waar de excentrieke stretch koppel begint te verrijzen uit de isometrische plateau (zie onderstaande figuur), de positie van de witte cursor waar het koppel keert terug naar rusten koppel. Selecteert u Muscle Analyse, daarna Bekijk Resultaten. Op de geanalyseerde gegevens Muscle Resultaten pop-up venster, kunt u de gegevens tussen cursors 1 (blauw) en 2 (geel) voor de isometrische koppel gegevens, of tussen twee cursors (geel) en 3 (wit) voor de excentrieke koppel data. Al deze variabelen of specifieke variabelen kunnen worden vastgelegd in een gegevensbestand, maar dat proces is niet hierin beschreven. Als een data log niet is ingesteld, dan zou de gegevens moeten worden vastgelegd met de hand. Selecteer Venster sluiten om terug te keren naar het hoofdscherm. Selecteer Afsluiten Programma om de DMA te sluiten en selecteer vervolgens de witte pijl de analyse van een nieuw bestand te beginnen.
9. Representatieve resultaten
- Twitch koppel: tibiale zenuw stimulatie (1 Hz) geactiveerd single samentrekkingen van tibiotarsal extensor spieren (figuur 1). Merk op dat de Y-as 'kracht' geeft aan, koppel (het product van kracht en de afstand) wordt berekend door de gebruiker. We meten de lengte van de poot (van de rotatie-as tot het einde van de laterale cijfer). Deze lengte is de afstand (hefboom) gebruikt om koppel (Nm) te bepalen.
- Isometrische tetanische koppel (tibiotarsal extensie): tibiale zenuwstimulatie tetanized tibiotarsal extensor spieren (1,5 sec trein van 50Hz pulsen). We gebruikten Dynamic spiercontrole computer software (DMC, Aurora Scientific, Inc), stimulatie timing te beheersen en koppel reacties (fig. 2) vast te leggen.
- Eccentric protocol: De excentrische contracties werden uitgevoerd in het tibiotarsal flexoren. Percutane peroneus Stimulatie geactiveerd een initieel isometrische contractie gevolgd door een gezamenlijke rotatie waardoor verlenging van de geactiveerde flexor spieren (excentrieke samentrekking; afb. 3). 6
Figuur 1. Plaatsing van de blauwe (# 1), geel (# 2) en witte (# 3) cursors om een twitch analyseren. Een vertegenwoordiger screen shot van de DMA-software wordt weergegeven voor tibiotarsal uitbreiding twitch in een gezonde 13 kg hond. Merk op dat voor verdere analyse uitgevoerd door de software, de gegevens worden geëxporteerd naar een spreadsheet, en de kracht output (in de figuur als Force (g) kunnen worden omgezet in koppel (Nm). Koppel wordt berekend door het product van kracht en hefboomarm afstand (in deze de verte = lengte gemeten van rotatie-as om laterale cijfer van de poot).
Figuur 2. Plaatsing van de blauwe (# 1), geel (# 2) en witte (# 3) cursors om een tetanus te analyseren. Een vertegenwoordiger screen shot van de DMA-software wordt weergegeven voor tibiotarsal uitbreiding tetanie, hetzelfde dier zoals weergegeven in figuur 1.
Figuur 3. Plaatsing van de blauwe (# 1), geel (# 2) en witte (# 3) cursors om een excentrieke stretch-letsel samentrekking te analyseren. Een vertegenwoordiger screen shot van de DMA-software getoond voor een excentrieke stretch-letsel krimp in een gezonde 13 kg hond. De eerste plateau (groene lijn) illustreert de isometrische fase van de contractie. Het isometrische fase wordt gevolgd door een excentrieke (stretch) fase, zoals blijkt uit de snelle piek in de groene lijn. Herhaalde excentrische contracties meestal resulteren in een gestage daling van de isometrische koppel.
Discussion
Dit protocol wordt gebruikt om grote dieren spierfunctie in vivo te analyseren beoordelen, documenteren en effectiviteit van de behandeling interventies bepalen of om biologische kenmerken van de progressie van de ziekte document. 1-6 Animal positionering, ledematen plaatsing en plaatsing van de elektroden zijn de belangrijkste variabelen die een grote invloed resultaten. In een eerste onderzoek was de gemiddelde alveolaire concentratie (MAC) waarden voor isofluraan geen significante invloed op krachtmetingen (Schueler RO, Koch H, Kornegay JN, niet-gepubliceerde data, 1993). Hardware en software zijn commercieel verkrijgbaar en methoden goed vastgesteld. 7, 1,2,8,4,9-11,6,12 Het wordt aanbevolen dat de gebruikers en het gebruik van de software en apparatuur hierboven beschreven bij het volgen van dit protocol.
Wijzigingen: de beperkingen van de huidige servomotor zijn lichaamsgewicht van ongeveer 23 kg en lengte van de poot 20cm. Merk op dat het koppel limiet is ~ 8 N-meter voor het koppel transducer (model 310LR) hier beschreven. Deze waarde mag worden overschreden bij normale honden na 6 maanden of ouder zijn. Mogelijke wijzigingen van het huidige protocol onder het updaten van de software en het koppel bereik van de sensor te verhogen. Aurora Wetenschappelijke produceert een ledemaat positionering apparaat voor grote dieren die kunnen worden vervangen door het stereotactische kader gebruikt worden in het huidige protocol. Deze methode is met succes toegepast op andere diermodellen, inclusief niet-menselijke primaten.
Disclosures
De productie van deze video-artikel werd gesponsord door Aurora Scientific, Inc
Acknowledgments
National Institutes of Health (NIH), Joshua Frase Foundation, spierdystrofie Association (MDA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrodes | Teca | 25mmx26G | Disposable sterile monopolar needle electrodes |
| Stimulator | Grass Technologies | S88X | |
| Stimulus isolation unit | Grass Technologies | SIU-C | |
| Muscle lever system | Aurora Scientific | 310C-LR | Footplate option |
| Signal interface | Aurora Scientific | Series 604A | |
| Dynamic Muscle Control & Analysis Software | Aurora Scientific | Aurora Scientific | |
| PC/Monitor | Aurora Scientific | Windows XP computer | |
| Limb position device | Aurora Scientific | NA | Can be substituted for stereotactic frame |
| Table | Northstar Customs, LLC | NA | Custom made table |
| Flexible wrap for paw attachment to pedal | Andover | PetFlex(5cmx2m) | May be reused a time or two |
References
- Childers, M. K., Okamura, C. S., Bogan, D. J., Bogan, J. R., Petroski, G. F., McDonald, K., Kornegay, J. N. Eccentric contraction injury in dystrophic canine muscle. Arch Phys Med Rehabil. 83, 1572-1578 (2002).
- Childers, M. K., Okamura, C. S., Bogan, D. J., Bogan, J. R., Sullivan, M. J., Kornegay, J. N. Myofiber injury and regeneration in a canine homologue of Duchenne muscular dystrophy. Am J Phys Med Rehabil. 80, 175-181 (2001).
- MK, C. hilders, JT, S. taley, JN, K. ornegay, KS, M. cD. onald Skinned single fibers from normal and dystrophin-deficient dogs incur comparable stretch-induced force deficits. Muscle Nerve. 31, 768-771 (2005).
- Kornegay, J. N., Bogan, D. J., Bogan, J. R., Childers, M. K., Cundiff, D. D., Petroski, G. F., Schueler, R. O. Contraction force generated by tarsal joint flexion and extension in dogs with golden retriever muscular dystrophy. J Neurol Sci. 166, 115-121 (1999).
- Liu, J. M., Okamura, C. S., Bogan, D. J., Bogan, J. R., Childers, M. K., Kornegay, J. N. Effects of prednisone in canine muscular dystrophy. Muscle Nerve. 30, 767-773 (2004).
- Tegeler, C. J., Grange, R. W., Bogan, D. J., Markert, C. D., Case, D., Kornegay, J. N., Childers, M. K. Eccentric contractions induce rapid isometric torque drop in dystrophin-deficient dogs. Muscle Nerve. 42, 130-132 (2010).
- Allen, D. G. Eccentric muscle damage: mechanisms of early reduction of force. Acta Physiol Scand. 171, 311-319 (2001).
- Friden, J., Lieber, R. L. Eccentric exercise-induced injuries to contractile and cytoskeletal muscle fibre components. Acta Physiol Scand. 171, 321-326 (2001).
- Merkies, I. S., Faber, C. G. Outcome measures in Duchenne muscular dystrophy: are we ready for the new therapeutic era? Neuromuscul Disord. 19, 447-447 (2009).
- Nagaraju, K., Willmann, R. Developing standard procedures for murine and canine efficacy studies of DMD therapeutics: report of two expert workshops on "Pre-clinical testing for Duchenne dystrophy". Neuromuscul Disord. 19, 502-506 (2009).
- Proske, U., Allen, T. J. Damage to skeletal muscle from eccentric exercise. Exerc Sport Sci Rev. 33, 98-104 (2005).
- Warren, G. L., Lowe, D. A., Armstrong, R. B. Measurement tools used in the study of eccentric contraction-induced injury. Sports Med. 27, 43-59 (1999).
