Summary
היכולת לתפעל האדם גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs) במבחנה מאפשרת לחקור את השירות שלהם, כמו השתלות תאים למטרות טיפוליות לחקור ההתפתחות העצבית האנושית. פרוטוקול זה מציג שיטה culturing ו hNSPCs passaging בתקווה reproducibility גדל והולך של מחקרים תא גזע אנושיים.
Abstract
היכולת לתפעל האדם גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs) במבחנה מספק אמצעי לחקור את השירות שלהם, כמו השתלות תאים למטרות טיפוליות, כמו גם לחקור תהליכים בסיסיים רבים של ההתפתחות העצבית הפתולוגיה האנושית. פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה של culturing ו hNSPCs passaging בתקווה סטנדרטיזציה בטכניקה זו והגדלת reproducibility המחקר תא גזע אנושיים. HNSPCs אנו משתמשים נותקו מן cadaveric בקורטקס המוח לאחר הלידה על ידי משאב לאומי אנוש עצבית לתאי גזע גדל כמו תרבויות חסיד על צלוחיות מצופה פיברונקטין (פאלמר et al, 2001;.. שוורץ et al, 2003). אנחנו תרבות hNSPCs שלנו DMEM: F12 סרום ללא מדיה בתוספת EGF, FGF ו PDGF ומעבר להם 01:02 בערך כל שבעה ימים. שימוש בתנאים אלה, רוב התאים בתרבות לשמור על מורפולוגיה דו קוטבית להביע סמנים של מובחן בתאי גזע עצביים (כגון nestin ו Sox2).
Protocol
הערה: לקבלת culturing שגרתית של hNSPCs שלנו, אנו משנים 50-100% של התקשורת בכל יום אחר, ובדרך כלל מעבר להם 01:02 פעם בשבוע. תרבות התקשורת מכיל סיביות 9500 20%, 1X גורמים אנטיביוטי / antimycotic, וצמיחה (EGF, FGF, ואת כל PDGF ב 40 ng / ml) ב DMEM: F12 התקשורת הבסיס.
הכנת Flask מצופה dissociating תאים
- כדי להכין צלוחיות חדש עבור התאים passaged, מעיל T25 צלוחיות עם 10 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין האדם EMEM במשך 4 שעות או לילה, בתוך 37 ° C רקמות התרבות בחממה. ממש לפני passaging התאים, להסיר את הפתרון פיברונקטין ולשטוף את צלוחיות עם PBS.
- מעבירים את הישן "מותנית" התקשורת מתאי להיות passaged את פיברונקטין מצופה צלוחיות חדשים (כגון כי במחצית נפח הסופי של המדיה עבור כל בקבוק יהיה "מותנה" התקשורת). אלה התנאים culturing לסייע לשמור על התאים האלה במצב מובחן שלהם.
- לאחר שכל התקשורת היא להסיר את התאים להיות passaged, יש לשטוף את התאים פעם עם PBS. שימו לב שלא לייבש את התאים.
- הוספת תא דיסוציאציה הצפת (CDB) ישירות על גבי התאים (1.0-1.5 מ"ל עבור בקבוק T25). דגירה תאים למאגר כ -5 דקות בטמפרטורת החדר. בעדינות את הבקבוק הקשה תסייע להאיץ את ניתוק התא.
Centrifuging, Resuspending, ותאי ציפוי
- הוסף סרום המכיל מדיה (DMEM: F12 עם 10% חום מומת בסרום שור עוברי) (להשתמש ~ נפח 3X של CDB) כדי הבקבוק עם תאים מנותקת. הסר את המדיה התאים צינור חרוטי 15 מ"ל. השתמש נפח קטן של סרום המכיל התקשורת טרי לשטוף את הבקבוק ולשחזר תאים שיורית.
- צנטריפוגה התקשורת תאים ב 1000 סל"ד (~ 200xg) במשך 5 דקות.
- יניקה מעל סרום המכיל מדיה resuspend התאים בתקשורת תרבות טריים, pipetting מעלה ומטה כדי ליצור השעיה תא הומוגנית.
- העברת מחצית התאים resuspended לתוך בקבוק אחד חדש לפצל 01:02. שים לב למספר קטע חדש על הבקבוק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מצאנו כי פרוטוקול זה מספק אמין של תרבויות hNSPCs. גורם אחד קריטי עבור התאים שלנו היא שהם צריכים להיות כל הזמן כמו תרבויות צפוף למדי, ולא ניתן passaged עד כדי כך התאים דלילה. בידיים שלנו, תרבויות דליל לצמוח באיטיות רבה או לחלוטין הפסקת חלוקת. מסיבה זו, אנו בדרך כלל לפצל התרבויות שלנו 01:02 או 01:03, כאשר התרבות היא צפופה מאוד. את פני השטח של ציפוי צלחת תרבות עם פיברונקטין חשוב שכן הוא מקדם מצורף תא הגירה טוב, אבל, בניגוד laminin, הוא גם מאפשר את השימוש Cell דיסוציאציה חוצץ (CDB) לנתק את התאים. מצורף Cell כדי laminin חזק מדי ודורש את השימוש של אנזים פרוטאוליטי (למשל טריפסין) על ניתוק התא. Non-האנזימטית CDB הוא העדיף טריפסין מאז מחשוף פרוטאוליטי של חלבונים פני התא עלול להוביל שינויים מורפולוגיים hNSPCs לאורך זמן. כמו כן, hNSCPs culturing בתקשורת מותנה מסייע לשמור על התאים האלה במצב מובחן שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מודים בתודה ד"ר פיליפ שוורץ ח של המשאבים הלאומיים האדם עצבית לתאי גזע בבית החולים לילדים, אורנג' קאונטי מכון המחקר למתן hNSPCs והדרכה ראשונית culturing שלהם.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
