Summary
Se describe un método mínimamente invasivo e indoloro para medir la fuerza muscular canina extremidades posteriores y la respuesta del músculo a la repetición de las contracciones excéntricas.
Abstract
Se describe un método mínimamente invasivo y reproducible para medir la fuerza de los músculos pélvicos canina extremidades y la respuesta del músculo a las repetidas contracciones excéntricas. La extremidad pélvica de un perro anestesiado se inmoviliza en un marco estereotáxico para alinear la tibia en un ángulo recto con el fémur. Adhesivo envuelva pone la pata a un pedal montado en el eje de un servomotor para medir el par. Estimulación percutánea del nervio activa los músculos pélvicos extremidad de la pata a cualquiera de push (ampliar) o tirar (flex) contra el pedal para generar torque isométrico. Estimulación percutánea del nervio tibial activa los músculos extensores tibiotarsal. Repite excéntrica (alargamiento) son las contracciones inducidas en los músculos flexores tibiotarsal por la estimulación percutánea del nervio peroneo. El protocolo consiste en un excéntrico contracción isométrica inicial seguido de un tramo forzoso impuesto por el servomotor. La rotación efectivamente alarga el músculo se contrae, mientras que, por ejemplo, una contracción excéntrica. Durante la estimulación músculos flexores están sometidos a una vista isométrica 800 ms y 200 ms de contracción excéntrica. Este procedimiento se repite cada 5 segundos. Para evitar la fatiga, 4 minutos de descanso a continuación cada 10 contracciones con un total de 30 contracciones realizadas.
Protocol
1. Configuración para el experimento
- Cargar el Control Dinámico del músculo (DMC) de software.
- Encienda las instrucciones del fabricante plataforma fisiología siguiente.
- Ejecución del software de DMC:
Se supone que el hardware está conectado a la computadora que ejecuta el software de DMC, y que el sistema de calibrado. El software podrá ser revisado de vez en cuando, por lo tanto, las instrucciones se proporcionan a continuación correspondientes a la versión actual del software que usamos. Cuando el software es abierto, ya se está ejecutando.
El usuario puede escribir inicialmente un protocolo de DMC (por ejemplo, para estimular a 50 Hz durante 1,5 s para producir un tétanos isométrica) y el protocolo se pueden guardar para su uso posterior. Se utilizan dos protocolos estándar: (1) protocolo de contracción isométrica (por ejemplo, contracción o tétanos) y (2) protocolo de estiramiento excéntrico de la lesión. Comenzamos con el protocolo de contracción isométrica de la contracción. Para optimizar el movimiento, la pantalla de salidas de monitor se utiliza, el par generado durante la contracción se puede observar como los electrodos se mueven. Cuando la respuesta de contracción máxima se alcanza, los datos son recogidos por regresar a la pantalla principal (seleccione Continuar) y la selección de inicio y Hecho. Los archivos se guardan en la reserva como ventana emergente. Con los electrodos mantenido en la misma posición, una contra el tétanos (50 Hz) se recoge y se guarda. Cuando todas las contracciones isométricas se han completado, el excéntrico tramo de la lesión del protocolo se puede cargar y ejecutar. Debido a que hay una serie de contracciones que se ejecutará en este protocolo (10 contracciones), en la pantalla principal de la ejecución de un botón se selecciona Ejecutar para revelar todos los status. Ahora, cuando se selecciona Iniciar, una carrera de todos los protocolos ventana emergente que le pregunta el nombre del archivo raíz y el directorio en el que los archivos han de ser salvados. A continuación, inicie Protocolo de prueba de la serie y ya está seleccionado para iniciar el protocolo excéntrico. Los archivos se guardan automáticamente en el directorio seleccionado.
2. Colocación del animal en la plataforma de la fisiología
- Cuidado de los animales y el uso de las directrices del Comité (ACUC) debe ser seguido por todos los procedimientos con animales.
- Anestesiar perros bajo anestesia por inhalación (como el isoflurano), según el protocolo aprobado. Compruebe reflejo de parpadeo para asegurarse de que el animal está profundamente anestesiados. CO 2 de monitoreo, oximetría de pulso y la temperatura deben ser estrechamente vigilados durante todo el procedimiento. Por lo general el uso de propofol para la inducción seguida de sevoflurano para la anestesia por inhalación.
- Afeitar el vello de todo el lateral ahogar (rodilla), donde los electrodos de estimulación se coloca (es decir, la parte lateral del comienzo de la extremidad a la cabeza del peroné a 2-3 cm distal al trocánter mayor.
- Perro posición en la tabla de la fisiología en decúbito dorsal con la extremidad pélvica posicionada para que el fémur y la tibia que un ángulo recto, y la tibia es paralela a la mesa. Ya sea la rama derecha o izquierda se pueden probar.
- Antes de conectar la pata del perro de fuerza sobre el pedal, compruebe que la fuerza del pedal es claro y seguro para girar. Siga el procedimiento para encender el equipo fisiología y activar el pedal. Nota: el pedal de la fuerza debe ser "dura" cuando el usuario intenta moverlo manualmente.
- Suavemente el resto de la pata del perro en el pedal, medir y registrar la longitud de la pata del perro en el centro del eje de rotación hasta el final del dedo lateral.
- Asegure la pata en el pedal de pie con elástico autoadherente abrigo.
3. Contracción isométrica del par (flexión tibiotarsal)
- Después de una revisión de seguridad, conexión monopolar estéril blindado de calibre 24 electrodos de estimulación a la unidad de aislamiento de estímulos (SIU).
- Establecer el estimulador a: salida de pulsos continua a 1 Hz (1 pulso por segundo)
- Configuración de software: Cargar el protocolo de contracción isométrica (en el Protocolo de carga de la pantalla de selección principal). El botón de una carrera debe ser visible al lado del botón de empezar. Esto asegura que el protocolo sólo se ejecuta una vez.
- Con las manos enguantadas, limpie la piel con alcohol, y palpar el nervio peroneo común justo distal a proximal del peroné lateral. Con un dedo marcando el área del nervio, inserte con cuidado el cátodo (negro) de electrodos bajo la piel y solamente externa al periostio. El electrodo debe ser colocado en paralelo a la superficie de la piel a una profundidad de unos 2 cm, suficiente para evitar que el electrodo se mueva cuando la mano se retira.
- Coloque el ánodo (rojo) debajo de la piel, paralela y ligeramente distal al electrodo catódico. Los dos electrodos de ahora debe ser interna al nervio peroneo común justo distal a la cabeza del peroné.
- Activar la estimulacióntor a 1 Hz. Tenga en cuenta las respuestas de contracción en el monitor. Realizar pequeños ajustes en la posición de los electrodos para obtener la mayor amplitud posible contracción. El electrodo debe ser completamente eliminado y sustituido en tres o cuatro incrementos de ½ cm paralelo a la tibia para encontrar la respuesta más grande de contracción. Este es un componente crítico del procedimiento y el gran cuidado se debe tomar para encontrar la respuesta más grande.
- Registrar las respuestas de contracción por salir de la pantalla salidas de monitor (seleccione Continuar), a continuación, seleccione Inicio y Hecho para recoger los datos. Guarde el archivo con el nombre de archivo deseado en la opción Guardar como ventana emergente. Apagar el estimulador.
4. Isométrica par tetánica (flexión tibiotarsal)
- Sin mover los electrodos, cambiar la configuración del estimulador a 50 Hz durante 1,5 segundos y active la función de disparo externo. Esto permite que el estimulador para ser activado por el software.
- La configuración del software: El mismo protocolo contracción isométrica se utiliza para recoger la respuesta tetánica como para la contracción. Suponiendo que los electrodos de estimulación no se han movido, Begin y ya está seleccionado para producir el tétanos. En el protocolo isométrico para producir un tétanos, el estimulador se activa por el software para mantener la sincronización correcta. Guardar la respuesta tetánica en el Guardar como ventana emergente.
5. Protocolo excéntrico
- Sin mover los electrodos, cambiar la configuración del estimulador: 50 Hz durante 1 seg (100 V), y activar la función de disparo externo. Esto permite que el estimulador para ser activado por el software.
- La configuración del software: Cargar el protocolo de estiramiento lesión excéntrica, un comando para el servomotor para girar 29 grados (30 grados es el máximo). Seleccione Ejecutar todo. Seleccione Iniciar, escriba el nombre del archivo raíz de la serie de excéntricos de los archivos y la carpeta en la que se van a guardar. Seleccione Inicio Protocolo de prueba de la serie, a continuación, en Listo para iniciar el protocolo.
- En este protocolo el estimulador está dispuesto a ser activado por el software para mantener la sincronización correcta. A medida que la respuesta a cada una contracción excéntrica en la pantalla, ésta se guarda automáticamente.
- Un período de descanso cuatro minutos siguientes a cada serie de diez contracciones excéntricas.
- Recoge un total de 30 contracciones excéntricas (tres series de diez contracciones, separados entre sí por un período de descanso cuatro minutos).
6. Torque de contracción isométrica (extensión tibiotarsal)
- Repita el protocolo de contracción por encima, pero el lugar de los electrodos perpendicularmente a la piel y proximal a la colocación de los electrodos originales para el protocolo de la flexión. El nervio tibial es estimulado, ya que los cursos de caudal y distal en los vientres musculares gastrocnemious. Emparejados estimulante y electrodos de referencia se introducen profundamente en la musculatura caudal, justo por encima de la rodilla. El punto aproximado de la colocación es a lo largo de una línea que divide el ángulo de 90 grados formado por la rodilla (rodilla). Debido a que el nervio tibial es más profundo (y caudal) en el nervio ciático poplíteo externo, los electrodos deben ser colocados en diferentes áreas para obtener los potenciales de contracción óptima. Este es un componente crítico del procedimiento. Nota: los trazados par de contracción tibiotarsal y tetania aparecerá invertida en relación con los trazados de la flexión tibiotarsal.
7. Isométrica par tetánica (extensión tibiotarsal)
- Sin mover los electrodos, cambiar la configuración del estimulador a 50 Hz durante 1,5 segundos y active la función de disparo externo. Esto permite que el estimulador para ser activado por el software.
- La configuración del software a: 50 Hz durante 1,5 segundos y active la función de disparo externo. Esto permite que el estimulador para ser activado por el software.
- La configuración del software: El mismo protocolo contracción isométrica se utiliza para el tétanos como para la contracción. Suponiendo que los electrodos de estimulación no se han movido, Begin y ya está seleccionado para producir el tétanos.
- En el protocolo isométrico para producir un tétanos, el estimulador se activa por el software para mantener la sincronización correcta. Guardar la respuesta tetánica en el pop-up ventana Guardar archivo.
8. Análisis de los datos
- Análisis dinámico del músculo (DMA) del programa (Aurora Científica) se utiliza para obtener el par y la información recogida temporal de contracción, contracciones tetánicas y excéntrico.
- La ejecución del programa de DMA: El software podrá ser revisado de vez en cuando, por lo tanto, las instrucciones se proporcionan a continuación correspondiente a la versión actual del software que usamos. Cuando el software DMA se abre no se está ejecutando. Para activar el programa, seleccione el botón de la flecha blanca en la esquina superior izquierda. El software de DMA tiene una serie de funciones, pero para nuestro propósitos, sólo una pocas funciones relevantes se describen.
Cargar un archivo a analizar: El archivo Actualizar los datos más recientes o archivo de datos nueva ventana emergente aparece cuando el programa se inicia DMA. Seleccione Nuevo, en la siguiente ventana, seleccione Labview, en la siguiente ventana, seleccione la carpeta y el archivo, seleccione Abrir. Seleccione Quitar filtro de gráfico para eliminar esta ventana. Introduzca una frecuencia de filtro en el cuadro de frecuencia de corte. Frecuencia del filtro óptimo tendría que ser determinado con base en los datos específicos que deben evaluarse. A modo de ejemplo, se utiliza 30 Hz de nuestras respuestas isométrica y 10 Hz para las respuestas excéntrico. Seleccione el botón Usar filtrado de datos. En Datos de Terreno en Seleccionar, seleccione Grupo de filtrado. Utilice las dos barras de desplazamiento en la parte inferior para ampliar la pantalla y se mueven a través del archivo. - Contracción de análisis (Fig. 1): Suponiendo que el archivo se carga y completar los pasos anteriores, se deberá seleccionar la posición de los cursores: Hay tres cursores: (1) azul (2) de color amarillo y blanco (3). Por contracciones isométricas y tetani o contracciones isométricas, el azul se establece en el punto de que el par se eleva desde el par de descanso, el amarillo se coloca en el par vuelve a la par de reposo (es decir, después de la fase de relajación), el blanco se coloca a la derecha del cursor amarillo (no es necesario). Los cursores se mueven fácilmente con el botón izquierdo del mouse presionado y arrastrar el cursor para seleccionar la posición deseada.
Realizar el análisis: Cuando el cursor se coloca, seleccione hacer un análisis del músculo, a continuación, en estos momentos. En analizaron los datos de los músculos Resultados ventana pop-up, una serie de variables se muestran como la fuerza máxima, fuerza de línea de base; ½ tiempo de relajación, etc Los datos se presentan para la respuesta de torque que se encuentra entre los cursores 1 (azul) y 2 (amarillo ). Todas estas variables o variables específicas se pueden registrar en un archivo de datos, sin embargo, ese proceso no se describe en este documento. Si un registro de datos no está configurado, los datos tienen que ser registrados con la mano. Seleccione Cerrar ventana para volver a la pantalla principal. Seleccione programa de salida para cerrar la DMA, y luego seleccione la flecha blanca para iniciar el análisis de un nuevo archivo. - Tetania análisis (Fig. 2): los mismos pasos descritos anteriormente para la contracción.
- Análisis excéntrica (Fig. 3): El análisis excéntrica requiere más pasos para configurar y utiliza los 3 cursores. Si la respuesta es negativa torque excéntrico (es decir, los trazados par aparece en la dirección hacia abajo), que se puede invertir mediante la introducción de -1 en el área de referencia (cm ²) caja (valores de par no se han modificado) y seleccione No normalización, la botón se invierte para indicar los datos han sido normalizados (en este caso, invertido). Entrar en el corte deseado fuera de frecuencia (por ejemplo, 10 Hz) y seleccione Usar datos sin filtrar para revertir el botón para utilizar los datos filtrados, ahora los datos filtrados se utilizará para el análisis. Sitúe el cursor azul en el punto donde el torque isométrico empieza a subir de par en reposo, la posición del cursor amarillo en el punto donde el par de estiramiento excéntrico empieza a subir desde la meseta isométrica (ver figura abajo), la posición del cursor blanco al que el par vuelve a descansando de par. Seleccione hacer un análisis del músculo, a continuación, en estos momentos. En analizaron los datos de los músculos ventana emergente resultados, puede seleccionar los datos entre los cursores 1 (azul) y 2 (amarillo) para los datos de torque isométrico, o entre los cursores 2 (amarillo) y 3 (blanco) para los datos de torque excéntrico. Todas estas variables o variables específicas se pueden registrar en un archivo de datos, sin embargo, ese proceso no se describe en este documento. Si un registro de datos no está configurado, los datos tienen que ser registrados con la mano. Seleccione Cerrar ventana para volver a la pantalla principal. Seleccione programa de salida para cerrar la DMA, y luego seleccione la flecha blanca para iniciar el análisis de un nuevo archivo.
9. Resultados representante
- Contracción de par: la estimulación del nervio tibial (1 Hz) activa contracciones de los músculos extensores de la única tibiotarsal (Fig. 1). Tenga en cuenta que el eje Y indica la "fuerza"; par (el producto de la fuerza y la distancia) se calcula por el usuario. Medimos la longitud de la pata (desde el eje de rotación hasta el final del lateral dígitos). Esta longitud es la distancia (palanca) que se utiliza para determinar el par (Nm).
- Isométrica par tetánica (extensión tibiotarsal): La estimulación del nervio tibial tetanized tibiotarsal músculos extensores (1,5 seg tren de pulsos de 50 Hz). Se utilizó el software de control dinámico de los músculos PC (DMC, Aurora Scientific, Inc.) para controlar el momento y la estimulación para capturar las respuestas del par (Fig. 2).
- Protocolo excéntrico: Las contracciones excéntricas se llevaron a cabo en los flexores de la tibiotarsal. Percutánea del nervio peroneo Stimulción activa una contracción isométrica inicial seguido por la rotación de articulaciones que causa el alargamiento de los músculos flexores activa (contracción excéntrica; Fig. 3) 6.
Figura 1. Colocación de la nada (# 1), amarillo (# 2) y blanco (# 3) cursores para analizar un tic. Una captura de pantalla representante de la DMA software se muestra de contracción extensión tibiotarsal en un perro sano kg 13. Tenga en cuenta que para su posterior análisis realizado por el software, los datos son exportados a una hoja de cálculo, y la producción de fuerza (que se muestra en la figura como de la Fuerza (g) se puede convertir en par (Nm). El par se calcula el producto de la fuerza y palanca de un brazo de distancia (en esta distancia de la longitud = medida del eje de rotación de dígitos lateral de la pata).
Figura 2. Colocación de la nada (# 1), amarillo (# 2) y blanco (# 3) cursores para analizar el tétanos. Una pantalla representante tiro del software DMA se muestra de tetania tibiotarsal extensión, un mismo animal, como se muestra en la Fig. 1.
Figura 3. Colocación de la nada (# 1), amarillo (# 2) y blanco (# 3) cursores para analizar un excéntrico tramo de la lesión contracción. Una captura de pantalla representante de la DMA se muestra el software de un solo tramo de la lesión excéntrica contracción en un perro sano kg 13. La meseta inicial (línea verde) ilustra la fase isométrica de la contracción. La fase isométrica es seguido por una excéntrica (estiramiento) de fase como se ilustra en el pico rápido en la línea verde. Repetidas contracciones excéntricas suelen dar lugar a una disminución constante de torque isométrico.
Discussion
Este protocolo se utiliza para evaluar la función de músculos grandes animales in vivo para analizar, documentar y determinar la eficacia de las intervenciones terapéuticas o para documentar las características biológicas de la enfermedad. 6.1 posicionamiento de animales, la colocación de las extremidades y la colocación de los electrodos son las variables clave que de manera significativa los resultados del impacto. En un estudio preliminar, la media de la concentración alveolar (MAC) los valores de isoflurano no afectó de forma significativa las medidas de fuerza (Schueler RO, Koch H, Kornegay JN, datos no publicados, 1993). Hardware y software están disponibles en el mercado y los métodos bien establecidos. 7, 1,2,8,4,9-11,6,12 Se recomienda que los usuarios obtener y utilizar el software y equipos descritos anteriormente, cuando después de este protocolo.
Modificaciones: las limitaciones del servomotor actuales incluyen la masa corporal de alrededor de 23 kg y la longitud de la pata de 20 cm. Tenga en cuenta que el límite de par es de ~ 8 N-metros para el transductor de par (modelo 310LR) se describe aquí. Este valor puede ser superado por los perros normales a los 6 meses o más. Posibles modificaciones al protocolo actual incluyen la actualización del software e incrementar el rango de par del transductor. Aurora científico fabrica un dispositivo de posicionamiento extremidades de los animales de gran tamaño que puede ser sustituido por el marco estereotáctico utilizados en el protocolo actual. Este método ha sido aplicado con éxito a otros modelos animales, incluidos primates no humanos.
Disclosures
La producción de este video-artículo fue patrocinado por Aurora Scientific, Inc.
Acknowledgments
Institutos Nacionales de Salud (NIH), Joshua Frase Fundación, Asociación de Distrofia Muscular (MDA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrodes | Teca | 25mmx26G | Disposable sterile monopolar needle electrodes |
| Stimulator | Grass Technologies | S88X | |
| Stimulus isolation unit | Grass Technologies | SIU-C | |
| Muscle lever system | Aurora Scientific | 310C-LR | Footplate option |
| Signal interface | Aurora Scientific | Series 604A | |
| Dynamic Muscle Control & Analysis Software | Aurora Scientific | Aurora Scientific | |
| PC/Monitor | Aurora Scientific | Windows XP computer | |
| Limb position device | Aurora Scientific | NA | Can be substituted for stereotactic frame |
| Table | Northstar Customs, LLC | NA | Custom made table |
| Flexible wrap for paw attachment to pedal | Andover | PetFlex(5cmx2m) | May be reused a time or two |
References
- Childers, M. K., Okamura, C. S., Bogan, D. J., Bogan, J. R., Petroski, G. F., McDonald, K., Kornegay, J. N. Eccentric contraction injury in dystrophic canine muscle. Arch Phys Med Rehabil. 83, 1572-1578 (2002).
- Childers, M. K., Okamura, C. S., Bogan, D. J., Bogan, J. R., Sullivan, M. J., Kornegay, J. N. Myofiber injury and regeneration in a canine homologue of Duchenne muscular dystrophy. Am J Phys Med Rehabil. 80, 175-181 (2001).
- MK, C. hilders, JT, S. taley, JN, K. ornegay, KS, M. cD. onald Skinned single fibers from normal and dystrophin-deficient dogs incur comparable stretch-induced force deficits. Muscle Nerve. 31, 768-771 (2005).
- Kornegay, J. N., Bogan, D. J., Bogan, J. R., Childers, M. K., Cundiff, D. D., Petroski, G. F., Schueler, R. O. Contraction force generated by tarsal joint flexion and extension in dogs with golden retriever muscular dystrophy. J Neurol Sci. 166, 115-121 (1999).
- Liu, J. M., Okamura, C. S., Bogan, D. J., Bogan, J. R., Childers, M. K., Kornegay, J. N. Effects of prednisone in canine muscular dystrophy. Muscle Nerve. 30, 767-773 (2004).
- Tegeler, C. J., Grange, R. W., Bogan, D. J., Markert, C. D., Case, D., Kornegay, J. N., Childers, M. K. Eccentric contractions induce rapid isometric torque drop in dystrophin-deficient dogs. Muscle Nerve. 42, 130-132 (2010).
- Allen, D. G. Eccentric muscle damage: mechanisms of early reduction of force. Acta Physiol Scand. 171, 311-319 (2001).
- Friden, J., Lieber, R. L. Eccentric exercise-induced injuries to contractile and cytoskeletal muscle fibre components. Acta Physiol Scand. 171, 321-326 (2001).
- Merkies, I. S., Faber, C. G. Outcome measures in Duchenne muscular dystrophy: are we ready for the new therapeutic era? Neuromuscul Disord. 19, 447-447 (2009).
- Nagaraju, K., Willmann, R. Developing standard procedures for murine and canine efficacy studies of DMD therapeutics: report of two expert workshops on "Pre-clinical testing for Duchenne dystrophy". Neuromuscul Disord. 19, 502-506 (2009).
- Proske, U., Allen, T. J. Damage to skeletal muscle from eccentric exercise. Exerc Sport Sci Rev. 33, 98-104 (2005).
- Warren, G. L., Lowe, D. A., Armstrong, R. B. Measurement tools used in the study of eccentric contraction-induced injury. Sports Med. 27, 43-59 (1999).
