Summary
القدرة على التعامل مع الإنسان الجذعية العصبية / السلائف الخلايا (hNSPCs) في المختبر يسمح للتحقيق في فائدتها وزرع الخلايا لأغراض علاجية واستكشاف التنمية العصبية البشرية. هذا البروتوكول يمثل طريقة زراعة وhNSPCs الركض وتأمل في زيادة استنساخ الإنسان من أبحاث الخلايا الجذعية.
Abstract
القدرة على التعامل مع الإنسان الجذعية العصبية / السلائف الخلايا (hNSPCs) في المختبر يوفر وسيلة لتحقيق فائدتها وزرع الخلايا لأغراض علاجية وكذلك لاستكشاف العديد من العمليات الأساسية للتنمية البشرية وعلم الأمراض العصبية. هذا البروتوكول يمثل طريقة بسيطة للزراعة وhNSPCs الركض وتأمل في توحيد هذه التقنية وزيادة استنساخ الإنسان من أبحاث الخلايا الجذعية. وقد عزل hNSPCs نستخدمها من جثي قشرات الدماغ بعد الولادة من قبل الإنسان الجذعية العصبية الوطنية الموارد ونمت الخلايا والثقافات ملتصقة على قوارير مغلفة مع فبرونيكتين (بالمر وآخرون ، 2001 ؛. شوارتز وآخرون ، 2003). نحن ثقافتنا hNSPCs في DMEM : F12 المصل خالية من وسائل الإعلام تستكمل مع EGF ، جمعية جيل المستقبل ، ولهم والمرور PDGF 01:02 تقريبا كل سبعة أيام. باستخدام هذه الظروف ، فإن الغالبية العظمى من الخلايا في ثقافة الحفاظ على التشكل الثنائي القطب وأعرب عن علامات المفاضلة الخلايا الجذعية العصبية (مثل nestin وsox2).
Protocol
ملاحظة : للحصول على زراعة الروتيني للhNSPCs دينا ، ونحن تغيير 5-10 ٪ من وسائل الإعلام كل يوم والمرور عليها عادة 1:02 مرة في الأسبوع. وسائل الإعلام على الثقافة بت 9500 بنسبة 20 ٪ ، 1X عوامل المضادات الحيوية / مضاد فطري ، والنمو (EGF ، جمعية جيل المستقبل ، ولكل PDGF في 40 نانوغرام / مل) في DMEM : وسائل الإعلام قاعدة F12.
إعداد قارورة المغلفة وعدم الربط بين الخلايا
- لإعداد قوارير جديدة للخلايا passaged ، ومعطف T25 القوارير مع 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين الإنسان في EMEM لمدة 4 ساعات ، أو بين عشية وضحاها ، في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة. الحق قبل الركض الخلايا ، وإزالة الحل فبرونيكتين وشطف القوارير مع برنامج تلفزيوني.
- نقل "مشروطة" القديمة وسائل الاعلام من الخلايا لتكون passaged إلى قوارير فبرونيكتين المغلفة الجديدة (مثل أن نصف الحجم النهائي من وسائل الإعلام عن كل قارورة ستكون "مشروطة" وسائل الاعلام). هذه الظروف تساعد على الحفاظ على زراعة هذه الخلايا في حالتها غير متمايزة.
- بمجرد إزالة كافة وسائل الإعلام من الخلايا لتكون passaged ، شطف خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. الحرص على ألا تجف الخلايا.
- إضافة خلية التفكك الاحتياطي (المصرف) مباشرة على الخلايا (1،0-1،5 مل دورق T25). احتضان خلايا في المنطقة العازلة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. سوف التنصت بلطف القارورة تساعد في تسريع مفرزة الخلية.
الطرد المركزي ، إعادة التعليق ، وخلايا التصفيحات
- إضافة مصل المحتوية على وسائل الإعلام (DMEM : F12 مع 10 ٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني) (~ 3X استخدام حجم CDB) إلى القارورة مع خلايا منفصلة. وسائل الإعلام وإزالة الخلايا المخروطية أنبوب 15 مل. استخدام كمية صغيرة من وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل جديد لشطف القارورة واستعادة الخلايا المتبقية.
- وسائل الإعلام وأجهزة الطرد المركزي في الخلايا دورة في الدقيقة 1000 (~ 200xg) لمدة 5 دقائق.
- شفط خارج وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل وresuspend الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة جديدة ، pipetting صعودا ونزولا لجعل التعليق خلية متجانسة.
- نقل نصف الخلايا معلق في كل قارورة جديدة لتقسيم 1:2. لاحظ عدد مرور جديدة على القارورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد وجدنا أن هذا البروتوكول يتيح الثقافات موثوق hNSPCs. أحد العوامل الحاسمة لخلايانا هو أنها تحتاج إلى أن تبقى ، لأن الحضارات كثيفة الى حد ما ولا يمكن passaged إلى النقطة التي كانت الخلايا متفرق. في أيدينا ، والثقافات متفرق تنمو ببطء شديد أو الكف تماما عن الانقسام. لهذا السبب ، فإننا عادة تقسيم ثقافاتنا 01:02 أو 01:03 عندما ثقافة كثيفة للغاية. طلاء سطح الطبق الثقافة مع فبرونيكتين مهم لأنه يعزز جيدة مرفق الخلية والهجرة ، ولكن ، على عكس laminin ، فإنه يسمح أيضا باستخدام خلية التفكك الاحتياطي (المصرف) لفصل الخلايا. مرفق الخلية لlaminin قوية للغاية وتتطلب استخدام انزيم بروتين (مثل التربسين) لمفرزة الخلية. ويفضل عدم الأنزيمية CDB إلى التربسين منذ انشقاق بروتين سطح الخلية من البروتينات قد يؤدي إلى تغييرات شكلية في hNSPCs مع مرور الوقت. أيضا ، hNSCPs زراعة في وسائل الإعلام مكيفة يساعد في الحفاظ على هذه الخلايا في حالتها غير متمايزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الكتاب الامتنان الدكتور فيليب H. شوارتز من العصبية الوطنية الجذعية البشرية الموارد خلية في مستشفى للأطفال ، أورانج كاونتي معهد البحوث لتوفير التعليم الأولي وhNSPCs في زراعة بهم.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
