Summary
Vi beskriver en minimalinvasiv och smärtfri metod för att mäta hundens styrka bakdelen muskler och muskler svar på upprepade excentriska kontraktioner.
Abstract
Vi beskriver en minimalinvasiv och reproducerbar metod för att mäta hund bäcken styrka lem muskler och muskler svar på upprepade excentriska kontraktioner. Bäcken delen av en sövda hunden är bunden i en stereotaktisk ram för att anpassa skenbenet i en rät vinkel till lårbenet. Självhäftande linda anbringar tassen på en pedal monterad på axeln av en servomotor för att mäta vridmoment. Perkutan nervstimulering aktiverar bäckenbotten lem musklerna i tassen att antingen push (förlänga) eller dra (flex) mot pedalen för att skapa isometriska moment. Perkutan tibia nervstimulering aktiverar tibiotarsal extensor muskler. Upprepade excentriska (förlängning) sammandragningar induceras i tibiotarsal flexor musklerna genom perkutan peroneusnerven stimulering. Den excentriska protokoll består av en inledande isometrisk kontraktion följt av en påtvingad sträcka som införts av servomotor. Rotationen förlänger effektivt musklerna medan det kontrakt, t.ex. en excentrisk kontraktion. Under stimulering flexor musklerna utsätts för en 800 ms isometrisk och 200 msek excentrisk kontraktion. Denna procedur upprepas var 5 sek. För att undvika trötthet, följande 4 min vila var 10 sammandragningar med totalt 30 utförda sammandragningar.
Protocol
1. Ställa upp för experimentet
- Ladda Dynamic Muscle Control (DMC) programvara.
- Starta fysiologi riggen efter tillverkarens anvisningar.
- Köra DMC-programvaran:
Det förutsätts att hårdvaran är ansluten till datorn som kör DMC programvara och att systemet är kalibrerat. Programmet kan ändras från tid till annan, och därför är instruktionerna nedan som är relevanta för den aktuella programvaruversionen som vi använder. När programmet öppnas, det är igång redan.
Användaren kan börja skriva ett protokoll i DMC (t.ex. för att stimulera vid 50 Hz för 1,5 s för att producera en isometrisk stelkramp) och protokollet kan sedan sparas för senare användning. Vi använder två standardprotokoll: (1) isometrisk kontraktion protokoll (t ex ryckningar eller stelkramp), och (2) excentrisk stretch-skada protokollet. Vi börjar med isometrisk kontraktion protokollet för rycka. För att optimera rycka, är Monitor utgången skärmen används, vridmoment som genereras under rycka kan observeras eftersom elektroderna flyttas. När den maximala muskelkontraktionssvar erhålls, är de data som samlas in genom att återvända till huvudskärmen (tryck på Fortsätt) och välja Begin och Klar. Filer sparas på Spara som popup-fönster. Med elektroderna kvar i samma position, är en stelkramp (50 Hz) sedan samlas in och sparas. När alla isometriska kontraktioner är klar kan den excentriska stretch-skada protokoll läsas in och köras. Eftersom det finns en serie av sammandragningar som ska utföras i detta protokoll (10 sammandragningar) på huvudskärmen Kör En knapp är vald för att avslöja Kör allt status. Nu när Begin väljs visas en Kör alla protokoll pop-up fönster som frågar för root-filnamnet och den katalog som filerna ska sparas. Starta sedan protokollet serien Test och Klar har valts att inleda excentriska protokollet. Filerna sparas automatiskt till den valda katalogen.
2. Placering av djuret i fysiologi riggen
- Djuromsorg och använda kommitté (ACUC) riktlinjer måste följas för alla som deltar i djurförsök.
- Bedöva hund med inhalationsanestesi (t.ex. isofluran) i enlighet med godkänt protokoll. Kontrollera blinkningsreflexsen att vara säker på att djuret är djupt sövd. CO 2 övervakning, pulsoximetri och temperatur bör övervakas noggrant under hela proceduren. Vi använder vanligtvis propofol för induktion följt av sevofluran för inhalationsanestesi.
- Raka håret runt laterala kväva (knä) där stimulerande elektroder placeras (dvs den laterala delen av extremiteten början på fibular huvudet till 2-3 cm distalt om trochanter major.
- Placera hund på fysiologi bordet i rygg VILA med bäckenet lem placeras så att lårbenet och skenbenet göra en rät vinkel, och skenbenet är parallell med bordsskivan. Antingen höger eller vänster lem kan testas.
- Innan fästa hund tass för att tvinga pedalen, kontrollera att försäkra att den kraft pedalen är tydlig och säker att rotera. Följ slår på förfarandet för fysiologi riggen och aktivera pedalen. Obs: kraften pedalen ska vara "hård" när användaren försöker att flytta den manuellt.
- Försiktigt resten hundens tass i fotpedalen, mäta och registrera längden på hundens tass från centrum rotationsaxeln till slutet av den laterala siffra.
- Säkra tass i fotpedalen med elastiska självhäftande linda.
3. Isometrisk rycka vridmoment (tibiotarsal flexion)
- Efter en säkerhetskontroll, anslut steril skärmad monopolär 24-gauge stimulerande elektroder på stimulans isoleringsanläggningen (SIU).
- Ställ in stimulatorn till: kontinuerlig pulsutgång vid 1 Hz (1 puls per sekund)
- Programvara inställningar: Ladda isometrisk kontraktion protokoll (på huvudskärmen välj Ladda Protocol). Kör En knapp ska synas bredvid Börja knappen. Detta säkerställer protokollet bara körs en gång.
- Med handskar på händerna, tvätta huden med alkohol, och palpera den gemensamma peroneusnerven precis distalt om laterala proximala fibula. Med ett finger som markerar området av nerv, försiktigt in katoden (svarta) elektroden under huden och bara utanför periostet. Elektroden bör placeras parallellt med ytan av huden på ett djup av ca 2 cm, tillräckligt för att förhindra att elektroden från att röra sig när handen tas bort.
- Placera anoden (röd) elektrod under huden, parallella och något distalt om katodelektrod. Båda elektroderna bör nu interna till den gemensamma peroneusnerven precis distalt om fibular huvudet.
- Aktivera stimulerasTor vid 1 Hz. Observera rycka svar på monitorn. Gör små justeringar i elektroden positioner för att få de största rycka amplitud möjligt. Elektroden bör tas bort helt och ersättas inom tre till fyra ½ cm steg parallellt med skenbenet för att hitta den största muskelkontraktionssvar. Detta är en kritisk komponent i förfarandet och stor försiktighet måste vidtas för att hitta den största svar.
- Spela in rycka svar genom att stänga Monitor utgången skärmen (tryck på Fortsätt), välj sedan Begin och Klar att samla in data. Spara filen med det önskade filnamnet i Spara som popup-fönster. Stäng av stimulatorn.
4. Isometrisk tetanic vridmoment (tibiotarsal flexion)
- Utan att flytta elektroderna, ändra stimulatorn inställningarna till 50 Hz för 1,5 sek och möjliggöra extern trigger funktion. Detta gör att stimulator som ska aktiveras av programvaran.
- Programvara inställningar: Samma isometrisk kontraktion protokollet används för att samla in tetanic svar som för rycka. Förutsatt att stimulerande elektroderna inte har flyttats, Begin och Klar är valda för att producera stelkramp. I isometrisk protokollet för att producera en stelkramp, är stimulatorn utlöses av programvara för att hålla rätt timing. Spara tetanic respons i Spara som popup-fönster.
5. Excentrisk protokoll
- Utan att flytta elektroderna, ändra stimulatorn inställningar: 50 Hz under 1 sek (100V) och aktivera den externa trigger funktion. Detta gör att stimulator som ska aktiveras av programvaran.
- Programvara inställningar: Ladda excentriska protokollet sträcka skada, ett kommando för att servomotorn att rotera 29 grader (30 grader är den högsta). Välj Kör alla. Välj Börja; ange namnet rotfilsystemet för den excentriska serie av filer och den mapp där de ska sparas. Välj Start protokoll serien Test och sedan Klar för att inleda protokollet.
- I detta protokoll stimulatorn är inställd på att utlösas av programvaran för att hålla rätt timing. Som svar på var excentrisk kontraktion visas på skärmen, sparas det automatiskt.
- En fyra minuters viloperiod följer varje uppsättning av tio excentriska kontraktioner.
- Samla totalt 30 excentriska kontraktioner (tre uppsättningar av tio sammandragningar, varje uppsättning åtskilda av en fyra minuters viloperiod).
6. Isometrisk rycka vridmoment (tibiotarsal förlängning)
- Upprepa rycka protokollet ovan, men placera elektroderna vinkelrätt mot huden och proximala till den ursprungliga elektrodplacering för flexion protokollet. Den tibia nerv stimuleras eftersom det kurser caudally och distalt inom gastrocnemious muskeln magar. Kopplade stimulerande och referens elektroder placeras djupt inne i muskulaturen stjärt och bara proximalt om kväva. Den ungefärliga punkt placering längs en linje som bisects i 90o vinkel som bildas av kväva (knä). Eftersom tibial nerven ligger djupare (och caudal) till den gemensamma peroneusnerven ska elektroderna placeras i flera områden för att få fram den optimala rycka potential. Detta är en kritisk komponent i förfarandet. Obs: vridmoment tracings för tibiotarsal rycka och tetani visas inverterat förhållande till tibiotarsal flexion tracings.
7. Isometrisk tetanic vridmoment (tibiotarsal förlängning)
- Utan att flytta elektroderna, ändra stimulatorn inställningarna till 50 Hz för 1,5 sek och möjliggöra extern trigger funktion. Detta gör att stimulator som ska aktiveras av programvaran.
- Programvara inställningar: 50 Hz för 1,5 sek och möjliggöra extern trigger funktion. Detta gör att stimulator som ska aktiveras av programvaran.
- Programvara inställningar: Samma isometrisk kontraktion protokoll som används för stelkramp som för rycka. Förutsatt att stimulerande elektroderna inte har flyttats, Begin och Klar är valda för att producera stelkramp.
- I isometrisk protokollet för att producera en stelkramp, är stimulatorn utlöses av programvara för att hålla rätt timing. Spara tetanic svaret i popup Spara fil fönster.
8. Dataanalys
- Dynamisk muskel analys (DMA) program (Aurora Scientific) används för att få vridmoment och temporal information som samlats in från rycka, tetanic och excentriska kontraktioner.
- Köra DMA programmet: Programmet kan ändras från tid till annan, och därför är instruktionerna nedan som är relevanta för den aktuella programvaruversionen som vi använder. När DMA-programvaran öppnas den inte är igång. För att aktivera programmet, välj den vita pilen i det övre vänstra hörnet. DMA mjukvaran har ett antal funktioner, men för vårt syftes, kommer endast ett fåtal relevanta funktioner beskrivas.
Ladda en fil för att analysera:? Den Ladda om senaste datafil eller ny datafil pop-up fönster visas när DMA-programmet startas. Välj Ny, i nästa fönster väljer Labview, i nästa fönster väljer du lämplig mapp och fil, välj Öppna. Välj Ta bort filter Plot för att ta bort det här fönstret. Skriv in ett filter frekvensen i gränsfrekvens rutan. Optimal filter frekvens måste bestämmas utifrån de specifika uppgifter som ska bedömas. Som ett exempel använder vi 30 Hz för våra isometrisk svar och 10 Hz för det excentriska svar. Välj alternativet Använd filtrerade data-knappen. Under Välj Rita Data, välj Filtrerad Force. Använd de två glidskenorna i botten för att expandera visa och gå igenom filen. - Twitch analys (Fig. 1): Förutsatt att filen är laddad och ovanstående steg är klara, ställ position markörer: Det finns 3 markörer: (1) blå (2) gul och (3) vitt. För isometriska ryckningar och tetani eller andra isometriska sammandragningar, är den blå satt till den punkt där vridmomentet ökar från vila vridmoment, den gula är placerad där vridmomentet återgår till vila vridmoment (dvs. efter den avkoppling fasen), den vita är bäst lämpad att höger om den gula markören (behövs ej). Markörerna är lätt flyttas med vänster knapp nedtryckt på musen och dra den markerade markören till önskad position.
Utföra analysen: När markören är placerad, markerar du Muscle Analys, sedan Visa resultat. På de analyserade Muscle Data Resultat pop-up fönster, finns ett antal variabler som visas som Max kraft, Baseline kraft, ½ avkoppling tid etc. Uppgifterna presenteras för moment svar som ligger mellan markörer 1 (blå) och 2 (gul ). Alla dessa variabler eller variabler kan loggas till en datafil, är dock att processen inte beskrivs häri. Om en datalogg inte är förberedd, skulle data skall registreras för hand. Välj Stäng fönstret för att återgå till huvudskärmen. Välj Avsluta programmet för att stänga DMA och välj sedan den vita pilen för att börja analysen av en ny fil. - Tetani analys (Fig. 2): samma steg som beskrivs ovan för att rycka.
- Excentrisk analys (Fig. 3): Den excentriska analys kräver mer åtgärder för att ställa in och använder alla tre markörer. Om den excentriska moment svaret är negativt (dvs, vridmomentet tracings visas i nedåtgående riktning), kan det vändas genom att ange -1 i referensområdet (SQ cm) box (vridmoment är oförändrat) och välj inte normalisera, den knappen vänder för att indikera att data har normaliserats (i detta fall, inverterad). Ange önskad Cut off frekvens (t.ex. 10 Hz) och välj Använd ofiltrerade data för att vända den knappen för att använda filtrerade data, nu filtrerade data kommer att användas för analysen. Placera den blå markören på det ställe där isometrisk vridmoment börjar stiga från vila vridmoment, ställning den gula markören på det ställe där den excentriska sträcka moment börjar stiga från isometrisk platå (se figur nedan), den vita markören där vridmoment återgår till vila vridmoment. Välj Gör Muscle Analys, sedan Visa resultat. På de analyserade Muscle Data Resultat popup-fönster kan du välja den data mellan markörer 1 (blå) och 2 (gul) för den isometriska moment data, eller mellan markörer 2 (gul) och 3 (vit) för de excentriska moment data. Alla dessa variabler eller variabler kan loggas till en datafil, är dock att processen inte beskrivs häri. Om en datalogg inte är förberedd, skulle data skall registreras för hand. Välj Stäng fönstret för att återgå till huvudskärmen. Välj Avsluta programmet för att stänga DMA och välj sedan den vita pilen för att börja analysen av en ny fil.
9. Representativa resultat
- Twitch vridmoment: tibia nervstimulering (1 Hz) aktiveras enstaka ryckningar i tibiotarsal extensor muskler (Fig. 1). Notera att Y-axeln visar "kraft", vridmoment (produkten av kraft och avstånd) beräknas av användaren. Vi mäter längden på tass (från rotationsaxeln till slutet av den laterala siffran). Denna längd är avståndet (hävarm) används för att bestämma vridmoment (Nm).
- Isometrisk tetanic vridmoment (tibiotarsal förlängning): tibia nervstimulering tetanized tibiotarsal extensor muskler (1,5 sek tåg av 50Hz pulser). Vi använde Dynamisk Muskel mjukvara kontroll dator (DMC, Aurora Scientific, Inc.) för att styra stimulering timing och att fånga vridmoment svar (Fig. 2).
- Excentrisk protokoll: Den excentriska kontraktioner genomfördes i tibiotarsal flexors. Perkutan peroneusnerven stimulation aktiveras en inledande isometrisk kontraktion följt av gemensam rotation orsakar förlängning av den aktiverade Flexor musklerna (excentrisk kontraktion, Fig. 3). 6
Figur 1. Placering av den blå (# 1), gul (# 2) och vit (# 3) markörer för att analysera en rycka. En representant skärmbild av DMA programvaran visas för tibiotarsal förlängning rycka i en frisk 13 kg hund. Observera att för senare analys av programvaran, är de data som exporteras till ett kalkylblad, och kraften utgång (på bilden som Force (g) kan omvandlas till vridmoment (Nm). Vridmoment beräknas med produkten av kraft och hävarmen avstånd (i det här avståndet = längden mätt från rotationsaxeln mot laterala siffran i tassen).
Figur 2. Placering av den blå (# 1), gul (# 2) och vit (# 3) markörer för att analysera en stelkramp. En representant skärmbild av DMA programvaran visas för tibiotarsal förlängning tetani, samma djur som visas i Fig. 1.
Figur 3. Placering av den blå (# 1), gul (# 2) och vit (# 3) markörer för att analysera en excentrisk stretch-skada kontraktion. En representant skärmbild av DMA programvaran visas för en excentrisk stretch-skada kontraktion i en frisk 13 kg hund. Den initiala platå (grön linje) illustrerar isometriska fasen av kontraktion. Den isometriska fasen följs av en excentrisk (sträcka) fasen vilket illustreras av den snabba topp i den gröna linjen. Upprepad excentriska kontraktioner resultera vanligtvis i en stadig nedgång i isometrisk vridmoment.
Discussion
Det här protokollet används för att bedöma stor funktion djur muskel in vivo för att analysera, dokumentera och bedöma effekten av behandling ingrepp eller att dokumentera den biologiska funktioner för sjukdomsprogression. 1-6 Animal positionering, lem placering och elektrodplacering är viktiga variabler som väsentligt påverkar resultat. I en förstudie, menar alveolära koncentration (MAC) värden för isofluran påverkade inte signifikant kraft mätningar (Schueler RO, Koch H, Kornegay JN, opublicerade data, 1993). Hårdvara och mjukvara är kommersiellt tillgängliga och metoder väl etablerade. 7, 1,2,8,4,9-11,6,12 Vi rekommenderar att användare skaffar och använder den programvara och utrustning som beskrivs ovan vid tillämpningen av detta protokoll.
Ändringar: begränsningarna i det nuvarande servomotor inkluderar kroppsmassa på ca 23 kg och tass längd 20cm. Observera att momentgräns är ~ 8 N-meter för momentomvandlare (modell 310LR) beskrivs här. Detta värde får överskridas med normala hundar i sex månader eller äldre. Eventuella ändringar till det nuvarande protokollet omfattar uppdatering av mjukvaran och för att öka vridmomentet utbudet av givaren. Aurora vetenskapliga tillverkar en anordning lem positionering för stora djur som kan ersätta de stereotaktisk ram som används i det nuvarande protokollet. Metoden har framgångsrikt använts för andra djurmodeller, även icke-mänskliga primater.
Disclosures
Produktionen av denna video-artikeln var sponsrad av Aurora Scientific, Inc.
Acknowledgments
National Institutes of Health (NIH), Joshua Fräse Foundation, muskeldystrofi Association (MDA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrodes | Teca | 25mmx26G | Disposable sterile monopolar needle electrodes |
| Stimulator | Grass Technologies | S88X | |
| Stimulus isolation unit | Grass Technologies | SIU-C | |
| Muscle lever system | Aurora Scientific | 310C-LR | Footplate option |
| Signal interface | Aurora Scientific | Series 604A | |
| Dynamic Muscle Control & Analysis Software | Aurora Scientific | Aurora Scientific | |
| PC/Monitor | Aurora Scientific | Windows XP computer | |
| Limb position device | Aurora Scientific | NA | Can be substituted for stereotactic frame |
| Table | Northstar Customs, LLC | NA | Custom made table |
| Flexible wrap for paw attachment to pedal | Andover | PetFlex(5cmx2m) | May be reused a time or two |
References
- Childers, M. K., Okamura, C. S., Bogan, D. J., Bogan, J. R., Petroski, G. F., McDonald, K., Kornegay, J. N. Eccentric contraction injury in dystrophic canine muscle. Arch Phys Med Rehabil. 83, 1572-1578 (2002).
- Childers, M. K., Okamura, C. S., Bogan, D. J., Bogan, J. R., Sullivan, M. J., Kornegay, J. N. Myofiber injury and regeneration in a canine homologue of Duchenne muscular dystrophy. Am J Phys Med Rehabil. 80, 175-181 (2001).
- MK, C. hilders, JT, S. taley, JN, K. ornegay, KS, M. cD. onald Skinned single fibers from normal and dystrophin-deficient dogs incur comparable stretch-induced force deficits. Muscle Nerve. 31, 768-771 (2005).
- Kornegay, J. N., Bogan, D. J., Bogan, J. R., Childers, M. K., Cundiff, D. D., Petroski, G. F., Schueler, R. O. Contraction force generated by tarsal joint flexion and extension in dogs with golden retriever muscular dystrophy. J Neurol Sci. 166, 115-121 (1999).
- Liu, J. M., Okamura, C. S., Bogan, D. J., Bogan, J. R., Childers, M. K., Kornegay, J. N. Effects of prednisone in canine muscular dystrophy. Muscle Nerve. 30, 767-773 (2004).
- Tegeler, C. J., Grange, R. W., Bogan, D. J., Markert, C. D., Case, D., Kornegay, J. N., Childers, M. K. Eccentric contractions induce rapid isometric torque drop in dystrophin-deficient dogs. Muscle Nerve. 42, 130-132 (2010).
- Allen, D. G. Eccentric muscle damage: mechanisms of early reduction of force. Acta Physiol Scand. 171, 311-319 (2001).
- Friden, J., Lieber, R. L. Eccentric exercise-induced injuries to contractile and cytoskeletal muscle fibre components. Acta Physiol Scand. 171, 321-326 (2001).
- Merkies, I. S., Faber, C. G. Outcome measures in Duchenne muscular dystrophy: are we ready for the new therapeutic era? Neuromuscul Disord. 19, 447-447 (2009).
- Nagaraju, K., Willmann, R. Developing standard procedures for murine and canine efficacy studies of DMD therapeutics: report of two expert workshops on "Pre-clinical testing for Duchenne dystrophy". Neuromuscul Disord. 19, 502-506 (2009).
- Proske, U., Allen, T. J. Damage to skeletal muscle from eccentric exercise. Exerc Sport Sci Rev. 33, 98-104 (2005).
- Warren, G. L., Lowe, D. A., Armstrong, R. B. Measurement tools used in the study of eccentric contraction-induced injury. Sports Med. 27, 43-59 (1999).
