Summary
, In vitro olarak insan nöral kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) manipüle etme yeteneği, tedavi amaçlı hücre nakli olarak kendi programını araştırmak için insan sinir gelişimi ve keşfetmek için sağlar. Bu protokol, insan kök hücre araştırmalarının giderek tekrarlanabilirlik umuduyla kültür ve Pasajlanması hNSPCs bir yöntem sunmaktadır.
Abstract
In vitro insan sinir kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) manipüle etme yeteneği, tedavi amaçlı hücre nakli olarak kendi programını araştırmak için yanı sıra birçok temel insan sinir gelişimi ve patoloji süreçleri keşfetmek için bir araç sağlar. Bu protokol, bu tekniğin standartlaştırılması ve insan kök hücre araştırmalarının tekrarlanabilirlik artan umutlar, kültür ve Pasajlanması hNSPCs basit bir yöntem sunuyor. Kullandığımız hNSPCs Ulusal İnsan Nöral Kök Hücre Kaynağı kadavra postnatal beyin korteks izole ve şişeler yapışık kültürler fibronektin (Palmer ve ark, 2001; Schwartz ve ark, 2003) ile kaplı olarak yetiştirilir. Biz bir DMEM kültür bizim hNSPCs: F12 serum ücretsiz medya EGF, FGF ve PDGF ile desteklenmiş ve geçit onları 01:02 yaklaşık her yedi gün. Kültür hücrelerin çoğunluğunu kullanarak, bu koşulları, iki kutuplu bir morfoloji korumak ve farklılaşmamış nöral kök hücreler (örneğin nestin ve sox2) belirteçleri ifade.
Protocol
Not: Haftada bir kez, bizim hNSPCs rutin kültür için, biz her gün ve medya genellikle geçit 01:02 50-100% değişim . F12 baz medya: kültür ortamı% 20 BIT 9500 DMEM, 1X antibiyotik / antimikotik ve büyüme faktörleri (EGF, FGF ve PDGF her 40 ng / ml) içerir.
Kaplamalı Flask hazırlanması ve Hücreler Dissociating
- 37, 10 mikrogram / ml insan fibronektin gecede 4 saat, ya da için EMEM geçişli hücreler, mont T25 şişeler ° C doku kültürü inkübatör için yeni şişeler hazırlamak. Hücrelerin sağ Pasajlanması önce, fibronektin çözüm kaldırmak ve şişeler PBS ile yıkayın.
- Yeni fibronektin kaplı şişeler (her bir şişesi için medya yarısı son hacim "şartlı" medya olacağını gibi) geçişli hücreler eski "şartlı" medya aktarın. Bu kültür, bu hücreler kendi farklılaşmamış durumda tutmaya yardımcı.
- Bir kez tüm medya geçişli olması hücreleri kaldırılır, PBS ile bir kez hücreleri durulayın. Hücrelerin kurumasına değil dikkat edin.
- Hücre Ayrılma Tampon (CDB) hücreleri (T25 şişesi için 1.0-1.5 ml) üzerine doğrudan ekleyin. Oda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika boyunca tampon hücrelerin inkübe edin. Şişeyi hafifçe dokunarak hücre dekolmanı hız yardımcı olacaktır.
Santrifüj Resuspending ve Kaplama Hücreler
- Balona müstakil hücrelerin (CDB, yaklaşık 3X hacmi kullanın): serum içeren medya (F12 10 ile% ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu DMEM) ekleyin. 15 ml konik tüp medya ve hücreler çıkarın. Şişeyi çalkalayın ve kalan hücreleri kurtarmak için küçük bir hacim taze serum içeren medya kullanın.
- 5 dakika 1000 rpm (~ 200xg) medya ve hücreler santrifüjleyin.
- Serum içeren medya kapalı Emme ve homojen bir hücre süspansiyonu yapmak için yukarı ve aşağı pipetleme, taze kültür ortamı hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin.
- Yeniden süspanse hücrelerin yarısı 1:2 bölünmüş her yeni şişesi içine aktarın. Şişesi üzerinde yeni bir geçit numarasını not edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz bu protokolü hNSPCs güvenilir kültürleri sağlar bulduk. Bir kritik bir faktör hücreler için oldukça yoğun kültür olarak tutulacak ve hücrelerin seyrek olduğu noktaya geçişli olamaz ihtiyaç vardır. Bizim ellerde, seyrek kültürleri çok yavaş büyür ya da tamamen bölen ateşkes. Bu nedenle, bir kültürün son derece yoğun olduğu için, genellikle kültürler 1:2 veya 01:03 bölünmüş. Iyi hücre eki ve göç teşvik eden, ancak, laminin aksine, aynı zamanda hücreleri ayırmak için Hücre Ayrılma Tampon (CDB) kullanılmasına izin verir bu yana, fibronektin bir kültür çanağı Kaplama yüzey önemlidir. Hücre eklenti laminin için çok güçlü ve hücre ayrılması için bir proteolitik enzim (örneğin tripsin) kullanımını gerektirir. Non-enzimatik CDB, hücre yüzey proteinleri proteolitik bölünme zamanla hNSPCs morfolojik değişikliklere yol açabilir beri tripsin için tercih edilir. Ayrıca, klimalı medya kültür hNSCPs, bu hücrelerin kendi farklılaşmamış devlet korunmasına yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar, minnetle, Çocuk Hastanesi, kendi kültür hNSPCs ve ilk öğretim sağlamak için Orange County Araştırma Enstitüsü Ulusal İnsan Nöral Kök Hücre Kaynağı Dr. Philip H. Schwartz kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
