Summary
इन विट्रो में मानव तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (hNSPCs) में हेरफेर करने की क्षमता के लिए उपचारात्मक उद्देश्यों के लिए सेल प्रत्यारोपण के रूप में उनकी उपयोगिता की जांच करने के लिए और मानव तंत्रिका विकास का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल मानव स्टेम सेल अनुसंधान की बढ़ती reproducibility की उम्मीद में संवर्धन और passaging hNSPCs की एक विधि प्रस्तुत करता है.
Abstract
इन विट्रो में मानव तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (hNSPCs) में हेरफेर करने की क्षमता उपचारात्मक उद्देश्यों के लिए सेल प्रत्यारोपण के रूप में उनकी उपयोगिता की जांच के रूप में अच्छी तरह के रूप में मानव तंत्रिका विकास और विकृति के कई मौलिक प्रक्रियाओं का पता लगाने का मतलब है प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल इस तकनीक के मानकीकरण और मानव स्टेम सेल अनुसंधान के reproducibility बढ़ाने की उम्मीद में संवर्धन और passaging hNSPCs की एक सरल विधि प्रस्तुत करता है. hNSPCs का उपयोग हम शव का प्रसव के बाद मस्तिष्क cortices से राष्ट्रीय मानव तंत्रिका स्टेम सेल संसाधन द्वारा अलग थे और बड़े के रूप में बोतल पर पक्षपाती संस्कृतियों fibronectin (Palmer एट अल, 2001.; Schwartz एट अल, 2003) के साथ लेपित. हम संस्कृति एक DMEM में हमारे hNSPCs: F12 सीरम मुक्त मीडिया EGF, FGF, और PDGF के साथ पूरक है और उन्हें बीतने 01:02 हर लगभग सात दिन. इन शर्तों का प्रयोग, संस्कृति में कोशिकाओं के बहुमत एक द्विध्रुवी आकारिकी बनाए रखने और undifferentiated तंत्रिका स्टेम सेल (जैसे nestin और Sox2 के रूप में) के मार्करों व्यक्त.
Protocol
नोट: हमारे hNSPCs की दिनचर्या संवर्धन के लिए, हम हर दूसरे दिन है और आमतौर पर उन्हें बीतने 01:02 मीडिया के 50-100% परिवर्तन एक सप्ताह में एक बार. F12 के आधार मीडिया: संस्कृति मीडिया 20% बिट 9500, 1X DMEM में एंटीबायोटिक / antimycotic, और वृद्धि कारक (EGF, FGF, और PDGF प्रत्येक 40 एनजी / एमएल) शामिल हैं.
लेपित फ्लास्क की तैयारी और अलग कक्ष
- Passaged कोशिकाओं, कोट 10 μg / 4 घंटे, या रात के लिए मिलीलीटर EMEM में मानव fibronectin के साथ T25 बोतल, 37 में एक ° सी टिशू कल्चर इनक्यूबेटर के लिए नई बोतल तैयार करते हैं. कोशिकाओं passaging पहले अधिकार, fibronectin समाधान निकालें और पीबीएस के साथ बोतल कुल्ला.
- नए fibronectin लेपित बोतल (ऐसी है कि प्रत्येक कुप्पी के लिए आधा मीडिया के अंतिम मात्रा "कंडीशन" मीडिया हो जाएगा) passaged जा कोशिकाओं से पुराने "कंडीशन" मीडिया स्थानांतरण. ये संवर्धन की स्थिति उनके undifferentiated राज्य में इन कोशिकाओं को रखने में मदद.
- एक बार मीडिया के सभी कोशिकाओं passaged हो से हटा दिया जाता है, कोशिकाओं एक बार कुल्ला पीबीएस के साथ. कोशिकाओं सूखी बाहर नहीं ख्याल रखना.
- कोशिकाओं (एक T25 फ्लास्क के लिए 1.0-1.5 मिली) पर सीधे सेल हदबंदी बफर (CDB) जोड़ें. कमरे के तापमान पर के बारे में 5 मिनट के लिए बफर में कोशिकाओं का सेते हैं. धीरे गति दोहन फ्लास्क मदद सेल टुकड़ी जाएगा.
Centrifuging, Resuspending, और चढ़ाना कक्ष
- फ्लास्क अलग कोशिकाओं के साथ (~ CDB 3X मात्रा का उपयोग करें): सीरम युक्त (F12 के साथ 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम DMEM) मीडिया जोड़ें. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब मीडिया और कोशिकाओं निकालें. फ्लास्क कुल्ला और अवशिष्ट कोशिकाओं ठीक ताजा सीरम युक्त मीडिया की एक छोटी मात्रा का उपयोग.
- 5 मिनट के लिए मीडिया और 1000 rpm (~ 200xg) में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
- सीरम युक्त मीडिया बंद सक्शन और ताजा संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं resuspend, ऊपर और नीचे pipetting एक सजातीय सेल निलंबन.
- 01:02 विभाजन के लिए प्रत्येक नए फ्लास्क में resuspended कोशिकाओं के आधा स्थानांतरण. फ्लास्क पर नए बीतने संख्या नोट करें.
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Discussion
हमने पाया है कि इस प्रोटोकॉल hNSPCs के विश्वसनीय संस्कृतियों प्रदान करता है. हमारी कोशिकाओं के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है कि वे काफी घने संस्कृतियों के रूप में रखा जाना और passaged कहना है कि कोशिकाओं को विरल हैं नहीं कर सकते की जरूरत है. हमारे हाथों में, विरल संस्कृतियों बहुत धीरे धीरे बढ़ने या पूरी तरह से विभाजित संघर्ष. इस कारण से, हम आम तौर पर हमारे 1:02 या 1:03 संस्कृतियों विभाजित है जब एक संस्कृति अत्यंत घने है. कोटिंग की सतह fibronectin साथ एक संस्कृति डिश महत्वपूर्ण है क्योंकि यह अच्छा सेल लगाव और प्रवास को बढ़ावा देता है, लेकिन, laminin के विपरीत, यह भी सेल हदबंदी बफर (CDB) का उपयोग परमिट के लिए कोशिकाओं को अलग. Laminin के लिए सेल अनुलग्नक बहुत मजबूत है और सेल टुकड़ी के लिए एक proteolytic एंजाइम (जैसे trypsin) के उपयोग की आवश्यकता है. गैर enzymatic CDB trypsin के बाद कोशिका की सतह प्रोटीन के proteolytic दरार समय पर hNSPCs में morphological परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं पसंद है. इसके अलावा, वातानुकूलित मीडिया में संवर्धन hNSCPs उनके undifferentiated राज्य में इन कोशिकाओं को बनाए रखने में मदद करता है.
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Acknowledgments
लेखकों आभार डॉ. फिलिप एच. Schwartz बच्चों के अस्पताल, उनके संवर्धन में hNSPCs और प्रारंभिक अनुदेश प्रदान करने के लिए ऑरेंज काउंटी अनुसंधान संस्थान में राष्ट्रीय मानव तंत्रिका स्टेम सेल संसाधन को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
