Summary
De mogelijkheid om menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) te manipuleren in vitro het mogelijk maakt om hun bruikbaarheid te onderzoeken als cel transplantatie voor therapeutische doeleinden en voor de menselijke ontwikkeling van het zenuwstelsel te verkennen. Dit protocol bevat een methode voor het kweken en de passage hNSPCs in de hoop van de toenemende reproduceerbaarheid van het menselijk stamcelonderzoek.
Abstract
De mogelijkheid om menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) te manipuleren in vitro biedt een middel om hun bruikbaarheid te onderzoeken als cel transplantatie voor therapeutische doeleinden, alsmede voor vele fundamentele processen van de menselijke neurale ontwikkeling en pathologie te verkennen. Dit protocol biedt een eenvoudige methode van het kweken en de passage hNSPCs in de hoop de standaardisering van deze techniek en het vergroten van de reproduceerbaarheid van het menselijk stamcelonderzoek. De hNSPCs we gebruiken werden geïsoleerd uit dode postnatale hersenen cortex door de Nationale menselijke neurale stamcellen Resource en gegroeid als aanhanger culturen op flessen bekleed met fibronectine (Palmer et al., 2001;.. Schwartz et al., 2003). We cultuur onze hNSPCs in een DMEM: F12 serum-vrij medium aangevuld met EGF, FGF, en PDGF en passage hen 01u02 ongeveer om de zeven dagen. Met behulp van deze voorwaarden, de meerderheid van de cellen in de cultuur te behouden een bipolaire morfologie en uitdrukkelijke markers van ongedifferentieerde neurale stamcellen (zoals Nestin en Sox2).
Protocol
Opmerking: Voor routine kweken van onze hNSPCs, veranderen we 50-100% van de media om de andere dag en meestal passage hen 01u02 een keer per week. De cultuur media bevat 20% BIT-9500, 1X antibiotica / antimycotica, en groeifactoren (EGF, FGF, PDGF en elk bij 40 ng / ml) in DMEM: F12 base media.
De voorbereiding van de Coated kolf en Dissociatie de Cellen
- Om nieuwe kolven voor te bereiden op de passage cellen, jas T25 flessen met 10 ug / ml humaan fibronectine in EMEM gedurende 4 uur of 's nachts, in een 37 ° C weefselkweek incubator. Vlak voor passage van de cellen, verwijder de fibronectine-oplossing en spoel de kolven met PBS.
- Breng de oude "geconditioneerde" media uit de cellen te worden gepasseerd om de nieuwe fibronectine gecoate kolven (zoals dat de helft van het uiteindelijke volume van de media voor elke kolf zal de "geconditioneerde" media). Deze kweekomstandigheden helpen om deze cellen in hun ongedifferentieerde toestand.
- Wanneer alle van de media wordt verwijderd uit de cellen te worden gepasseerd, zodra spoel de cellen met PBS. Zorg ervoor dat niet uitdrogen van de cellen.
- Voeg Cell Dissociatie Buffer (CDB) direct op de cellen (1,0-1,5 ml voor een T25 fles). Incubeer cellen in de buffer voor ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur. Voorzichtig tikken de kolf zal helpen versnellen cel onthechting.
Centrifugeren, mengen, en Plating Cellen
- Voeg serum-bevattende media (DMEM: F12 met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum) (gebruik ~ 3X het volume van de CDB) om de kolf met vrijstaande cellen. Verwijder de media en cellen om een 15 ml conische buis. Gebruik een kleine hoeveelheid verse serum-bevattende media om de af te spoelen en de resterende cellen herstellen.
- Centrifugeer de media en de cellen bij 1000 rpm (~ 200xg) gedurende 5 minuten.
- Zuig-off van de serum-bevattende media en resuspendeer de cellen in verse cultuur media, en neer te pipetteren om een homogene celsuspensie te maken.
- Overdracht de helft van de geresuspendeerde cellen in elke nieuwe kolf voor een 1:2 splitsing. Let op de nieuwe passage nummer op de kolf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben ontdekt dat dit protocol een betrouwbare culturen van hNSPCs biedt. Een kritische factor voor onze cellen is dat ze moeten worden gehouden als tamelijk dicht culturen en kan niet worden gepasseerd om het punt dat de cellen schaars zijn. In onze handen, dun culturen groeien heel langzaam of helemaal niet meer te delen. Om deze reden hebben we doorgaans verdeeld onze culturen 1:2 of 1:3 als een cultuur is zeer dicht. Coating het oppervlak van een cultuur schotel met fibronectine is belangrijk, want het bevordert een goede celhechting en migratie, maar in tegenstelling tot laminine, maar ook maakt het gebruik van Cell Dissociation Buffer (CDB) op los cellen. Cel gehechtheid aan laminine is te sterk en vereist het gebruik van een proteolytisch enzym (bijv. trypsine) voor cel-onthechting. Niet-enzymatische CDB is de voorkeur om trypsine sinds proteolytische splitsing van de cel-oppervlakte-eiwitten kan leiden tot morfologische veranderingen in hNSPCs loop van de tijd. Ook kweken hNSCPs in geconditioneerde media helpt om deze cellen in hun ongedifferentieerde toestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs dankbaar erkennen dr. Philip H. Schwartz van de National Human Resource Neural Stamcel op het Children's Hospital, Orange County Research Instituut voor het verstrekken van hNSPCs en de eerste instructie in hun kweken.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
